勵 炯，林偉杰，曹青文，金朦娜，邱紅鈺

（杭州市食品藥品檢驗研究院，浙江杭州310017）

非選擇性環(huán)氧化酶（COX）抑制藥物是屬于非甾體類抗炎藥物（Nonsteroidal Anti－Inflammatory Drugs，NSAIDs）中的一大類藥物，具有抗炎、止痛和解熱功能，臨床上主要應用于緩解肌肉、關節(jié)及炎癥免疫性疾病的局部疼痛、腫脹等治療［1－3］。由于非選擇性COX抑制藥物價格低廉、療效好，被廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)中，用于食源性動物的感染性炎癥的預防和治療［4］。近年來，非選擇性COX抑制藥物在禽畜類養(yǎng)殖業(yè)中有濫用的趨勢，而食用含有非選擇性COX抑制藥物殘留的肉類產品會對機體產生極大的副作用。歐盟已經規(guī)定了部分非選擇性COX抑制藥物的最大殘留量［5－7］。

水體中非選擇性COX抑制藥物的檢測研究已經有很多文獻報道［8－10］，但由于畜禽肉基質的復雜性，沒有檢測畜禽肉中較低含量非選擇性COX抑制藥物殘留的相關報道。復雜基質的樣品，比如土壤中非選擇性COX抑制藥物的檢測方法已有研究［11－14］，其前處理方法主要通過溶劑萃?。?5］、微波輔助提取［16］、超聲提?。?7］、加壓溶劑萃取［18］、QuEChERS法［19］等來提取非選擇性COX抑制藥物殘留。樣品經提取后，用一定填料的固相萃?。⊿PE）進行凈化處理。而檢測方法有氣－質（GC－MS）聯用法［20－21］、高效液相色譜法（HPLC）［22－23］以及液－質（HPLC－MS／MS）聯用法［24－26］。本文通過用微波輔助萃取，結合分散固相萃?。∕AE－DSPE），對畜禽肉中非選擇性COX抑制藥物殘留進行提取及凈化，采用兼顧靈敏度高及抗干擾性強的超高效液相色譜－串聯質譜法（UPLC－MS／MS），對畜禽肉中的7種非選擇性COX抑制藥物殘留進行定性定量分析。本法簡便、靈敏、高效，可滿足畜禽肉的質量監(jiān)測需求。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6425串聯四極桿質譜儀（美國，Agilent公司）；Mars 5高壓微波消解儀（美國，CEM公司）；MultiReax萃取儀（德國，Heidolph公司）；Mili－Q去離子水發(fā)生器（美國，Millipore公司）；MS3旋渦混合器（德國，IKA公司）。

標準品：水楊酸、布洛芬、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、吡羅昔康、萘普生和保泰松，均購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸銨、NaCl、無水MgSO4、無水Na2SO4、無水檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈、甲酸、乙酸乙酯、丙酮（色譜純，德國Merck公司）；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）和NH2－丙基乙二胺吸附劑（NH2－PSA）購自上海島津技術公司。

1．2 樣品前處理

1．2．1 提取 精密稱取5．0g豬肉，置于高壓微波消解罐中，加入85%乙腈水溶液（pH＝2）10mL，微波提取功率為400W，經8min溫度由室溫升至90℃，然后90℃保持15min進行提取，冷卻后置于50mL聚氟乙烯離心管中，加入6g無水 MgSO4，1．5g NaCl，1．5g無水檸檬酸鈉和0．75g檸檬酸氫二鈉，漩渦振蕩1min。將有機相層移入一新的50mL聚氟乙烯離心管中，待凈化。

1．2．2 凈化 在待凈化樣液中加入凈化劑（內含2 000mg無水 Na2SO4、500mg C18及300mg NH2－PSA），旋渦混勻1min，以4 000r／min的速度離心5min后，全部轉移至試管中，于40℃水浴下氮吹至近干。加入1mL含0．1%甲酸的水溶液－含0．1%甲酸的乙腈溶液（90∶10，V／V），旋渦混勻1min溶解殘渣，用0．22μm微孔有機濾膜過濾。

1．3 儀器條件

1．3．1 色譜條件 Waters CORTECS C18色譜柱（100×2．1mm，1．7μm）；流動相：A 相為含0．1%甲酸的水溶液，B相為含0．1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～8min，90%～45%A；8～9min，45%A；9．1～12min，90%A。柱溫：40℃；流速：0．4mL／min，進樣量1μL；運行時間：12min。

1．3．2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI＋和ESI－）；多反應監(jiān)測（MRM）模式；干燥氣溫度：200℃；干燥氣流速：14L／min；毛細管電壓：3．5kV；毛細管出口電壓（Fragmentor）：380V；校準方法：質量軸自動調諧校正；MRM 進行分段掃描：0～4．5min，水楊酸；4．5～6．0min，吡羅昔康；6．0～7．5min，萘普生；7．5～8．85min，吲哚美辛、雙氯芬酸鈉和布洛芬；8．85～12．0min，保泰松。其他質譜分析參數詳見表1。

表1 7種非選擇性COX抑制成分的質譜分析參數Table 1 MS parameters of 7non－selective cyclooxygenase inhibitors

2 結果與討論

2．1 質譜和色譜條件優(yōu)化

除了吡羅昔康和保泰松兩種成分在ESI＋模式下的靈敏度較ESI－模式高，其余5種非選擇性COX抑制劑在ESI－模式下靈敏度較高，在各自的模式下以m／z100～400掃描范圍下對7種目標物進行一級質譜掃描，得到精確的母離子質荷比，優(yōu)化毛細管電壓后，進一步對7種目標物的二級質譜參數進行優(yōu)化，詳細參數參見表1。其中布洛芬的碎片離子只有一個，所以本文采用一個離子通道對畜禽肉中的布洛芬進行檢測。

流動相中加入一定量的揮發(fā)性酸或者揮發(fā)性鹽，能夠增強目標化合物的離子化程度，而在ESI－模式下，流動相中加入一定量的甲酸可以提高分析物的靈敏度［25］。據此本文考察了以下三組流動相下的色譜行為：（1）A為含0．1%甲酸的水溶液，B為含0．1%甲酸的甲醇；（2）A為含0．1%甲酸的水溶液，B為0．1%甲酸的乙腈溶液；（3）A 為含0．1%甲酸的5mmol／L甲酸銨溶液，B為0．1%甲酸的乙腈溶液。結果發(fā)現將流動相（2）作為分析7種非選擇性COX抑制劑的流動相時，7種目標物峰形較好，靈敏度滿足要求。7種非選擇性COX抑制劑的MRM色譜圖見圖1。

2．2 提取方式的優(yōu)化

本文首先對提取溶劑進行考察，選用了三種常用的提取劑，包括乙腈、乙酸乙酯、丙酮進行回收率實驗，結果發(fā)現采用乙腈作為提取溶劑時7種目標化合物的回收率均達到80%以上，而采用乙酸乙酯和丙酮提取時，布洛芬和萘普生的回收率均低于20%。已有文獻報道采用微波輔助提取時，加入一定比例的水，有助于目標化合物的提取效率［11］。所以本文采用80%、85%、90%、95%、100%5組比例的乙腈水溶液進行回收率考察，結果發(fā)現當乙腈比例為85%時，7種目標化合物的回收率均高于80%，其余4組比例提取的布洛芬和萘普生的回收率普遍低于75%。除了有機溶劑類型和水的比例能影響目標化合物的提取效率，還有文獻報道提取溶劑中水的pH值也會影響回收率［12］，所以本文用1mol／L HCl調成4組不同的pH值（分別為2、3、4、5）的去離子水，配制成85%乙腈水溶液，結果當水的pH值為2時，7種目標化合物的回收率均最高，達到80%。所以本文采用85%乙腈水溶液（pH＝2）作為畜禽肉類中的7種非選擇性COX抑制藥物的殘留的提取溶劑。

同時我們對加入的提取鹽組分進行考察，采用4組比例：（1）6g無水 MgSO4＋1．5g NaAc；（2）4g無水 MgSO4＋1g NaCl；（3）6g無水 MgSO4＋1．5g NaCl＋1．5g無水檸檬酸鈉＋0．75g檸檬酸氫二鈉；（4）4g無水MgSO4＋1g NaCl＋1g無水檸檬酸鈉＋0．5g檸檬酸氫二鈉。結果發(fā)現加入第3組比例的7種目標物回收率最高，均高于80%，其余3組的雙氯芬酸鈉的回收率均低于70%。所以本文采用6g無水 MgSO4，1．5g NaCl，1．5g無水檸檬酸鈉和0．75g檸檬酸氫二鈉組成的4種鹽進行提取。

圖1 7種非選擇性COX抑制成分（20μg／L）的 MRM色譜圖Fig．1 MRM chromatograms of 7non－selective cyclooxygenase inhibitors（20μg／L）Peak identifications：1．salicylic acid；2．ibuprofen；3．naproxen；4．diclofenac sodium；5．phenylbutazone；6．piroxicam；7．indometacin．

2．3 凈化方式的優(yōu)化

本文同時考察了兩種常見的凈化方式，包括分散固相萃?。―SPE）和固相萃?。⊿PE）凈化。分散固相萃取凈化見1．2節(jié)，SPE采用Oasis HLB固相萃取柱進行回收率考察。結果發(fā)現當用Oasis HLB固相萃取柱進行凈化后，布洛芬和雙氯芬酸鈉的回收率均低于10%，所以本文采用DSPE凈化法，提取液中加入內含2 000mg無水Na2SO4、500mg C18及300mg NH2－PSA組成的凈化劑進行凈化，7種目標化合物回收率均高于80%。

2．4 線性關系與檢出限

采用豬肉空白基質配制10、20、50、80、100、200μg／L的基質標準系列溶液，以定量監(jiān)測離子對的離子流中譜峰峰面積（Y）為縱坐標，標準溶液濃度（X，μg／L）為橫坐標進行線性關系考察，結果見表2。7種非選擇性COX抑制劑在各自線性范圍內線性關系較好（r2均大于0．9965）。

取空白樣品（檢測結果為陰性的豬肉），加入適當稀釋的混合標準品溶液，按樣品制備方法制備供試品溶液，得信噪比為3和10時分別為7種非選擇性COX抑制劑的檢測限（LOD）與定量限（LOQ），結果見表2。

表2 7種非選擇性環(huán)氧化酶抑制劑的線性關系、檢測限和定量限Table 2 Regression equation，limits of detection and（LOD）and limits of quntifacation（LOQ）of 7non－selective cyclooxygenase inhibitors

2．5 方法回收率與精密度

取空白樣品（檢測結果為陰性的豬肉），分別在5、10、20μg／kg 3個添加水平下進行加標回收率實驗，平行6份，結果見表3。7種非選擇性COX抑制劑的三個濃度水平的平均回收率為81．3%～93．8%，相對偏差（RSD）為2．5%～7．6%。

表3 豬肉中7種非選擇性COX抑制劑的回收率與精密度試驗（n＝6）Table 3 The recoveries and precision of 7non－selective cyclooxygenase inhibitiors in pork（n＝6）

2．6 實際樣品檢測

利用本文建立的方法完成了50批次的畜禽肉產品（包括10批次豬肉，10批次牛肉，10批次羊肉，10批次雞肉，10批次鴨肉）中7種非選擇性COX抑制藥物殘留情況的檢測，其中一批次的豬肉中檢出布洛芬16μg／kg，一批次的牛肉檢出雙氯芬酸鈉12μg／kg，檢出樣品的MRM色譜圖詳見圖2。

圖2 陽性樣品的MRM色譜圖（A為豬肉，B為牛肉）Fig．2 MRM chromatograms of positive samples（A：pork；B：beef）

3 結論

本研究建立了微波輔助提?。稚⒐滔噍腿艋咝б合嗌V－串聯質譜法測定畜禽肉類產品中7種非選擇性COX抑制劑殘留的分析方法，優(yōu)化了儀器條件和樣品前處理條件。以85%乙腈水溶液（pH＝2）作為提取劑，經微波輔助提取，再加入6g無水 MgSO4，1．5g NaCl，1．5g無水檸檬酸鈉和0．75g檸檬酸氫二鈉組成的4種鹽進行提取，再使用2 000mg無水 Na2SO4、500mg C18以及300mg NH2－PSA組成的凈化劑進行凈化處理。本方法簡單、高效，有效地降低了基質效應，提高了分析方法的選擇性和靈敏度，為畜禽肉中7種非選擇性COX抑制藥物殘留的檢測提供了一種較好的方法