趙爽 謝青

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。國際消除HBV聯(lián)盟(ICE-HBV)是一個致力于加快開發(fā)治愈慢性乙型肝炎的專家聯(lián)盟。未來乙型肝炎治愈的研究將集中于發(fā)現(xiàn)干預(yù)策略，這種策略將永久減少具有復(fù)制能力的受感染細胞的數(shù)量或永久沉默這些細胞中共價閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸，并將刺激HBV特異性宿主免疫反應(yīng)，模擬HBV感染的自發(fā)緩解。還迫切需要建立標準化HBV試劑和方案，供全球所有HBV研究人員使用。

HBV是一個主要的全球公共衛(wèi)生威脅，全球超過2.57億人慢性感染；每年有超過88 7 000人死于HBV[1]。現(xiàn)有的治療方法可以抑制病毒復(fù)制，但不能治愈，主要是由于病毒共價閉合的環(huán)狀脫氧核糖核酸(cccDNA)轉(zhuǎn)錄模板在受感染肝細胞中的持續(xù)存在，以及慢性感染患者未能產(chǎn)生足夠強的、功能性和持續(xù)的免疫反應(yīng)來清除感染。因此，在大多數(shù)情況下，治療必須終生維持。

ICE-HBV是一個國際性的、獨立的、基于研究的論壇，成立于2016年，旨在加快HBV治愈的研究。該聯(lián)盟提出了一個戰(zhàn)略性和協(xié)作性的HBV研究議程，以推動發(fā)現(xiàn)一種安全、可支付、可推廣和有效的慢性乙型肝炎治愈方法，并在可預(yù)見的未來人人都能獲得。

一、慢性乙型肝炎與感染的緩解

急性和慢性乙型肝炎的自發(fā)緩解證明了HBV感染的免疫控制是可能的。然而，慢性感染或急性肝炎的臨床緩解并不意味著病毒的完全根除，因為少量的cccDNA陽性肝細胞可以在這些個體中持續(xù)存在，并且可能是免疫抑制過程中病毒重新激活的來源[2]。如果要制定從受感染細胞中消除或控制其表達的策略，就迫切需要我們提高對HBV cccDNA的生物發(fā)生和同源狀態(tài)的理解。

二、HBV治愈的定義

HBV治愈需要考慮治愈HBV感染和相關(guān)肝病，由此而變得復(fù)雜(圖1)。最近美國肝病研究協(xié)會和歐洲肝病研究協(xié)會聯(lián)合舉辦的HBV治療終點研討會進一步將完全治愈定義為血清中肝乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測不到，以及包括肝內(nèi)cccDNA和整合HBV基因在內(nèi)的HBV基因的根除[3]。功能性治愈被定義為血清中HBsAg和HBV DNA持續(xù)不可測(伴或不伴有抗-HBsb血清轉(zhuǎn)換)以及肝內(nèi)cccDNA和HBV基因整合量持續(xù)較低水平[3]。還提出了第三個定義：部分治愈，定義為在有限療程結(jié)束后血清中可檢測到HBsAg，但HBV DNA持續(xù)檢測不到[3]。由于目前不可能從每一個被感染的細胞中根除HBV cccDNA微染色體庫或整合的HBV DNA，但功能性治愈仍有可能實現(xiàn)，至少目前是這樣。我們認為慢性HBV感染的治愈性治療策略的理想目標應(yīng)該是誘導(dǎo)與急性或慢性乙型肝炎緩解控制的那樣得以緩解，只要這種方法是安全的。

圖1乙型肝炎病毒復(fù)制周期(摘自： Revill PA, et al. Lancet Gastroenterol Hepatol,2019,4: 545-558)

由于學(xué)術(shù)界和企業(yè)界努力確定病毒靶點來研發(fā)藥物，許多藥物正在臨床前模型中進行評估，或處于臨床開發(fā)的第一階段(圖2)。這些包括干擾病毒進入的藥物、靶向cccDNA或病毒核糖核酸的藥物或其他方法、新型聚合酶或核糖核酸酶H抑制劑、核心蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和衣殼組裝調(diào)節(jié)劑、干擾HBx功能的藥物、靶向病毒和HBsAg出口的藥物或影響病毒蛋白質(zhì)組的試劑。其中一些化合物看起來很有希望顯著降低HBV病毒載量或循環(huán)HBsAg，或兩者都有顯著降低，并促進抗-HBs的產(chǎn)生，但迄今為止似乎沒有一種化合物能夠治愈HBV感染。這些方法都不是直接針對HBV cccDNA庫，但是將這些方法結(jié)合起來進行評估，以確定它們在cccDNA清除動力學(xué)中的有效性或它們改善抗病毒免疫應(yīng)答恢復(fù)的能力將是很重要的。

圖2 當前和未來治療和治愈慢性乙型肝炎所需的HBV病毒學(xué)和免疫學(xué)靶標

乙型肝炎治愈的研究工作應(yīng)集中于減少每個細胞的cccDNA分子數(shù)量和含cccDNA的細胞數(shù)量，并誘導(dǎo)HBV特異性免疫應(yīng)答。為了實現(xiàn)HBV治愈的目標，ICE-HBV提出了兩種策略，即在不殺死被感染細胞的情況下治愈HBV感染和誘導(dǎo)免疫控制以安全消除被感染細胞。這些方法中的每一種都需要有統(tǒng)一協(xié)調(diào)的臨床研究來支持，以推進HBV治愈。下面詳細描述了這些策略，以及推進HBV治愈所必需的臨床方法。

三、乙型肝炎治愈的策略

(一)在不殺死被感染細胞的情況下治愈HBV感染 自從發(fā)現(xiàn)HBsAg以來，已經(jīng)過去了50多年。2012年HBV入胞受體NTCP的發(fā)現(xiàn)徹底改變了我們體外研究從感染到出胞的HBV復(fù)制周期的能力，必須解決我們對HBV復(fù)制周期和宿主免疫反應(yīng)的理解中的重要差距，從而利用復(fù)制周期中的漏洞來治愈感染。

靶向cccDNA微染色體庫，消除cccDNA將是治愈慢性HBV感染最直接和有效的策略。目前的抗病毒藥物不能消除cccDNA。細胞因子給藥，包括α-干擾素，可以誘導(dǎo)APOBEC依賴的病毒脫氧核糖核酸脫氨作用，這一觀察引起了關(guān)于這是否會導(dǎo)致受感染肝細胞中cccDNA顯著減少的熱烈討論[4]。直接靶向cccDNA的方法 (如CRISPR/Cas9或其他基因編輯方法) 在實驗室研究中已顯示出有希望的結(jié)果，但包括肝細胞遞送、非靶向效應(yīng),以及它們也切割染色體整合的HBV基因從而引發(fā)染色體重組的不可預(yù)測后果的可能性等問題需要仔細考慮。由于這些潛在的危險和困難，必須進一步探索針對病毒或宿主蛋白質(zhì)的方法，這些蛋白質(zhì)對cccDNA的形成、穩(wěn)定性和表達(如HBx)至關(guān)重要。對cccDNA產(chǎn)生、維持和周轉(zhuǎn)的基本生化、細胞和生理基礎(chǔ)的研究勢在必行，因為消除cccDNA是唯一有可能最終安全、持久地治愈HBV感染的策略。

由于在急性或慢性感染的自發(fā)或治療誘導(dǎo)的緩解控制過程中沒有完全根除cccDNA，因此在藥理學(xué)上不可能完全根除cccDNA。在大部分cccDNA被消除后，剩余的cccDNA池的轉(zhuǎn)錄沉默或者抗體介導(dǎo)的病毒從剩余的受感染細胞傳播的預(yù)防可能也是必要的。cccDNA表達的轉(zhuǎn)錄控制可以通過靶向HBx蛋白來實現(xiàn)，這對于cccDNA的表達或穩(wěn)定性至關(guān)重要。因此，必須更深入地了解HBx、HBc和其他病毒蛋白在控制cccDNA同源狀態(tài)中的作用。Smc5/6復(fù)合物是宿主限制因子，在缺乏HBx蛋白的情況下抑制cccDNA的表達[5]。最近發(fā)現(xiàn)，HBx通過劫持含有細胞DDB1的E3泛素連接酶以靶向Smc5/6復(fù)合體進行降解來促進cccDNA轉(zhuǎn)錄[5]。因此，針對HBx-DDB1結(jié)合相互作用的治療方法也值得研究。轉(zhuǎn)錄后控制cccDNA或整合的HBV基因表達可以使用核糖核酸干擾來實現(xiàn)；目前正在努力實現(xiàn)這一目標，并取得了可喜的成果。還迫切需要開發(fā)原位、單細胞、單分子、活細胞分析，以可視化cccDNA的定位和運輸，以及cccDNA依賴的替代報道細胞系統(tǒng)，用于高通量篩選cccDNA抑制劑。

(二)誘導(dǎo)免疫控制以安全消除HBV感染細胞 先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的復(fù)雜相互作用對病毒清除至關(guān)重要，這些應(yīng)答的失敗可能導(dǎo)致肝臟疾病。CD8+ T細胞是消除病毒的主要效應(yīng)細胞，通過細胞溶解和非細胞溶解效應(yīng)發(fā)揮功能。然而，保護性免疫需要足夠的CD4細胞活性和中和抗HBV包膜抗體的產(chǎn)生。研究者已做出重大努力，將急性感染HBV清除的有效綜合反應(yīng)與慢性乙型肝炎患者觀察到的免疫應(yīng)答失調(diào)進行比較。這些知識已帶來了第一代免疫療法，第二代治療性疫苗的開發(fā)也進入了I期和II期臨床試驗。

1．當前慢性HBV感染的免疫療法

在動物模型和HBV感染患者中進行的研究已經(jīng)確定了可以作為治療目標的免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵點。注射靶向Toll樣受體或RIG-1的配體可抑制HBV小鼠模型中的病毒復(fù)制。這一觀察結(jié)果導(dǎo)致了針對TLR-7[6]、TLR-8和RIG-1[7]的藥物開發(fā)，以用于慢性HBV感染患者。大量實驗表明，阻斷抑制受體可以增強HBV特異性T細胞在體外和體內(nèi)的擴增和功能。這推動了PD1/PDL1抗體在慢性HBV感染患者的I期研究中的應(yīng)用。此外，IL-12似乎對恢復(fù)慢性感染中的T細胞擴增和功能至關(guān)重要。因此IL-12和誘導(dǎo)它的佐劑被納入新一代慢性HBV治療性疫苗。

2．HBV介導(dǎo)的T細胞耗竭和恢復(fù)機制

HBV持久性與CD8+ T細胞耗竭(在較小程度上)和病毒逃逸有關(guān)。持續(xù)暴露于高抗原負荷和肝細胞抗原呈遞在CD8+ T細胞耗竭中起關(guān)鍵作用。抑制性受體(主要是PD-1)的表達、氨基酸(如精氨酸和色氨酸)的耗竭和線粒體的改變導(dǎo)致了T細胞功能障礙[8]。此外，CD4+ T細胞輔助活性、免疫抑制細胞因子、調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞、粒細胞髓源性抑制細胞和自然殺傷細胞的缺乏也導(dǎo)致CD8+ T細胞衰竭[9]。然而，這些不同機制對T細胞衰竭的相對貢獻還沒有很好的描述，應(yīng)該積極研究。此外，功能性T細胞修復(fù)是否可能，如果可能，HBV控制需要多少程度的T細胞修復(fù)，還沒有完全了解。了解這些內(nèi)容將可以完善我們恢復(fù)T細胞功能和改善免疫療法的目標。另外，需要更好地理解抑制受體(如PD-1、CTLA-4、Tim-3)在疾病不同階段的相對貢獻，以確定最有可能受益于檢查點阻斷療法的患者群體。

3．應(yīng)重視疾病自然史中的B細胞

抗HBV抗體被用作解決HBV感染的生物標志物，但B細胞和抗體對慢性HBV感染的自然史和解決方案的影響，或?qū)β訦BV感染血清轉(zhuǎn)換的影響尚未得到充分研究。B細胞可以產(chǎn)生免疫抑制性細胞因子IL-10，但它們的耗竭也可以導(dǎo)致已解決感染的患者和慢性乙型肝炎患者的臨床再激活。因此，需要解決與B細胞生物學(xué)、抗體特異性和中和反應(yīng)相關(guān)的基本問題，以便將B細胞更有效地納入新的免疫治療方法。

4．準確測量感染肝細胞的頻率

慢性HBV感染免疫療法的主要安全性問題是引發(fā)暴發(fā)性肝炎。因此，了解受感染肝細胞的實際數(shù)量、表達病毒抗原的肝細胞數(shù)量以及在個體患者中可被破壞而不會導(dǎo)致肝功能受損的肝細胞數(shù)量非常重要。在短期內(nèi)，需要更好的方法來定量活組織檢查或血清生物標志物中的感染肝細胞和整合肝細胞。能夠在醫(yī)學(xué)成像儀器上顯示受感染肝臟的體內(nèi)診斷將是一個理想的長期目標。

5．臨床試驗中免疫監(jiān)測技術(shù)的標準化

臨床試驗期間免疫監(jiān)測技術(shù)的標準化是一項巨大但必需的任務(wù)。為了提高不同位點之間免疫監(jiān)測的一致性，我們建議開發(fā)集中管理和廣泛可用的HBV肽庫和四聚體。與此相結(jié)合的是ELISPOT和流式細胞術(shù)染色的有效方案。這種方法將有助于促進持續(xù)的T細胞監(jiān)測。

6．免疫療法的未來

目前在第一階段試驗中測試的檢查點抑制劑恢復(fù)HBV特異性CD8+ T細胞功能的潛力為HBV免疫療法提供了一個有希望的前景。然而，在未來的試驗中，還需要解決一些重要的問題，如T細胞的修復(fù)程度、抗PD-1抗體的劑量、根據(jù)生物標志物或疾病階段選擇可能有反應(yīng)的患者，以及修復(fù)后的T細胞造成組織損傷的不良反應(yīng)風(fēng)險。在這種情況下，同樣重要的是確定聯(lián)合治療的療效。例如，不同抗病毒治療或治療性疫苗接種的檢查點抑制劑，這在臨床前動物模型中已被證明是有效的[10]。針對先天免疫的治療，用模式識別受體激動劑將抗病毒功效與炎癥分開可以提高它們的治療指數(shù)。除了完善免疫療法，推進抗病毒免疫工程的策略也有希望。T細胞受體和嵌合抗原受體基因療法規(guī)避了修復(fù)的需要[11]。然而，是否需要長期植入針對HBV的基因工程T細胞，以保持對從逃避清除的受感染細胞中傳播的病毒的控制，還有待解決。這些都是在聯(lián)合治療的背景下，應(yīng)考慮和研究的免疫治療策略?；诨パa作用機制合理配合使用抗病毒和免疫治療藥物，有望確保有效的抗病毒作用，消除感染肝細胞，提高HBV感染治愈率。

四、促進HBV感染治愈的綜合臨床研究

應(yīng)建立一個已經(jīng)獲得恢復(fù)的HBV感染患者血清樣本庫，包括HBsAg清除患者和免疫控制(抗-HBs)患者，并在緩解前提供適當?shù)钠ヅ鋵φ?，供全球研究人員使用。研究者還迫切需要類似于艾滋病毒領(lǐng)域的HBV相關(guān)材料的集中儲存庫，使HBV研究人員能夠方便地在全球范圍內(nèi)獲取。

五、結(jié)論

現(xiàn)在是為全球受HBV影響的2.57億人開發(fā)和實施一種安全、可支付、可廣泛獲得的慢性乙型肝炎治愈方法的時候了。針對cccDNA庫并以安全和持久的方式刺激宿主免疫反應(yīng)的新研究計劃必須成為研究人員、基金會和政府的高度優(yōu)先事項。應(yīng)竭盡全力支持美國國立衛(wèi)生研究院最近對HBV或艾滋病毒/HBV免疫學(xué)、病毒學(xué)和治療學(xué)項目的R01呼吁。ICE-HBV力求通過促進與研究人員(HBV領(lǐng)域內(nèi)外)、臨床醫(yī)生、制藥行業(yè)和一系列利益攸關(guān)方(包括受慢性乙型肝炎影響的社區(qū))的合作伙伴關(guān)系來實現(xiàn)其目標，在全球范圍內(nèi)努力發(fā)現(xiàn)、開發(fā)、測試和實施HBV治愈戰(zhàn)略，以幫助確保WHO到2030年消除HBV作為公共健康威脅的目標得以實現(xiàn)。