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2019-08-30 06:12:36王雅卉邢霽云徐婧婷郭順堂
食品科學(xué) 2019年15期
王雅卉，邢霽云，徐婧婷，郭順堂*
（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室，北京 100083）
大豆蛋白是優(yōu)質(zhì)蛋白[1]，是廣泛用于嬰兒配方食品等特殊膳食的配料[2-3]。熱處理是嬰兒食品加工過程中一種必要的單元操作，工業(yè)化生產(chǎn)中常采用120 ℃以上的高溫殺菌或降低植物蛋白中胰蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子活性。同時，熱處理能破壞蛋白分子緊密的四級結(jié)構(gòu)，顯著提高蛋白質(zhì)的消化性[4-5]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，某些高溫?zé)崽幚砘虿划敓崽幚頃档投诡惖鞍椎臓I養(yǎng)有效性[6-10]。例如，將菜豆的7S蛋白和蠶豆的11S蛋白在120 ℃條件下熱處理20 min后，置于大鼠小腸內(nèi)酶解1 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜豆的7S蛋白可以產(chǎn)生分子質(zhì)量約23.7 kDa的不可消化聚合物，蠶豆的11S蛋白則產(chǎn)生分子質(zhì)量約為20 kDa的疏水性不可消化聚合物[6-8]?？梢?，與一般熱處理不同，高溫?zé)崽幚硪鹆嗣附猱a(chǎn)物的聚合，從而有可能降低了豆類蛋白的營養(yǎng)有效性。然而，目前尚不明確高溫?zé)崽幚硎欠褚哺淖兞舜蠖沟鞍椎臓I養(yǎng)有效性。為此，本研究分析熱處理后大豆蛋白的氨基酸組成變化，評價熱處理后大豆蛋白中必需氨基酸的營養(yǎng)平衡情況，探討熱處理對大豆蛋白體外模擬消化物組分及分子質(zhì)量分布的影響，以期闡明高溫?zé)崽幚韺Υ蠖沟鞍紫玫男Ч瑸榇蠖沟鞍滋厥馍攀呈称芳庸さ臒崽幚砜刂铺峁﹨⒖肌?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
低溫脫脂豆粕 山松生物制品有限公司。
胃蛋白酶（P7000）、胰酶（P1750）、β-巰基乙醇、醋酸鈾染液、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、脲、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸銨、甘油、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、Tris Base、乙腈、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)、ZORBAX SB-C18色譜柱（分析柱） 美國Agilent公司；Protein Pak 60凝膠柱 美國Waters公司；DYY-6D穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀 北京六一儀器廠；Spectrum SP-2100UV紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 SPI的制備
將脫脂豆粕與水以液料比1∶15混合后，調(diào)節(jié)pH值為8.0，室溫攪拌90 min，兩層紗布過濾除去其中的不溶性雜質(zhì)后，接著1 000×g離心10 min得到濾液，將濾液用酸調(diào)整pH值至4.5，置于室溫靜置30 min。將濾液1 000×g離心5 min，去除上清液，沉淀即為大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）；將沉淀取出，加水復(fù)溶，不斷調(diào)整pH值至7.0，待完全溶解后，用液氮速凍后干燥，留樣備用[11-12]，樣品中的蛋白質(zhì)量分數(shù)約為92%。
取冷凍干燥后的SPI配制成質(zhì)量分數(shù)2%的SPI溶液，分別在100、120、140、160 ℃條件下油浴加熱20 min后，相應(yīng)記為SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160，冷凍干燥備用。
1.3.2 大豆蛋白氨基酸組成分析
采用氨基酸自動分析儀，分別對SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160樣品的氨基酸組成進行分析。
1.3.3 大豆蛋白氨基酸營養(yǎng)性評價
根據(jù)1.3.2節(jié)分析得到的SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160氨基酸組成，分別用氨基酸評分（amino acid score，AAS）、化學(xué)評分（chemical score，CS）、必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）、氨基酸比值系數(shù)分（score of ratio coefficient of amino acid，SRCAA）、必需氨基酸相對比值（essential amino acid relative ratio，EAARR）對不同加熱后的大豆蛋白氨基酸模式進行營養(yǎng)性評價。
AAS：用于評價待測蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸與參考蛋白模式中相應(yīng)必需氨基酸含量的接近程度[13]。如公式（1）所示計算。
其中，必需氨基酸中AAS數(shù)值最低者定義為AASmin，其AASmin就是該種蛋白質(zhì)的AAS值。
CS：評價待測蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸的相對含量（其含量與必需氨基酸總量之比）與參考蛋白模式中相應(yīng)必需氨基酸相對含量的接近程度（世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）/國際食品法典委員（Codex Alimentarius Commission，CAC））[14]，如公式（2）所示計算。
其中，必需氨基酸中CS數(shù)值最低者定義為CSmin，其CSmin就是該種蛋白質(zhì)的CS值。
EAAI：評價待測蛋白質(zhì)中所有必需氨基酸含量與參考蛋白模式中所有必需氨基酸含量比值的幾何平均數(shù)（以100 分計）[15]。如公式（3）所示計算。
式中：p為食物蛋白；s為參考蛋白；n為比較的必需氨基酸個數(shù)。
SRCAA：評價待測蛋白質(zhì)的必需氨基酸與參考蛋白模式中相應(yīng)必需氨基酸的接近程度[16]。先計算出各個氨基酸的比值（AAS），再算出各氨基酸比值的平均數(shù)。在此基礎(chǔ)上計算氨基酸比值系數(shù)（ratio coefficient of amino acid，RCAA）及SRCAA。具體公式如式（4）～（5）所示。
式中：CV為RCAA的變異系數(shù)，CV=標準差/平均數(shù)。
EAARR：評價標準值與各種必需氨基酸比值距離標準差的平均值之差[17]。如公式（6）所示計算。
式中：n為待測蛋白質(zhì)中必需氨基酸的個數(shù)。
1.3.4 嬰兒體外消化模型的建立
根據(jù)Marambe等[18]的方法，并略作改動。用pH 4的0.2%（質(zhì)量分數(shù)，下同）NaCl溶液配制成2.5%的胃蛋白酶溶液（胃液模擬溶液）；用pH 7的0.68% KH2PO4和0.062% NaOH混合溶液配制成0.5%胰酶溶液（腸液模擬溶液）。將SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160樣品的pH值調(diào)至4.0，在37 ℃水浴中平衡10 min后，按m（酶）∶m（底物）=1∶5的比例加入胃蛋白酶溶液，在37 ℃條件下分別消化0、1、10、30 min，再將各樣品的pH值調(diào)至7.0，在37 ℃水浴中平衡10 min，按m（酶）∶m（底物）=1∶40加入胰酶溶液，在37 ℃條件下消化30、60 min后分別取樣，作為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）的樣品。腸道消化時間為60 min時記為消化終點，將胃腸道酶解物冷凍干燥備用。
1.3.5 嬰兒體外模擬消化物的SDS-PAGE分析
SDS-PAGE參考Ren Chengang等[19]的方法，將一定量樣品（2～5 mg，以蛋白質(zhì)量計）加入1.5 mL離心管，加入0.5 mL的含有體積分數(shù)20%甘油、質(zhì)量分數(shù)0.2% SDS、0.063 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）的樣品處理液，再添加0.36 g脲和20 μL飽和溴酚藍溶液，加蒸餾水使總體積為1 mL，充分混合均勻，靜置過夜后進行SDS-PAGE。
采用Bio Craft Model BE-210N垂直平板電泳裝置，膠板厚度為1 mm。分離膠質(zhì)量分數(shù)為12.5%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)4%。電泳緩沖液含有5 mmol/L Tris、38.4 mmol/L甘氨酸和0.1% SDS。上樣量為5 μL。SDS-PAGE過程中，濃縮膠部分保持電流15 mA，進入分離膠后，電流為25 mA。
膠片用體積分數(shù)33%甲醇溶液和12%三氯乙酸固定液固定4 h，然后用考馬斯亮藍G-250染色液染色3～4 h。染色結(jié)束后，用蒸餾水對膠片進行脫色，直至底色基本脫除。
1.3.6 胃腸道酶解物分子質(zhì)量分布分析
采用體積排阻HPLC（size-exclusion HPLC，SE-HPLC）法分析胃腸道酶解物的分子質(zhì)量[20]。在待測樣品冷凍干燥粉中加入0.03 mol/L、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液，配制成5 mg/mL的樣品，采用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾后進樣。色譜條件如下：1100 HPLC系統(tǒng)，色譜柱為Protein Pak 60凝膠色譜柱（分離范圍1～20 kDa）；流動相：0.03 mol/L、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液；檢測波長為214 nm；流速為0.5 mL/min；上樣量為20 μL；檢測溫度為27 ℃。分子質(zhì)量校正曲線所用標準品為胰蛋白酶抑制劑（MW20 100 Da）、蛋清溶菌酶（MW14 400 Da）、AB2-80（MW7 823 Da）、AB2-81（MW5 856 Da）、AB2-95（MW3 313 Da），根據(jù)標準品分子質(zhì)量的對數(shù)與保留時間作回歸分析。再根據(jù)樣品的保留時間和回歸方程計算待測樣品的分子質(zhì)量。
1.3.7 蛋白分子質(zhì)量分布的測定
SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160分子質(zhì)量的測定采用SE-HPLC法[21]。待測樣品冷凍干燥粉溶于含有0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7）中，用直徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾后進樣。色譜條件為：1100 HPLC系統(tǒng)；色譜柱為TSK gel G4000SWXL凝膠色譜柱；流動相為0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L pH 7的磷酸鹽緩沖液；檢測波長280 nm；流速0.5 mL/min；上樣量20 μL；檢測溫度27 ℃。
1.3.8 可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的測定
配制質(zhì)量分數(shù)為2%的SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160樣品溶液，室溫下溶解60 min后，10 000×g離心10 min得到上清液，用Bradford法[22]測定上清液中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)。
1.3.9 色氨酸內(nèi)源熒光發(fā)射光譜分析
參照Shen Lan等[23]的方法并略作改進，用熒光光譜儀測定SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160樣品中的內(nèi)源（色氨酸）熒光發(fā)射光譜。待測樣品用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.80）溶解，控制蛋白質(zhì)量濃度在0.1～0.2 mg/mL。溶液在290 nm波長處激發(fā)，掃描300～420 nm的熒光發(fā)射光譜，狹縫寬度10 nm，掃描速率200 nm/min。
1.3.10 圓二色光譜分析
在MOS-450/AF-CD分光儀上收集樣品的圓二色光譜圖。所有樣品的蛋白質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL，在190～250 nm范圍內(nèi)掃描，選用1 mm長度的石英皿并用25 ℃的去離子水作空白，每個圓二色光譜掃描速率為30 nm/min，數(shù)據(jù)點的記錄間隔為1 nm，響應(yīng)時間為2 s。
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
所有實驗得到的數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析檢驗，顯著性水平為P＜0.05。每個樣品平行測定3 次，所有實驗重復(fù)兩次。
2 結(jié)果與分析
2.1 熱處理大豆蛋白的氨基酸組成分析及營養(yǎng)性評價
蛋白質(zhì)的氨基酸組成和含量影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)有效性。對不同溫度處理后大豆蛋白的氨基酸組成進行分析，結(jié)果如表1所示。
表1 不同溫度處理后大豆蛋白的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of soybean protein under different temperature treatments
與100 ℃熱處理相比，120 ℃熱處理對氨基酸組成及含量影響不大，但隨著熱處理溫度升高，大豆蛋白中的氨基酸存在不同程度的損失，其中，以胱氨酸損失最為嚴重。140、160 ℃的處理條件分別導(dǎo)致胱氨酸損失了30%、48%。這一結(jié)果與Bjarnason等[24]報道牛血清白蛋白在145 ℃加熱后胱氨酸大量損失的實驗結(jié)果相一致。當加熱溫度過高時，半胱氨酸、胱氨酸會發(fā)生脫硫反應(yīng)，產(chǎn)生不可逆的分解，形成硫化氫、二甲基硫化物、磺基丙氨酸等，造成氨基酸的嚴重破壞。
為進一步了解不同溫度熱處理后大豆蛋白中的必需氨基酸的營養(yǎng)平衡情況，本實驗采用蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價常用的5 種化學(xué)分析方法：AAS、CS、EAAI、EAARR、SRCAA，以WHO/CAC母乳蛋白氨基酸參考模式為評價標準，對不同熱處理后大豆蛋白的必需氨基酸進行模式評分計算，結(jié)果如表2所示。
無論是以WHO推薦的母乳氨基酸含量為評分標準還是以CAC推薦的母乳氨基酸含量為評分標準，不同溫度下加熱的大豆蛋白化學(xué)評分變化趨勢基本相同。與100 ℃的加熱處理相比，除了SRCAA外，120 ℃的熱處理會使得大豆蛋白的其他化學(xué)評分略有升高，即越接近母乳蛋白的必需氨基酸比例。然而，當進一步提高溫度至140、160 ℃時，大豆蛋白的所有化學(xué)評分均明顯下降，即140、160 ℃的熱處理導(dǎo)致大豆蛋白中必需氨基酸的比例或模式不適于嬰兒所需要的各種氨基酸的比例或模式要求，蛋白的營養(yǎng)有效性顯著下降。大豆蛋白氨基酸的比例模式變化是由于熱處理引起氨基酸的損失造成的。
表2 不同溫度處理后大豆蛋白的化學(xué)評分Table 2 Nutritional evaluation of soybean protein under different heat treatments
2.2 熱處理大豆蛋白體外模擬消化物SDS-PAGE結(jié)果分析
蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值不僅與蛋白質(zhì)本身的氨基酸含量有關(guān)，還取決于蛋白質(zhì)的可消化性、消化產(chǎn)物性質(zhì)及其在生物體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運過程。為了考察高溫?zé)崽幚泶蠖沟鞍左w外消化情況，本研究采用嬰兒體外模擬消化的方法，在不同溫度處理的大豆蛋白消化不同時間點取樣進行SDS-PAGE，通過觀測電泳條帶變化反映樣品的消化情況。如圖1所示，100 ℃熱處理的大豆蛋白在胃部消化30 min后，各個亞基條帶顏色逐漸變淺，其中，7Sβ亞基被消化酶酶解的速率高于α'和α亞基，11S A亞基的酶解速率高于β亞基。在胃部消化結(jié)束時，SPI的幾個主要亞基的條帶仍均有不同程度的保留。而進一步進入腸道消化后，仍然有略低于14 kDa的胃腸道酶解物大量存在。120 ℃熱處理后的大豆蛋白體外消化的SDS-PAGE圖譜與100 ℃加熱處理大豆蛋白的基本相似。
值得注意的是，140、160 ℃熱處理后的大豆蛋白SDS-PAGE圖譜中并未出現(xiàn)典型的大豆蛋白條帶（泳道2），α'、α、β亞基以及A亞基和B亞基條帶在SDS-PAGE圖譜上不清晰。據(jù)報道，當加熱溫度過高時，半胱氨酸、胱氨酸會發(fā)生脫硫反應(yīng)，肽鍵斷裂，形成硫化氫、二甲基硫化物、磺基丙氨酸等，造成氨基酸的嚴重破壞[25]。而在一個具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子中，由一條多肽鏈折疊成的三級結(jié)構(gòu)球蛋白才能稱為蛋白質(zhì)亞基。因此，本實驗中觀察到的140、160 ℃熱處理后大豆蛋白無明顯電泳條帶可能是由于高溫破壞了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)以及亞基的空間構(gòu)象。
圖1 熱處理大豆蛋白溶液嬰兒體外模擬消化的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE of soybean protein digested in simulated infant gastrointestinal tract
2.3 大豆蛋白胃腸道酶解物分子質(zhì)量分布分析結(jié)果
圖2 大豆蛋白體外模擬消化后的SE-HPLC圖譜Fig. 2 SE-HPLC profile of soybean protein after in vitro digestion
進一步對不同溫度處理的大豆蛋白胃腸道酶解物分子質(zhì)量分布進行分析。如圖2所示，100、120 ℃熱處理的大豆蛋白經(jīng)胃腸道酶解后得到的胃腸道酶解物的分子質(zhì)量分布沒有顯著性差異。然而，大豆蛋白經(jīng)140、160 ℃高溫處理后胃腸道酶解物的出峰時間較晚，分子質(zhì)量明顯降低。對樣品不同分子質(zhì)量組分所占比例進一步分析可以看出，隨著加熱溫度逐漸升高，尤其是將大豆蛋白加熱至140、160 ℃后，大分子質(zhì)量（MW＞15 kDa）的胃腸道酶解物所占比例顯著降低，低分子質(zhì)量尤其是1～10 kDa的胃腸道酶解物，所占比例顯著提高（表3）。
表3 大豆蛋白體外模擬消化后不同分子質(zhì)量組分所占比例Table 3 Ratios of fractions with different molecular masses in in vitro digested soybean protein
2.4 不同溫度加熱后大豆蛋白的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)和分子質(zhì)量分布結(jié)果
蛋白質(zhì)的聚集程度能影響蛋白質(zhì)與胃腸道消化酶的相互作用關(guān)系，進而影響蛋白質(zhì)的消化吸收[26-27]。大量研究表明，具有相同氨基酸組成的蛋白質(zhì)經(jīng)過不同方式處理后，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化是導(dǎo)致蛋白質(zhì)胃腸道酶解物性質(zhì)差異及消化性和營養(yǎng)性不同的主要原因[4-5,28]。本研究從蛋白聚集程度出發(fā)，分析蛋白質(zhì)可消化性與營養(yǎng)有效性的關(guān)系。
圖3 不同溫度加熱后大豆蛋白的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)Fig. 3 Soluble protein content of soybean protein under different heat treatments
如圖3所示，100、120 ℃熱處理的大豆蛋白可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)較低，分別約為77%、67%；而經(jīng)過更高溫度（140、160 ℃）熱處理后，溶液中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)升高。進一步對高溫?zé)崽幚泶蠖沟鞍椎姆肿淤|(zhì)量進行了分析。如圖4和表4所示，100 ℃熱處理后的大豆蛋白高分子化合物所占比例較高（洗脫時間約為13 min），低分子質(zhì)量化合物所占比例較低（洗脫時間約為26.5 min）。繼續(xù)提高加熱溫度，高分子質(zhì)量化合物所占的比例逐漸減小，低分子質(zhì)量的化合物所占比例逐漸增多。
圖4 不同溫度加熱后大豆蛋白的SE-HPLC圖譜Fig. 4 SE-HPLC profiles of soybean protein under different heat treatments
表4 大豆蛋白不同分子質(zhì)量組分所占比例Table 4 Ratios of fractions with different molecular masses in soybean protein under different heat treatments
然而，值得注意的是，本實驗中樣品首先需要通過0.45 μm的濾膜才能進一步進行SE-HPLC分析。前述的實驗已經(jīng)表明，120 ℃的熱處理使得可溶性蛋白含量明顯降低（圖3），因此，對于120 ℃熱處理后大豆蛋白SE-HPLC圖譜而言，分子質(zhì)量大于670 kDa的高分子聚合物含量明顯降低并不是由于樣品本身聚集程度減少造成的，而是由于在120 ℃熱處理的條件下，大豆蛋白更容易相互聚集，形成了更大的聚集體，但這些高分子聚合物不能透過0.45 μm的濾膜而被過濾造成的。因此，與100 ℃相比，120 ℃熱處理后大豆蛋白的聚集程度較高，但是，消化后酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量并沒有顯著性差異（圖2），可以推測，120 ℃熱處理后的大豆蛋白盡管形成了更大的聚集體，但是這種聚集體并沒有屏蔽胃蛋白酶的酶解位點，造成可消化性降低。
2.5 熱處理大豆蛋白的結(jié)構(gòu)表征
色氨酸內(nèi)源熒光光譜分析是一種被廣泛用于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化分析的重要手段。不同溫度處理的大豆蛋白色氨酸內(nèi)源熒光光譜如圖5所示。高溫?zé)崽幚韺?dǎo)致蛋白質(zhì)最大內(nèi)源熒光發(fā)射波長發(fā)生顯著紅移（從352.5 nm增加到359.0 nm）。蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜是通過測定色氨酸殘基所處的環(huán)境極性得到的，反映了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。當生色團暴露在溶劑環(huán)境中時，最大熒光發(fā)射波長（λm）則會發(fā)生顯著紅移，當生色團與溶劑中或蛋白質(zhì)本身的猝滅劑作用時，熒光量子產(chǎn)率降低。Dufour等[29]報道了色氨酸殘基處于球蛋白內(nèi)部疏水性區(qū)域時，SPI的λm約為335～336 nm。因此，高溫?zé)崽幚砗蟮拇蠖沟鞍踪|(zhì)色氨酸殘基所處的溶劑環(huán)境極性提高，即色氨酸殘基從球蛋白內(nèi)部疏水性區(qū)域轉(zhuǎn)移到表面，隨著溫度的逐漸提高，蛋白質(zhì)的變性程度逐漸增大，暴露程度也逐漸增加。
圖5 不同溫度處理大豆蛋白的色氨酸內(nèi)源熒光發(fā)射光譜Fig. 5 Intrinsic emission fluorescence spectra of soybean protein under different heat treatments
遠紫外圓二色光譜（250～200 nm）是一種表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的實驗手段，它能夠表征主鏈構(gòu)象，尤其在水溶性的蛋白溶液中。它可以直接用來反映蛋白二級結(jié)構(gòu)4 種類型的含量。SPI包含4 種類型的二級結(jié)構(gòu)：α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊以及無規(guī)卷曲，其中以β-折疊以及無規(guī)卷曲的含量較多[30]。
圖6 不同溫度處理大豆蛋白的圓二色光譜Fig. 6 Circular dichroism spectra of soybean protein under different heat treatments
圖6 是不同溫度處理后大豆蛋白的圓二色光譜圖。208 nm和222 nm波長處負凹糟是由于α-螺旋結(jié)構(gòu)引起的負科頓效應(yīng)造成的，而205～218 nm的負肩峰可以表征β-折疊結(jié)構(gòu)，負肩峰越偏向左移則表征無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量越多。在本實驗中，隨著加熱溫度的逐漸升高，負肩峰左移越來越明顯，說明體系內(nèi)的β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少并正在向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化。且溫度越高，轉(zhuǎn)化量越多。Carbonaro等[6]報道食品蛋白的消化性與β-折疊的含量的相反，β-折疊的含量與加工時形成穩(wěn)定的聚合物有關(guān)，豆類蛋白的β-折疊復(fù)合物的形成是蛋白質(zhì)水解減少的關(guān)鍵。Yang Yong等[31]研究5 種不同品種大豆蛋白的體外消化性，也發(fā)現(xiàn)β-折疊含量與蛋白的體外消化性呈負相關(guān)。
140、160 ℃的高溫?zé)崽幚頃?dǎo)致肽鍵斷裂數(shù)增多，生成更多更低分子質(zhì)量的肽段，體外消化率顯著提高（圖2）。因此推測，在140、160 ℃的高溫?zé)崽幚項l件下，大豆蛋白體外消化率的提高是由于體系內(nèi)β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低導(dǎo)致的。
3 結(jié) 論
大豆蛋白是具有較高營養(yǎng)價值的優(yōu)質(zhì)蛋白，是廣泛用于嬰兒配方食品等特殊膳食的配料。熱處理是嬰兒食品加工過程中一種必要的單元操作。然而高溫?zé)崽幚硎欠窀淖兞舜蠖沟鞍椎臓I養(yǎng)價值目前尚不清楚。因此，本實驗考察了高溫?zé)崽幚泶蠖沟鞍兹芤簩?dǎo)致的營養(yǎng)和消化性的差異。結(jié)果表明，一方面，高溫?zé)崽幚碇苯悠茐牧梭w系內(nèi)的氨基酸組成，損壞了大豆蛋白氨基酸合理的模式比例，降低了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值；另一方面，高溫?zé)崽幚碛欣诖蠖沟鞍着c胃蛋白酶的相互作用，生成更多更低分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物。然而高溫?zé)崽幚硎欠窀淖兞诉@些胃腸道酶解物的結(jié)構(gòu)特征以及是否降低了小肽轉(zhuǎn)運載體（PepT1）轉(zhuǎn)運肽段的能力從而導(dǎo)致生物吸收能力的低效化等問題則需要進一步的探究。
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王雅卉，邢霽云，徐婧婷，郭順堂*
（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室，北京 100083）
大豆蛋白是優(yōu)質(zhì)蛋白[1]，是廣泛用于嬰兒配方食品等特殊膳食的配料[2-3]。熱處理是嬰兒食品加工過程中一種必要的單元操作，工業(yè)化生產(chǎn)中常采用120 ℃以上的高溫殺菌或降低植物蛋白中胰蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子活性。同時，熱處理能破壞蛋白分子緊密的四級結(jié)構(gòu)，顯著提高蛋白質(zhì)的消化性[4-5]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，某些高溫?zé)崽幚砘虿划敓崽幚頃档投诡惖鞍椎臓I養(yǎng)有效性[6-10]。例如，將菜豆的7S蛋白和蠶豆的11S蛋白在120 ℃條件下熱處理20 min后，置于大鼠小腸內(nèi)酶解1 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜豆的7S蛋白可以產(chǎn)生分子質(zhì)量約23.7 kDa的不可消化聚合物，蠶豆的11S蛋白則產(chǎn)生分子質(zhì)量約為20 kDa的疏水性不可消化聚合物[6-8]?？梢?，與一般熱處理不同，高溫?zé)崽幚硪鹆嗣附猱a(chǎn)物的聚合，從而有可能降低了豆類蛋白的營養(yǎng)有效性。然而，目前尚不明確高溫?zé)崽幚硎欠褚哺淖兞舜蠖沟鞍椎臓I養(yǎng)有效性。為此，本研究分析熱處理后大豆蛋白的氨基酸組成變化，評價熱處理后大豆蛋白中必需氨基酸的營養(yǎng)平衡情況，探討熱處理對大豆蛋白體外模擬消化物組分及分子質(zhì)量分布的影響，以期闡明高溫?zé)崽幚韺Υ蠖沟鞍紫玫男Ч瑸榇蠖沟鞍滋厥馍攀呈称芳庸さ臒崽幚砜刂铺峁﹨⒖肌?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
低溫脫脂豆粕 山松生物制品有限公司。
胃蛋白酶（P7000）、胰酶（P1750）、β-巰基乙醇、醋酸鈾染液、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、脲、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸銨、甘油、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、Tris Base、乙腈、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)、ZORBAX SB-C18色譜柱（分析柱） 美國Agilent公司；Protein Pak 60凝膠柱 美國Waters公司；DYY-6D穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀 北京六一儀器廠；Spectrum SP-2100UV紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 SPI的制備
將脫脂豆粕與水以液料比1∶15混合后，調(diào)節(jié)pH值為8.0，室溫攪拌90 min，兩層紗布過濾除去其中的不溶性雜質(zhì)后，接著1 000×g離心10 min得到濾液，將濾液用酸調(diào)整pH值至4.5，置于室溫靜置30 min。將濾液1 000×g離心5 min，去除上清液，沉淀即為大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）；將沉淀取出，加水復(fù)溶，不斷調(diào)整pH值至7.0，待完全溶解后，用液氮速凍后干燥，留樣備用[11-12]，樣品中的蛋白質(zhì)量分數(shù)約為92%。
取冷凍干燥后的SPI配制成質(zhì)量分數(shù)2%的SPI溶液，分別在100、120、140、160 ℃條件下油浴加熱20 min后，相應(yīng)記為SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160，冷凍干燥備用。
1.3.2 大豆蛋白氨基酸組成分析
采用氨基酸自動分析儀，分別對SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160樣品的氨基酸組成進行分析。
1.3.3 大豆蛋白氨基酸營養(yǎng)性評價
根據(jù)1.3.2節(jié)分析得到的SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160氨基酸組成，分別用氨基酸評分（amino acid score，AAS）、化學(xué)評分（chemical score，CS）、必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）、氨基酸比值系數(shù)分（score of ratio coefficient of amino acid，SRCAA）、必需氨基酸相對比值（essential amino acid relative ratio，EAARR）對不同加熱后的大豆蛋白氨基酸模式進行營養(yǎng)性評價。
AAS：用于評價待測蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸與參考蛋白模式中相應(yīng)必需氨基酸含量的接近程度[13]。如公式（1）所示計算。
其中，必需氨基酸中AAS數(shù)值最低者定義為AASmin，其AASmin就是該種蛋白質(zhì)的AAS值。
CS：評價待測蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸的相對含量（其含量與必需氨基酸總量之比）與參考蛋白模式中相應(yīng)必需氨基酸相對含量的接近程度（世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）/國際食品法典委員（Codex Alimentarius Commission，CAC））[14]，如公式（2）所示計算。
其中，必需氨基酸中CS數(shù)值最低者定義為CSmin，其CSmin就是該種蛋白質(zhì)的CS值。
EAAI：評價待測蛋白質(zhì)中所有必需氨基酸含量與參考蛋白模式中所有必需氨基酸含量比值的幾何平均數(shù)（以100 分計）[15]。如公式（3）所示計算。
式中：p為食物蛋白；s為參考蛋白；n為比較的必需氨基酸個數(shù)。
SRCAA：評價待測蛋白質(zhì)的必需氨基酸與參考蛋白模式中相應(yīng)必需氨基酸的接近程度[16]。先計算出各個氨基酸的比值（AAS），再算出各氨基酸比值的平均數(shù)。在此基礎(chǔ)上計算氨基酸比值系數(shù)（ratio coefficient of amino acid，RCAA）及SRCAA。具體公式如式（4）～（5）所示。
式中：CV為RCAA的變異系數(shù)，CV=標準差/平均數(shù)。
EAARR：評價標準值與各種必需氨基酸比值距離標準差的平均值之差[17]。如公式（6）所示計算。
式中：n為待測蛋白質(zhì)中必需氨基酸的個數(shù)。
1.3.4 嬰兒體外消化模型的建立
根據(jù)Marambe等[18]的方法，并略作改動。用pH 4的0.2%（質(zhì)量分數(shù)，下同）NaCl溶液配制成2.5%的胃蛋白酶溶液（胃液模擬溶液）；用pH 7的0.68% KH2PO4和0.062% NaOH混合溶液配制成0.5%胰酶溶液（腸液模擬溶液）。將SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160樣品的pH值調(diào)至4.0，在37 ℃水浴中平衡10 min后，按m（酶）∶m（底物）=1∶5的比例加入胃蛋白酶溶液，在37 ℃條件下分別消化0、1、10、30 min，再將各樣品的pH值調(diào)至7.0，在37 ℃水浴中平衡10 min，按m（酶）∶m（底物）=1∶40加入胰酶溶液，在37 ℃條件下消化30、60 min后分別取樣，作為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）的樣品。腸道消化時間為60 min時記為消化終點，將胃腸道酶解物冷凍干燥備用。
1.3.5 嬰兒體外模擬消化物的SDS-PAGE分析
SDS-PAGE參考Ren Chengang等[19]的方法，將一定量樣品（2～5 mg，以蛋白質(zhì)量計）加入1.5 mL離心管，加入0.5 mL的含有體積分數(shù)20%甘油、質(zhì)量分數(shù)0.2% SDS、0.063 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）的樣品處理液，再添加0.36 g脲和20 μL飽和溴酚藍溶液，加蒸餾水使總體積為1 mL，充分混合均勻，靜置過夜后進行SDS-PAGE。
采用Bio Craft Model BE-210N垂直平板電泳裝置，膠板厚度為1 mm。分離膠質(zhì)量分數(shù)為12.5%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)4%。電泳緩沖液含有5 mmol/L Tris、38.4 mmol/L甘氨酸和0.1% SDS。上樣量為5 μL。SDS-PAGE過程中，濃縮膠部分保持電流15 mA，進入分離膠后，電流為25 mA。
膠片用體積分數(shù)33%甲醇溶液和12%三氯乙酸固定液固定4 h，然后用考馬斯亮藍G-250染色液染色3～4 h。染色結(jié)束后，用蒸餾水對膠片進行脫色，直至底色基本脫除。
1.3.6 胃腸道酶解物分子質(zhì)量分布分析
采用體積排阻HPLC（size-exclusion HPLC，SE-HPLC）法分析胃腸道酶解物的分子質(zhì)量[20]。在待測樣品冷凍干燥粉中加入0.03 mol/L、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液，配制成5 mg/mL的樣品，采用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾后進樣。色譜條件如下：1100 HPLC系統(tǒng)，色譜柱為Protein Pak 60凝膠色譜柱（分離范圍1～20 kDa）；流動相：0.03 mol/L、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液；檢測波長為214 nm；流速為0.5 mL/min；上樣量為20 μL；檢測溫度為27 ℃。分子質(zhì)量校正曲線所用標準品為胰蛋白酶抑制劑（MW20 100 Da）、蛋清溶菌酶（MW14 400 Da）、AB2-80（MW7 823 Da）、AB2-81（MW5 856 Da）、AB2-95（MW3 313 Da），根據(jù)標準品分子質(zhì)量的對數(shù)與保留時間作回歸分析。再根據(jù)樣品的保留時間和回歸方程計算待測樣品的分子質(zhì)量。
1.3.7 蛋白分子質(zhì)量分布的測定
SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160分子質(zhì)量的測定采用SE-HPLC法[21]。待測樣品冷凍干燥粉溶于含有0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7）中，用直徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾后進樣。色譜條件為：1100 HPLC系統(tǒng)；色譜柱為TSK gel G4000SWXL凝膠色譜柱；流動相為0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L pH 7的磷酸鹽緩沖液；檢測波長280 nm；流速0.5 mL/min；上樣量20 μL；檢測溫度27 ℃。
1.3.8 可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的測定
配制質(zhì)量分數(shù)為2%的SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160樣品溶液，室溫下溶解60 min后，10 000×g離心10 min得到上清液，用Bradford法[22]測定上清液中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)。
1.3.9 色氨酸內(nèi)源熒光發(fā)射光譜分析
參照Shen Lan等[23]的方法并略作改進，用熒光光譜儀測定SPI-100、SPI-120、SPI-140、SPI-160樣品中的內(nèi)源（色氨酸）熒光發(fā)射光譜。待測樣品用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.80）溶解，控制蛋白質(zhì)量濃度在0.1～0.2 mg/mL。溶液在290 nm波長處激發(fā)，掃描300～420 nm的熒光發(fā)射光譜，狹縫寬度10 nm，掃描速率200 nm/min。
1.3.10 圓二色光譜分析
在MOS-450/AF-CD分光儀上收集樣品的圓二色光譜圖。所有樣品的蛋白質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL，在190～250 nm范圍內(nèi)掃描，選用1 mm長度的石英皿并用25 ℃的去離子水作空白，每個圓二色光譜掃描速率為30 nm/min，數(shù)據(jù)點的記錄間隔為1 nm，響應(yīng)時間為2 s。
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
所有實驗得到的數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析檢驗，顯著性水平為P＜0.05。每個樣品平行測定3 次，所有實驗重復(fù)兩次。
2 結(jié)果與分析
2.1 熱處理大豆蛋白的氨基酸組成分析及營養(yǎng)性評價
蛋白質(zhì)的氨基酸組成和含量影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)有效性。對不同溫度處理后大豆蛋白的氨基酸組成進行分析，結(jié)果如表1所示。
表1 不同溫度處理后大豆蛋白的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of soybean protein under different temperature treatments
與100 ℃熱處理相比，120 ℃熱處理對氨基酸組成及含量影響不大，但隨著熱處理溫度升高，大豆蛋白中的氨基酸存在不同程度的損失，其中，以胱氨酸損失最為嚴重。140、160 ℃的處理條件分別導(dǎo)致胱氨酸損失了30%、48%。這一結(jié)果與Bjarnason等[24]報道牛血清白蛋白在145 ℃加熱后胱氨酸大量損失的實驗結(jié)果相一致。當加熱溫度過高時，半胱氨酸、胱氨酸會發(fā)生脫硫反應(yīng)，產(chǎn)生不可逆的分解，形成硫化氫、二甲基硫化物、磺基丙氨酸等，造成氨基酸的嚴重破壞。
為進一步了解不同溫度熱處理后大豆蛋白中的必需氨基酸的營養(yǎng)平衡情況，本實驗采用蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價常用的5 種化學(xué)分析方法：AAS、CS、EAAI、EAARR、SRCAA，以WHO/CAC母乳蛋白氨基酸參考模式為評價標準，對不同熱處理后大豆蛋白的必需氨基酸進行模式評分計算，結(jié)果如表2所示。
無論是以WHO推薦的母乳氨基酸含量為評分標準還是以CAC推薦的母乳氨基酸含量為評分標準，不同溫度下加熱的大豆蛋白化學(xué)評分變化趨勢基本相同。與100 ℃的加熱處理相比，除了SRCAA外，120 ℃的熱處理會使得大豆蛋白的其他化學(xué)評分略有升高，即越接近母乳蛋白的必需氨基酸比例。然而，當進一步提高溫度至140、160 ℃時，大豆蛋白的所有化學(xué)評分均明顯下降，即140、160 ℃的熱處理導(dǎo)致大豆蛋白中必需氨基酸的比例或模式不適于嬰兒所需要的各種氨基酸的比例或模式要求，蛋白的營養(yǎng)有效性顯著下降。大豆蛋白氨基酸的比例模式變化是由于熱處理引起氨基酸的損失造成的。
表2 不同溫度處理后大豆蛋白的化學(xué)評分Table 2 Nutritional evaluation of soybean protein under different heat treatments
2.2 熱處理大豆蛋白體外模擬消化物SDS-PAGE結(jié)果分析
蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值不僅與蛋白質(zhì)本身的氨基酸含量有關(guān)，還取決于蛋白質(zhì)的可消化性、消化產(chǎn)物性質(zhì)及其在生物體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運過程。為了考察高溫?zé)崽幚泶蠖沟鞍左w外消化情況，本研究采用嬰兒體外模擬消化的方法，在不同溫度處理的大豆蛋白消化不同時間點取樣進行SDS-PAGE，通過觀測電泳條帶變化反映樣品的消化情況。如圖1所示，100 ℃熱處理的大豆蛋白在胃部消化30 min后，各個亞基條帶顏色逐漸變淺，其中，7Sβ亞基被消化酶酶解的速率高于α'和α亞基，11S A亞基的酶解速率高于β亞基。在胃部消化結(jié)束時，SPI的幾個主要亞基的條帶仍均有不同程度的保留。而進一步進入腸道消化后，仍然有略低于14 kDa的胃腸道酶解物大量存在。120 ℃熱處理后的大豆蛋白體外消化的SDS-PAGE圖譜與100 ℃加熱處理大豆蛋白的基本相似。
值得注意的是，140、160 ℃熱處理后的大豆蛋白SDS-PAGE圖譜中并未出現(xiàn)典型的大豆蛋白條帶（泳道2），α'、α、β亞基以及A亞基和B亞基條帶在SDS-PAGE圖譜上不清晰。據(jù)報道，當加熱溫度過高時，半胱氨酸、胱氨酸會發(fā)生脫硫反應(yīng)，肽鍵斷裂，形成硫化氫、二甲基硫化物、磺基丙氨酸等，造成氨基酸的嚴重破壞[25]。而在一個具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子中，由一條多肽鏈折疊成的三級結(jié)構(gòu)球蛋白才能稱為蛋白質(zhì)亞基。因此，本實驗中觀察到的140、160 ℃熱處理后大豆蛋白無明顯電泳條帶可能是由于高溫破壞了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)以及亞基的空間構(gòu)象。
圖1 熱處理大豆蛋白溶液嬰兒體外模擬消化的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE of soybean protein digested in simulated infant gastrointestinal tract
2.3 大豆蛋白胃腸道酶解物分子質(zhì)量分布分析結(jié)果
圖2 大豆蛋白體外模擬消化后的SE-HPLC圖譜Fig. 2 SE-HPLC profile of soybean protein after in vitro digestion
進一步對不同溫度處理的大豆蛋白胃腸道酶解物分子質(zhì)量分布進行分析。如圖2所示，100、120 ℃熱處理的大豆蛋白經(jīng)胃腸道酶解后得到的胃腸道酶解物的分子質(zhì)量分布沒有顯著性差異。然而，大豆蛋白經(jīng)140、160 ℃高溫處理后胃腸道酶解物的出峰時間較晚，分子質(zhì)量明顯降低。對樣品不同分子質(zhì)量組分所占比例進一步分析可以看出，隨著加熱溫度逐漸升高，尤其是將大豆蛋白加熱至140、160 ℃后，大分子質(zhì)量（MW＞15 kDa）的胃腸道酶解物所占比例顯著降低，低分子質(zhì)量尤其是1～10 kDa的胃腸道酶解物，所占比例顯著提高（表3）。
表3 大豆蛋白體外模擬消化后不同分子質(zhì)量組分所占比例Table 3 Ratios of fractions with different molecular masses in in vitro digested soybean protein
2.4 不同溫度加熱后大豆蛋白的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)和分子質(zhì)量分布結(jié)果
蛋白質(zhì)的聚集程度能影響蛋白質(zhì)與胃腸道消化酶的相互作用關(guān)系，進而影響蛋白質(zhì)的消化吸收[26-27]。大量研究表明，具有相同氨基酸組成的蛋白質(zhì)經(jīng)過不同方式處理后，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化是導(dǎo)致蛋白質(zhì)胃腸道酶解物性質(zhì)差異及消化性和營養(yǎng)性不同的主要原因[4-5,28]。本研究從蛋白聚集程度出發(fā)，分析蛋白質(zhì)可消化性與營養(yǎng)有效性的關(guān)系。
圖3 不同溫度加熱后大豆蛋白的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)Fig. 3 Soluble protein content of soybean protein under different heat treatments
如圖3所示，100、120 ℃熱處理的大豆蛋白可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)較低，分別約為77%、67%；而經(jīng)過更高溫度（140、160 ℃）熱處理后，溶液中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)升高。進一步對高溫?zé)崽幚泶蠖沟鞍椎姆肿淤|(zhì)量進行了分析。如圖4和表4所示，100 ℃熱處理后的大豆蛋白高分子化合物所占比例較高（洗脫時間約為13 min），低分子質(zhì)量化合物所占比例較低（洗脫時間約為26.5 min）。繼續(xù)提高加熱溫度，高分子質(zhì)量化合物所占的比例逐漸減小，低分子質(zhì)量的化合物所占比例逐漸增多。
圖4 不同溫度加熱后大豆蛋白的SE-HPLC圖譜Fig. 4 SE-HPLC profiles of soybean protein under different heat treatments
表4 大豆蛋白不同分子質(zhì)量組分所占比例Table 4 Ratios of fractions with different molecular masses in soybean protein under different heat treatments
然而，值得注意的是，本實驗中樣品首先需要通過0.45 μm的濾膜才能進一步進行SE-HPLC分析。前述的實驗已經(jīng)表明，120 ℃的熱處理使得可溶性蛋白含量明顯降低（圖3），因此，對于120 ℃熱處理后大豆蛋白SE-HPLC圖譜而言，分子質(zhì)量大于670 kDa的高分子聚合物含量明顯降低并不是由于樣品本身聚集程度減少造成的，而是由于在120 ℃熱處理的條件下，大豆蛋白更容易相互聚集，形成了更大的聚集體，但這些高分子聚合物不能透過0.45 μm的濾膜而被過濾造成的。因此，與100 ℃相比，120 ℃熱處理后大豆蛋白的聚集程度較高，但是，消化后酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量并沒有顯著性差異（圖2），可以推測，120 ℃熱處理后的大豆蛋白盡管形成了更大的聚集體，但是這種聚集體并沒有屏蔽胃蛋白酶的酶解位點，造成可消化性降低。
2.5 熱處理大豆蛋白的結(jié)構(gòu)表征
色氨酸內(nèi)源熒光光譜分析是一種被廣泛用于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化分析的重要手段。不同溫度處理的大豆蛋白色氨酸內(nèi)源熒光光譜如圖5所示。高溫?zé)崽幚韺?dǎo)致蛋白質(zhì)最大內(nèi)源熒光發(fā)射波長發(fā)生顯著紅移（從352.5 nm增加到359.0 nm）。蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜是通過測定色氨酸殘基所處的環(huán)境極性得到的，反映了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。當生色團暴露在溶劑環(huán)境中時，最大熒光發(fā)射波長（λm）則會發(fā)生顯著紅移，當生色團與溶劑中或蛋白質(zhì)本身的猝滅劑作用時，熒光量子產(chǎn)率降低。Dufour等[29]報道了色氨酸殘基處于球蛋白內(nèi)部疏水性區(qū)域時，SPI的λm約為335～336 nm。因此，高溫?zé)崽幚砗蟮拇蠖沟鞍踪|(zhì)色氨酸殘基所處的溶劑環(huán)境極性提高，即色氨酸殘基從球蛋白內(nèi)部疏水性區(qū)域轉(zhuǎn)移到表面，隨著溫度的逐漸提高，蛋白質(zhì)的變性程度逐漸增大，暴露程度也逐漸增加。
圖5 不同溫度處理大豆蛋白的色氨酸內(nèi)源熒光發(fā)射光譜Fig. 5 Intrinsic emission fluorescence spectra of soybean protein under different heat treatments
遠紫外圓二色光譜（250～200 nm）是一種表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的實驗手段，它能夠表征主鏈構(gòu)象，尤其在水溶性的蛋白溶液中。它可以直接用來反映蛋白二級結(jié)構(gòu)4 種類型的含量。SPI包含4 種類型的二級結(jié)構(gòu)：α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊以及無規(guī)卷曲，其中以β-折疊以及無規(guī)卷曲的含量較多[30]。
圖6 不同溫度處理大豆蛋白的圓二色光譜Fig. 6 Circular dichroism spectra of soybean protein under different heat treatments
圖6 是不同溫度處理后大豆蛋白的圓二色光譜圖。208 nm和222 nm波長處負凹糟是由于α-螺旋結(jié)構(gòu)引起的負科頓效應(yīng)造成的，而205～218 nm的負肩峰可以表征β-折疊結(jié)構(gòu)，負肩峰越偏向左移則表征無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量越多。在本實驗中，隨著加熱溫度的逐漸升高，負肩峰左移越來越明顯，說明體系內(nèi)的β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少并正在向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化。且溫度越高，轉(zhuǎn)化量越多。Carbonaro等[6]報道食品蛋白的消化性與β-折疊的含量的相反，β-折疊的含量與加工時形成穩(wěn)定的聚合物有關(guān)，豆類蛋白的β-折疊復(fù)合物的形成是蛋白質(zhì)水解減少的關(guān)鍵。Yang Yong等[31]研究5 種不同品種大豆蛋白的體外消化性，也發(fā)現(xiàn)β-折疊含量與蛋白的體外消化性呈負相關(guān)。
140、160 ℃的高溫?zé)崽幚頃?dǎo)致肽鍵斷裂數(shù)增多，生成更多更低分子質(zhì)量的肽段，體外消化率顯著提高（圖2）。因此推測，在140、160 ℃的高溫?zé)崽幚項l件下，大豆蛋白體外消化率的提高是由于體系內(nèi)β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低導(dǎo)致的。
3 結(jié) 論
大豆蛋白是具有較高營養(yǎng)價值的優(yōu)質(zhì)蛋白，是廣泛用于嬰兒配方食品等特殊膳食的配料。熱處理是嬰兒食品加工過程中一種必要的單元操作。然而高溫?zé)崽幚硎欠窀淖兞舜蠖沟鞍椎臓I養(yǎng)價值目前尚不清楚。因此，本實驗考察了高溫?zé)崽幚泶蠖沟鞍兹芤簩?dǎo)致的營養(yǎng)和消化性的差異。結(jié)果表明，一方面，高溫?zé)崽幚碇苯悠茐牧梭w系內(nèi)的氨基酸組成，損壞了大豆蛋白氨基酸合理的模式比例，降低了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值；另一方面，高溫?zé)崽幚碛欣诖蠖沟鞍着c胃蛋白酶的相互作用，生成更多更低分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物。然而高溫?zé)崽幚硎欠窀淖兞诉@些胃腸道酶解物的結(jié)構(gòu)特征以及是否降低了小肽轉(zhuǎn)運載體（PepT1）轉(zhuǎn)運肽段的能力從而導(dǎo)致生物吸收能力的低效化等問題則需要進一步的探究。
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