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        魚鰾類肝素的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

        2019-08-30 06:12:36周斯儀鐘賽意蘇偉明杜振興陳建平洪鵬志章超樺
        食品科學(xué) 2019年15期
        關(guān)鍵詞:魚鰾硫酸組分

        周斯儀,鐘賽意,2,3,*,蘇偉明,3,杜振興,陳建平,洪鵬志,章超樺,3,4

        (1.廣東海洋大學(xué)深圳研究院,廣東 深圳 518108;2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東 湛江 524088;3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088;4.廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088)

        魚鰾也稱魚泡、魚肚或魚膠等,是魚類調(diào)節(jié)沉浮的器官。魚鰾富含膠原蛋白、多糖等活性物質(zhì),自北魏《齊民要術(shù)》開始記載以來(lái),一直被視為藥食兩用的滋補(bǔ)珍品?!侗静菥V目》記載魚鰾有止血作用,可用來(lái)治療吐血、崩漏、外傷出血和產(chǎn)后抽搐等[1]?!侗静菪戮帯贩Q魚鰾具有養(yǎng)肝益腎、補(bǔ)腎固精的功效[2]。魚鰾還能滋養(yǎng)經(jīng)脈、散瘀消腫[3]。但其作用功效和物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確。目前對(duì)魚鰾功能因子研究主要集中在其膠原蛋白和多肽的提取、結(jié)構(gòu)表征及生物活性等方面[4-6]。近幾年有報(bào)道發(fā)現(xiàn)魚鰾多糖具有預(yù)防結(jié)腸癌、緩解胃潰瘍、系統(tǒng)性紅斑狼瘡炎癥的潛力[7-9],但目前對(duì)魚鰾多糖的組成和結(jié)構(gòu)特性尚未明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)魚鰾多糖以糖胺聚糖為主[10],并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其主要由類肝素化合物組成。

        肝素是由糖醛酸與葡萄糖胺組成的聚陰離子黏多糖,作為高效的抗凝血藥物廣泛應(yīng)用于臨床治療。隨著藥理學(xué)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)肝素還具有抗血栓、抑制平滑肌細(xì)胞增生、抗炎癥和抗腫瘤等生物活性,但其較高的抗凝血作用容易引起出血副作用,因而限制了其在非抗凝方面的應(yīng)用[11]。類肝素是結(jié)構(gòu)上與肝素結(jié)構(gòu)相似的一類酸性黏多糖,常見的有硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)和硫酸皮膚素(dermatan sulfate,DS)等。類肝素抗凝血作用相對(duì)較低,長(zhǎng)期使用無(wú)肝素抗凝血活性引起的副作用。因此類肝素化合物越來(lái)越多地引起研究者關(guān)注。本研究采用酶法提取魚鰾類肝素(heparinoid from swimming bladder,HSB),并對(duì)其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定,以期為闡明魚鰾多糖的結(jié)構(gòu)組成和構(gòu)效關(guān)系提供參考,為魚鰾功效因子的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        魚鰾(鱸魚,Lateolabrax japonicus)購(gòu)自湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng);2709堿性蛋白酶(1.2×105U/g)南寧龐博生物工程有限公司;FPA98 Cl型大孔陰離子交換樹脂 羅門哈斯(中國(guó))公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(5-methyl-2-phenyl-2,4-dihydro-3H-pyrazol-3-one,PMP)、CS二糖標(biāo)準(zhǔn)品(ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S) 美國(guó)Sigma公司;乙腈(色譜純)德國(guó)Meker公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        N-1300D-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社;HR/T20MM型高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;FD8508型真空冷凍干燥機(jī) 韓國(guó)ilShin公司;Xevo G2-XS QTof高分辨質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)儀 美國(guó)Waters公司;Agilent1200高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng) 美國(guó)安捷倫公司;Bruker AV-500和AV-700超導(dǎo)核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)儀 德國(guó)Bruker BioSpin GmbH公司。

        1.3 方法

        1.3.1 HSB的制備與分離

        參考文獻(xiàn)[11]中肝素的制備工藝并略作調(diào)整,工藝流程為:魚鰾干粉→酶解→滅酶→離心取上清液→大孔陰離子交換樹脂吸附洗脫→醇沉→離心收集沉淀→無(wú)水乙醇洗滌2 次→透析→冷凍干燥。

        具體步驟:魚鰾經(jīng)烘干、粉碎后,加入20 倍體積的雙蒸水和質(zhì)量濃度為5.4 mg/mL的蛋白酶,50 ℃水浴鍋中酶解20 h;沸水浴滅酶10 min,冷卻后離心(8 000 r/min、20 min);取上清液用大孔陰離子交換樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,再分別用0.3、0.5、0.9、1.1 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫;每分鐘收集一管,用阿利新藍(lán)法分析管中類肝素含量,以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)、阿利新藍(lán)法染色所得吸光度(A490nm)為縱坐標(biāo)制作梯度洗脫曲線;收集洗脫液,緩慢加入1 倍體積的無(wú)水乙醇,靜置12 h后離心(4 000 r/min、5 min),收集沉淀,沉淀用無(wú)水乙醇洗滌2 次;經(jīng)3 kDa透析袋脫鹽,冷凍干燥。

        1.3.2 基本成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和HSB得率的測(cè)定

        類肝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用阿利新藍(lán)法[12],以肝素為標(biāo)準(zhǔn)品;蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用福林-酚法[13],以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品;糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用咔唑-硫酸法[14],以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品;氨基己糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用改進(jìn)的Wagner法[15],以葡萄糖胺為標(biāo)準(zhǔn)品;硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用BaCl2-gel比濁法[16],以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品。HSB得率和各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別按式(1)、(2)計(jì)算。

        式中:md1為HSB質(zhì)量/mg;md2為魚鰾干粉質(zhì)量/g。

        式中:ρ為某成分質(zhì)量濃度/(mg/mL);md3為所稱取HSB質(zhì)量/mg;V為溶液體積/mL。

        1.3.3 HSB的種類鑒定

        類肝素化合物的結(jié)構(gòu)鑒定采用醋酸纖維素薄膜電泳法,具體步驟參考文獻(xiàn)[17]。

        1.3.4 HSB的純度分析

        HSB用蒸餾水配成1 mg/mL的溶液,以蒸餾水為調(diào)零管,采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品的紫外吸收光譜。

        1.3.5 HSB的分子質(zhì)量分析

        采用高效凝膠色譜(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)測(cè)定HSB的分子質(zhì)量[18]。色譜柱:Ultrahydrogel Column 500糖分析凝膠柱(7.8 mm×300 mm,10 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:0.2 mol/L硫酸鈉;流速:0.6 mL/min;檢測(cè)器為1200示差檢測(cè)器;進(jìn)樣體積:10 μL。

        葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(分子質(zhì)量分別為10 000、23 800、48 600、80 000、150 000、273 000、409 800 u)和HSB分別用0.2 mol/L硫酸鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液,經(jīng)0.22 μm的針式濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的保留時(shí)間并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

        1.3.6 HSB的單糖組成分析

        樣品前處理:稱取樣品3.0 mg于15 mL樣品瓶中,加入1.5 mol/L的三氟乙酸9 mL,置于110 ℃烘箱中分別水解2、4、6、8、12、16、24、28 h,水解液用氮?dú)獯蹈?,蒸干物用超純水溶解,并于?0 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

        處理后的樣品和單糖標(biāo)準(zhǔn)品采用PMP衍生-高效液相反相色譜法測(cè)定[19]。單糖標(biāo)準(zhǔn)品:甘露糖(mannose,Man)、鼠李糖(rhamnose,Rha)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)、艾杜糖醛酸(iduronic acid,IdoA)、N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine,GalNAc)、半乳糖(galactose,Gal)。色譜柱:ZORBAX EclipseXDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)-乙腈溶液(83∶17,V/V);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):245 nm;進(jìn)樣體積:10 μL。

        1.3.7 HSB結(jié)構(gòu)的FTIR分析

        取2.0 mg樣品,在紅外燈下烘烤2 h,然后放入瑪瑙研鉢中,加入100 倍質(zhì)量的以同樣方式處理的氯化鉀,混合均勻,研磨至顆粒小于2.5 μm,放入壓片機(jī)中加壓制成半透明的小薄片;再將其放入傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrophotometer,F(xiàn)TIR)掃描儀中進(jìn)行光譜掃描,掃描范圍為4 000~400 cm-1。

        1.3.8 HSB的二糖組成分析

        二糖組成分析參考文獻(xiàn)[20]的方法并稍作修改。精密稱取0.010 0 g多糖樣品,加入5 mL醋酸銨緩沖液(pH 7.6~8.0,含0.2 U CS酶ABC),37 ℃孵育24 h。沸水浴滅酶5 min,10 000 r/min離心25 min。上清液用3 kDa超濾離心管過(guò)濾,取濾液冷凍干燥。將處理后的樣品和CS二糖標(biāo)準(zhǔn)品(ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S)分別用超純水配成1 μg/mL溶液用于MS/MS分析。

        MS條件:電子轟擊離子源;電子能量70 eV;傳輸線溫度275 ℃;離子源溫度200 ℃;母離子m/z 285;激活電壓1.5 V;質(zhì)量掃描范圍m/z 35~500。

        1.3.9 HSB結(jié)構(gòu)的NMR分析

        HSB樣品溶于D2O中,冷凍干燥,反復(fù)3 次以置換出H2O。處理后的樣品用D2O配制成30 mg/mL的溶液,在常溫下用NMR儀進(jìn)行1H譜、13C譜、異核單量子相干(heteronuclear singleqauntum coherence,HSQC)譜和異核多鍵相關(guān)(heteronuclear multiple-bond correlation,HMBC)譜分析。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用Origin 9.1和ChemBioDraw Ultra軟件作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 HSB的分離結(jié)果

        圖1 類肝素化合物FPA98 Cl型大孔陰離子交換柱洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of heparinoids on FPA98 Cl column

        類肝素為聚陰離子酸性黏多糖,在組織中以糖蛋白的形式存在。因此,類肝素的提取以酶法為主,蛋白酶將糖蛋白中的蛋白質(zhì)分解成易于去除的小肽和氨基酸,使類肝素從中釋放出來(lái)。游離在酶解液中的類肝素經(jīng)FPA98 Cl型大孔陰離子交換樹脂動(dòng)態(tài)吸附,再用氯化鈉溶液梯度洗脫,使中性多糖、蛋白質(zhì)和多肽等雜質(zhì)被低濃度的氯化鈉溶液洗脫下來(lái),帶陰離子基團(tuán)較多的類肝素則被高濃度氯化鈉溶液洗脫下來(lái)。梯度洗脫結(jié)果圖1所示,0.3、0.5、0.9、1.1 mol/L氯化鈉溶液分離出的洗脫液經(jīng)醇沉、透析、冷凍干燥后,得到4 個(gè)組分:F1、F2、F3和F4。各洗脫組分的得率和基本成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

        表1 各洗脫組分的HSB得率與基本成分Table 1 Yield and composition of each elution fraction

        由表1可知,從組分F1到F4,類肝素、糖醛酸和氨基己糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高,蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)遞減,說(shuō)明該方法能將類肝素高效分離出來(lái)。組分F4的HSB得率最高,為(2.21±0.03)mg/g,F(xiàn)2次之;組分F1蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,HSB得率和類肝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)都很低,且檢測(cè)不到糖醛酸和氨基己糖,說(shuō)明組分F1可能為中性糖和蛋白質(zhì)的混合物,梯度洗脫曲線中該組分吸光度高可能受色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的影響。組分F4的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為(12.29±2.20)%,F(xiàn)3次之,其他組分未檢測(cè)到硫酸基。硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)是提示類肝素活性的一項(xiàng)重要指標(biāo),一定范圍內(nèi)硫酸基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高,生物活性越強(qiáng)[21]。Sayari等[17]用海鰲蝦殼提取的類肝素中硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)(23.00±0.03)%,具有較強(qiáng)的抗凝血和抗細(xì)胞增殖作用。

        2.2 HSB的種類鑒定結(jié)果

        圖2 各洗脫組分及標(biāo)準(zhǔn)品的醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果Fig. 2 Acetate cellulose electrophoresis of each elution fraction and glycosaminoglycan standard

        不同種類的糖胺聚糖之間存在電荷密度差異,在醋酸纖維素薄膜電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率。各洗脫組分醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果如圖2a所示,組分F1為單一條帶,遷移率最低,這與其基本成分分析相符,進(jìn)一步驗(yàn)證F1可能是中性糖;組分F2和F3有4 個(gè)條帶,說(shuō)明所含糖胺聚糖種類較多;組分F4為單一條帶,遷移率最大。結(jié)合各組分HSB得率和理化性質(zhì)分析,選擇類肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)低、醋酸纖維素薄膜電泳條帶單一的組分F4做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定。

        醋酸纖維素薄膜電泳操作簡(jiǎn)易、靈敏度高,可作為初步鑒別糖胺聚糖種類的方法。在吡啶-甲酸緩沖液(pH 3.0)中,相對(duì)遷移率從小到大依次為透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、DS、CS和肝素[20]。由圖2b可知,肝素因電荷密度最高,遷移率最大;其次分別是CS、DS。組分F4的條帶與CS遷移率相近,初步確認(rèn)組分F4為CS。

        2.3 組分F4的純度及分子質(zhì)量

        2.3.1 紫外光譜掃描結(jié)果

        圖3 組分F4紫外光譜圖Fig. 3 Ultraviolet absorption spectrum of F4

        紫外光譜掃描是評(píng)價(jià)類肝素純度的方法之一。類肝素在185~220 nm處有糖基末端的吸收峰[8],核酸和蛋白質(zhì)分別在260、280 nm處有特征吸收峰。由圖3可知,紫外光譜掃描結(jié)果顯示,組分F4除在204 nm處有糖基末端吸收峰外,在其他紫外區(qū)域無(wú)明顯吸收峰;結(jié)合2.1節(jié)組分F4的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.19±0.07)%,表明F4純度較高。

        2.3.2 HPGPC分析結(jié)果

        圖4 組分F4的HPGPC圖譜Fig. 4 High performance gel permeation chromatogram of F4

        由圖4可知,組分F4的HPGPC圖只出現(xiàn)1 個(gè)峰,且峰形較對(duì)稱,表明F4的質(zhì)量分布相對(duì)均一,純度較高。高效凝膠色譜與示差折光檢測(cè)器聯(lián)用測(cè)得葡聚糖的分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(y)與保留時(shí)間(x)的回歸方程為:y=-0.319 2x+9.429 0(R2=0.996 6),計(jì)算得出組分F4的分子質(zhì)量約為84 000 u。一般類肝素的分子質(zhì)量在5 000~40 000 u范圍之間[22],相比之下,組分F4的分子質(zhì)量較大。

        2.4 組分F4的單糖組成分析結(jié)果

        糖胺聚糖由特定的重復(fù)二糖單位構(gòu)成,根據(jù)二糖組成的差異,分為透明質(zhì)酸、HS、肝素、DS和CS。因此,可以根據(jù)單糖組成推測(cè)類肝素黏多糖的種類。對(duì)比單糖混標(biāo)的HPLC圖譜(圖5)發(fā)現(xiàn),組分F4單糖衍生物(水解時(shí)間8 h)的HPLC圖(圖6)中出現(xiàn)1 個(gè)峰值很高的未知峰。由圖7可知,隨著組分F4水解時(shí)間的延長(zhǎng),未知峰的峰面積比例減少,GlcA和IdoA的峰面積比例也逐漸減少,GalNAc的峰面積比例不斷升高,說(shuō)明未知峰可能是未降解的寡糖片段。另外,也有報(bào)道稱此處為未降解完全的寡糖片段[23]。這可能是由于半乳糖胺較難水解,有研究表明半乳糖胺比其他單糖需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能完全被降解[19,24]。糖醛酸在酸溶液中不穩(wěn)定,易發(fā)生脫羧反應(yīng),甚至?xí)粡?qiáng)酸完全分解[25],因此隨降解時(shí)間的延長(zhǎng)糖醛酸的峰面積比例降低。根據(jù)保留時(shí)間和峰面積比例得出,組分F4主要含GlcA、GalNAc和少量的IdoA、Gal,由此得出其主鏈可能是CS。

        圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)品單糖衍生物的HPLC圖譜Fig. 5 High performance liquid chromatogram of mixture of monosaccharide derivative standards

        圖6 組分F4單糖衍生物的HPLC圖譜Fig. 6 High performance liquid chromatogram of monosaccharide derivatives from F4

        圖7 水解時(shí)間對(duì)組分F4降解產(chǎn)物峰面積比例的影響Fig. 7 Effect of hydrolysis time on percentage peak areas of degradation products from F4

        2.5 組分F4結(jié)構(gòu)的FTIR分析結(jié)果

        圖8 組分F4和CS的FTIR圖Fig. 8 Fourier transform infrared spectra of both F4 and CS

        由圖8可知,組分F4的FTIR圖與CS標(biāo)準(zhǔn)品基本一致。3 421 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)而寬的峰是O—H和N—H伸縮振動(dòng),說(shuō)明組分F4存在分子間和分子內(nèi)的氫鍵[26];2 918 cm-1處的吸收峰表明存在亞甲基[27];1 646 cm-1處強(qiáng)而稍寬的峰是乙酰氨基中的C=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的,另外,1 557 cm-1處N—H變角振動(dòng)峰和1 419 cm-1處C—N伸縮振動(dòng)峰表明存在乙酰氨基[28-29];1 377 cm-1處的峰是—COO-中的C=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[27];1 234 cm-1處不太尖銳的峰可能是C—H變角振動(dòng);1 255 cm-1處硫酸基中的S=O伸縮振動(dòng)和852 cm-1處硫酸酯基中的C—O—S軸向伸縮振動(dòng)表明存在硫酸基團(tuán)[35];927 cm-1處的吸收峰是吡喃糖環(huán)的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[30]。

        根據(jù)二糖單位中硫酸基數(shù)量和鏈接位置的不同,CS分為A、C、D、E等種類。A型CS(CSA)的硫酸基在C4位,產(chǎn)生的軸向伸縮振動(dòng)峰在850 cm-1附近;C型CS(CSC)的硫酸基在C6位,硫酸基處于平位,吸收峰在820 cm-1附近[31]。本實(shí)驗(yàn)所用CS標(biāo)準(zhǔn)品為E型CS(CSE),在820 cm-1和850 cm-1附近均有吸收峰。組分F4只在850 cm-1附近有吸收峰,表明F4可能為CSA或其衍生物。

        2.6 組分F4的二糖組成分析結(jié)果

        根據(jù)以上結(jié)果得出組分F4中主要含CS。為進(jìn)一步分析組分F4的二糖組成,采用CS酶ABC將CS完全裂解成不飽和二糖,再經(jīng)MS/MS分析鑒定。根據(jù)硫酸基團(tuán)數(shù)量及鏈接位置,CS二糖分為ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S等。其中,ΔDi-4S是CSA的主要二糖單位,ΔDi-6S是CSC的主要二糖單位。此外,由于具有相同硫酸基團(tuán)數(shù)量的二糖相對(duì)分子質(zhì)量相同,不能通過(guò)準(zhǔn)離子峰區(qū)分開,因此通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子進(jìn)行區(qū)分。組分F4完全降解產(chǎn)物和4 種常見的CS二糖標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS結(jié)果如圖9所示。

        圖9 組分F4裂解產(chǎn)物和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS圖Fig. 9 MS/MS spectra of degraded products of F4 and disaccharide standards

        圖10 CS二糖碎片基本組成圖[32-33]Fig. 10 Basic composition of chondroitin sulfate disaccharide fragments[32-33]

        圖10 為CS二糖碎片的基本組成[32-33]。結(jié)合圖10和表2可知,ΔDi-0S和ΔDi-UA-2S的半乳糖胺不含硫酸基,特征碎片結(jié)構(gòu)是[Z1-2H]-,m/z為202.09;ΔDi-UA-2S的硫酸基連接在葡萄糖醛酸C2的羥基上,因此具有[Y2-H]-和[Z2+Na-H]-特征碎片結(jié)構(gòu),其m/z分別為236.99、276.98。ΔDi-4S和ΔDi-6S的區(qū)別體現(xiàn)在,ΔDi-4S在m/z282處的離子相對(duì)豐度小于m/z300或不存在,而ΔDi-6S在m/z300處的離子相對(duì)豐度小于m/z282或不存在[34]。圖9中ΔDi-4S在m/z300.06處的離子相對(duì)豐度大于m/z282.05,ΔDi-6S在m/z282.05處的離子相對(duì)豐度較大,在m/z300.06處沒有碎片峰。此外,還觀察到ΔDi-6S在m/z239.94處的特征峰,其結(jié)構(gòu)為[W1-H]-,可用來(lái)判斷是否存在ΔDi-6S。組分F4完全降解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖中,在m/z202.09、236.99、276.98處沒有碎片峰,表明組分F4不含ΔDi-0S和ΔDi-UA-2S;在m/z300.06處的離子相對(duì)豐度大于m/z282.05,且不含ΔDi-6S特征峰m/z239.94,說(shuō)明F4的主要二糖單位為ΔDi-4S。結(jié)合FTIR掃描結(jié)果,確定組分F4主要為CSA。

        表2 二糖MS/MS特征碎片峰及其結(jié)構(gòu)Table 2 MS/MS characteristic fragment peaks of disaccharides and their structures of disaccharides

        2.7 組分F4結(jié)構(gòu)的NMR鑒定結(jié)果

        圖11為組分F4的1H、13C、HSQC和HMBC的NMR譜圖。在1H NMR譜圖中,質(zhì)子信號(hào)最強(qiáng)的峰位于δ4.79處,是氘代水產(chǎn)生的溶劑峰,除此之外,所有質(zhì)子信號(hào)均位于2 個(gè)光譜區(qū)。在δ2.0~2.1之間出現(xiàn)了乙酰胺甲基信號(hào),文獻(xiàn)[35]報(bào)道CSA和CSC的乙酰胺甲基信號(hào)分別在δ2.04、2.02處,組分F4乙酰胺甲基信號(hào)位于δ2.04,說(shuō)明F4可能為CSA;其他質(zhì)子信號(hào)集中在δ3~5之間,說(shuō)明F4為β-構(gòu)型[36]。

        圖11 組分F4的NMR 圖譜Fig. 11 NMR spectraof F4

        在13C NMR譜圖中,δ174.96和δ174.35的低場(chǎng)信號(hào)表明存在乙酰氨基和己糖醛酸的羧基;δ22.45的高場(chǎng)信號(hào)可能為乙酰胺甲基碳;其他信號(hào)集中在δ50~105之間。此外,由HSQC譜圖中的(2.04,22.47)和HMBC譜圖(2.04,174.38)確定δ22.47為乙酰氨基的甲基碳信號(hào),δ2.04為乙酰氨基的甲基質(zhì)子信號(hào),δ174.38為乙酰氨基的羰基碳信號(hào)。參照文獻(xiàn)[35]和[37]對(duì)組分F4的1H、13C NMR譜進(jìn)行歸屬,結(jié)果如表3所示。對(duì)1H、13C、HSQC和HMBC圖譜進(jìn)行綜合分析,得出組分F4主要結(jié)構(gòu)式為[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]n。

        表3 組分F4的1、13C NMR信號(hào)歸屬Table 3 1E and 13C nuclear magnetic resonance signal assignment of F4

        表3 組分F4的1、13C NMR信號(hào)歸屬Table 3 1E and 13C nuclear magnetic resonance signal assignment of F4

        信號(hào)歸屬 1 2 3 4 C-5 6 NAc-1 NAc-2 GlcA-H 4.47 3.38 3.59 3.79 3.67 GlcA-C 103.39 72.07 73.34 80.19 76.27 174.96 GalNAc-H 4.57 4.03 4.02 4.75 3.84 3.79 2.04 GalNAc-C 100.65 51.25 75.35 76.23 74.23 60.73 174.38 22.47

        3 結(jié) 論

        本研究以魚鰾為原料,采用酶法提取類肝素,通過(guò)陰離子交換樹脂和醇沉進(jìn)行分離純化,制備出得率較高、結(jié)構(gòu)相對(duì)均一的類肝素組分F4,其得率為(2.21±0.03)mg/g,類肝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(85.79±0.63)%。紫外光譜和HPGPC結(jié)果表明組分F4純度較高;分子質(zhì)量分布相對(duì)集中,約為84 000 u。通過(guò)柱前衍生-HPLC得出組分F4主要含GlcA、GalNAc和少量的IdoA、Gal。組分F4的FTIR譜圖和二糖組成與CSA一致,結(jié)合NMR分析得出組分F4主要結(jié)構(gòu)式為[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]n,屬于CSA。CSA具有免疫調(diào)節(jié)[38]、抗炎[39]、抗氧化[40]和抗腫瘤[41]等活性,主要用于預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎、冠心病、神經(jīng)痛及角膜炎等疾病[11]。本研究可為進(jìn)一步分析魚鰾功能及其作用機(jī)理、提高魚鰾的利用價(jià)值提供參考。

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