周斯儀，鐘賽意,2,3,*，蘇偉明,3，杜振興，陳建平，洪鵬志，章超樺,3,4

（1.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；4.廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

魚(yú)鰾也稱魚(yú)泡、魚(yú)肚或魚(yú)膠等，是魚(yú)類調(diào)節(jié)沉浮的器官。魚(yú)鰾富含膠原蛋白、多糖等活性物質(zhì)，自北魏《齊民要術(shù)》開(kāi)始記載以來(lái)，一直被視為藥食兩用的滋補(bǔ)珍品。《本草綱目》記載魚(yú)鰾有止血作用，可用來(lái)治療吐血、崩漏、外傷出血和產(chǎn)后抽搐等[1]?！侗静菪戮帯贩Q魚(yú)鰾具有養(yǎng)肝益腎、補(bǔ)腎固精的功效[2]。魚(yú)鰾還能滋養(yǎng)經(jīng)脈、散瘀消腫[3]。但其作用功效和物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確。目前對(duì)魚(yú)鰾功能因子研究主要集中在其膠原蛋白和多肽的提取、結(jié)構(gòu)表征及生物活性等方面[4-6]。近幾年有報(bào)道發(fā)現(xiàn)魚(yú)鰾多糖具有預(yù)防結(jié)腸癌、緩解胃潰瘍、系統(tǒng)性紅斑狼瘡炎癥的潛力[7-9]，但目前對(duì)魚(yú)鰾多糖的組成和結(jié)構(gòu)特性尚未明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)鰾多糖以糖胺聚糖為主[10]，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其主要由類肝素化合物組成。

肝素是由糖醛酸與葡萄糖胺組成的聚陰離子黏多糖，作為高效的抗凝血藥物廣泛應(yīng)用于臨床治療。隨著藥理學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)肝素還具有抗血栓、抑制平滑肌細(xì)胞增生、抗炎癥和抗腫瘤等生物活性，但其較高的抗凝血作用容易引起出血副作用，因而限制了其在非抗凝方面的應(yīng)用[11]。類肝素是結(jié)構(gòu)上與肝素結(jié)構(gòu)相似的一類酸性黏多糖，常見(jiàn)的有硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）和硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）等。類肝素抗凝血作用相對(duì)較低，長(zhǎng)期使用無(wú)肝素抗凝血活性引起的副作用。因此類肝素化合物越來(lái)越多地引起研究者關(guān)注。本研究采用酶法提取魚(yú)鰾類肝素（heparinoid from swimming bladder，HSB），并對(duì)其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以期為闡明魚(yú)鰾多糖的結(jié)構(gòu)組成和構(gòu)效關(guān)系提供參考，為魚(yú)鰾功效因子的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚(yú)鰾（鱸魚(yú)，Lateolabrax japonicus）購(gòu)自湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；2709堿性蛋白酶（1.2×105U/g）南寧龐博生物工程有限公司；FPA98 Cl型大孔陰離子交換樹(shù)脂 羅門哈斯（中國(guó)）公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-2,4-dihydro-3H-pyrazol-3-one，PMP）、CS二糖標(biāo)準(zhǔn)品（ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S） 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）德國(guó)Meker公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1300D-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社；HR/T20MM型高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；FD8508型真空冷凍干燥機(jī) 韓國(guó)ilShin公司；Xevo G2-XS QTof高分辨質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀 美國(guó)Waters公司；Agilent1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng) 美國(guó)安捷倫公司；Bruker AV-500和AV-700超導(dǎo)核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國(guó)Bruker BioSpin GmbH公司。

1.3 方法

1.3.1 HSB的制備與分離

參考文獻(xiàn)[11]中肝素的制備工藝并略作調(diào)整，工藝流程為：魚(yú)鰾干粉→酶解→滅酶→離心取上清液→大孔陰離子交換樹(shù)脂吸附洗脫→醇沉→離心收集沉淀→無(wú)水乙醇洗滌2 次→透析→冷凍干燥。

具體步驟：魚(yú)鰾經(jīng)烘干、粉碎后，加入20 倍體積的雙蒸水和質(zhì)量濃度為5.4 mg/mL的蛋白酶，50 ℃水浴鍋中酶解20 h；沸水浴滅酶10 min，冷卻后離心（8 000 r/min、20 min）；取上清液用大孔陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，再分別用0.3、0.5、0.9、1.1 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫；每分鐘收集一管，用阿利新藍(lán)法分析管中類肝素含量，以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)、阿利新藍(lán)法染色所得吸光度（A490nm）為縱坐標(biāo)制作梯度洗脫曲線；收集洗脫液，緩慢加入1 倍體積的無(wú)水乙醇，靜置12 h后離心（4 000 r/min、5 min），收集沉淀，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌2 次；經(jīng)3 kDa透析袋脫鹽，冷凍干燥。

1.3.2 基本成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和HSB得率的測(cè)定

類肝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用阿利新藍(lán)法[12]，以肝素為標(biāo)準(zhǔn)品；蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用福林-酚法[13]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品；糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用咔唑-硫酸法[14]，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品；氨基己糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用改進(jìn)的Wagner法[15]，以葡萄糖胺為標(biāo)準(zhǔn)品；硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用BaCl2-gel比濁法[16]，以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品。HSB得率和各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別按式（1）、（2）計(jì)算。

式中：md1為HSB質(zhì)量/mg；md2為魚(yú)鰾干粉質(zhì)量/g。

式中：ρ為某成分質(zhì)量濃度/（mg/mL）；md3為所稱取HSB質(zhì)量/mg；V為溶液體積/mL。

1.3.3 HSB的種類鑒定

類肝素化合物的結(jié)構(gòu)鑒定采用醋酸纖維素薄膜電泳法，具體步驟參考文獻(xiàn)[17]。

1.3.4 HSB的純度分析

HSB用蒸餾水配成1 mg/mL的溶液，以蒸餾水為調(diào)零管，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定樣品的紫外吸收光譜。

1.3.5 HSB的分子質(zhì)量分析

采用高效凝膠色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測(cè)定HSB的分子質(zhì)量[18]。色譜柱：Ultrahydrogel Column 500糖分析凝膠柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：0.2 mol/L硫酸鈉；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)器為1200示差檢測(cè)器；進(jìn)樣體積：10 μL。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子質(zhì)量分別為10 000、23 800、48 600、80 000、150 000、273 000、409 800 u）和HSB分別用0.2 mol/L硫酸鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm的針式濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的保留時(shí)間并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.6 HSB的單糖組成分析

樣品前處理：稱取樣品3.0 mg于15 mL樣品瓶中，加入1.5 mol/L的三氟乙酸9 mL，置于110 ℃烘箱中分別水解2、4、6、8、12、16、24、28 h，水解液用氮?dú)獯蹈?，蒸干物用超純水溶解，并于?0 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

處理后的樣品和單糖標(biāo)準(zhǔn)品采用PMP衍生-高效液相反相色譜法測(cè)定[19]。單糖標(biāo)準(zhǔn)品：甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、艾杜糖醛酸（iduronic acid，IdoA）、N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）、半乳糖（galactose，Gal）。色譜柱：ZORBAX EclipseXDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）-乙腈溶液（83∶17，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.7 HSB結(jié)構(gòu)的FTIR分析

取2.0 mg樣品，在紅外燈下烘烤2 h，然后放入瑪瑙研鉢中，加入100 倍質(zhì)量的以同樣方式處理的氯化鉀，混合均勻，研磨至顆粒小于2.5 μm，放入壓片機(jī)中加壓制成半透明的小薄片；再將其放入傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrophotometer，F(xiàn)TIR）掃描儀中進(jìn)行光譜掃描，掃描范圍為4 000～400 cm－1。

1.3.8 HSB的二糖組成分析

二糖組成分析參考文獻(xiàn)[20]的方法并稍作修改。精密稱取0.010 0 g多糖樣品，加入5 mL醋酸銨緩沖液（pH 7.6～8.0，含0.2 U CS酶ABC），37 ℃孵育24 h。沸水浴滅酶5 min，10 000 r/min離心25 min。上清液用3 kDa超濾離心管過(guò)濾，取濾液冷凍干燥。將處理后的樣品和CS二糖標(biāo)準(zhǔn)品（ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S）分別用超純水配成1 μg/mL溶液用于MS/MS分析。

MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度200 ℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.9 HSB結(jié)構(gòu)的NMR分析

HSB樣品溶于D2O中，冷凍干燥，反復(fù)3 次以置換出H2O。處理后的樣品用D2O配制成30 mg/mL的溶液，在常溫下用NMR儀進(jìn)行1H譜、13C譜、異核單量子相干（heteronuclear singleqauntum coherence，HSQC）譜和異核多鍵相關(guān)（heteronuclear multiple-bond correlation，HMBC）譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 9.1和ChemBioDraw Ultra軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSB的分離結(jié)果

圖1 類肝素化合物FPA98 Cl型大孔陰離子交換柱洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of heparinoids on FPA98 Cl column

類肝素為聚陰離子酸性黏多糖，在組織中以糖蛋白的形式存在。因此，類肝素的提取以酶法為主，蛋白酶將糖蛋白中的蛋白質(zhì)分解成易于去除的小肽和氨基酸，使類肝素從中釋放出來(lái)。游離在酶解液中的類肝素經(jīng)FPA98 Cl型大孔陰離子交換樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附，再用氯化鈉溶液梯度洗脫，使中性多糖、蛋白質(zhì)和多肽等雜質(zhì)被低濃度的氯化鈉溶液洗脫下來(lái)，帶陰離子基團(tuán)較多的類肝素則被高濃度氯化鈉溶液洗脫下來(lái)。梯度洗脫結(jié)果圖1所示，0.3、0.5、0.9、1.1 mol/L氯化鈉溶液分離出的洗脫液經(jīng)醇沉、透析、冷凍干燥后，得到4 個(gè)組分：F1、F2、F3和F4。各洗脫組分的得率和基本成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表1。

表1 各洗脫組分的HSB得率與基本成分Table 1 Yield and composition of each elution fraction

由表1可知，從組分F1到F4，類肝素、糖醛酸和氨基己糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)遞減，說(shuō)明該方法能將類肝素高效分離出來(lái)。組分F4的HSB得率最高，為（2.21±0.03）mg/g，F(xiàn)2次之；組分F1蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，HSB得率和類肝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)都很低，且檢測(cè)不到糖醛酸和氨基己糖，說(shuō)明組分F1可能為中性糖和蛋白質(zhì)的混合物，梯度洗脫曲線中該組分吸光度高可能受色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的影響。組分F4的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為（12.29±2.20）%，F(xiàn)3次之，其他組分未檢測(cè)到硫酸基。硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)是提示類肝素活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，一定范圍內(nèi)硫酸基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，生物活性越強(qiáng)[21]。Sayari等[17]用海鰲蝦殼提取的類肝素中硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)（23.00±0.03）%，具有較強(qiáng)的抗凝血和抗細(xì)胞增殖作用。

2.2 HSB的種類鑒定結(jié)果

圖2 各洗脫組分及標(biāo)準(zhǔn)品的醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果Fig. 2 Acetate cellulose electrophoresis of each elution fraction and glycosaminoglycan standard

不同種類的糖胺聚糖之間存在電荷密度差異，在醋酸纖維素薄膜電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率。各洗脫組分醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果如圖2a所示，組分F1為單一條帶，遷移率最低，這與其基本成分分析相符，進(jìn)一步驗(yàn)證F1可能是中性糖；組分F2和F3有4 個(gè)條帶，說(shuō)明所含糖胺聚糖種類較多；組分F4為單一條帶，遷移率最大。結(jié)合各組分HSB得率和理化性質(zhì)分析，選擇類肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)低、醋酸纖維素薄膜電泳條帶單一的組分F4做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定。

醋酸纖維素薄膜電泳操作簡(jiǎn)易、靈敏度高，可作為初步鑒別糖胺聚糖種類的方法。在吡啶-甲酸緩沖液（pH 3.0）中，相對(duì)遷移率從小到大依次為透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、DS、CS和肝素[20]。由圖2b可知，肝素因電荷密度最高，遷移率最大；其次分別是CS、DS。組分F4的條帶與CS遷移率相近，初步確認(rèn)組分F4為CS。

2.3 組分F4的純度及分子質(zhì)量

2.3.1 紫外光譜掃描結(jié)果

圖3 組分F4紫外光譜圖Fig. 3 Ultraviolet absorption spectrum of F4

紫外光譜掃描是評(píng)價(jià)類肝素純度的方法之一。類肝素在185～220 nm處有糖基末端的吸收峰[8]，核酸和蛋白質(zhì)分別在260、280 nm處有特征吸收峰。由圖3可知，紫外光譜掃描結(jié)果顯示，組分F4除在204 nm處有糖基末端吸收峰外，在其他紫外區(qū)域無(wú)明顯吸收峰；結(jié)合2.1節(jié)組分F4的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.19±0.07）%，表明F4純度較高。

2.3.2 HPGPC分析結(jié)果

圖4 組分F4的HPGPC圖譜Fig. 4 High performance gel permeation chromatogram of F4

由圖4可知，組分F4的HPGPC圖只出現(xiàn)1 個(gè)峰，且峰形較對(duì)稱，表明F4的質(zhì)量分布相對(duì)均一，純度較高。高效凝膠色譜與示差折光檢測(cè)器聯(lián)用測(cè)得葡聚糖的分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（y）與保留時(shí)間（x）的回歸方程為：y＝－0.319 2x＋9.429 0（R2＝0.996 6），計(jì)算得出組分F4的分子質(zhì)量約為84 000 u。一般類肝素的分子質(zhì)量在5 000～40 000 u范圍之間[22]，相比之下，組分F4的分子質(zhì)量較大。

2.4 組分F4的單糖組成分析結(jié)果

糖胺聚糖由特定的重復(fù)二糖單位構(gòu)成，根據(jù)二糖組成的差異，分為透明質(zhì)酸、HS、肝素、DS和CS。因此，可以根據(jù)單糖組成推測(cè)類肝素黏多糖的種類。對(duì)比單糖混標(biāo)的HPLC圖譜（圖5）發(fā)現(xiàn)，組分F4單糖衍生物（水解時(shí)間8 h）的HPLC圖（圖6）中出現(xiàn)1 個(gè)峰值很高的未知峰。由圖7可知，隨著組分F4水解時(shí)間的延長(zhǎng)，未知峰的峰面積比例減少，GlcA和IdoA的峰面積比例也逐漸減少，GalNAc的峰面積比例不斷升高，說(shuō)明未知峰可能是未降解的寡糖片段。另外，也有報(bào)道稱此處為未降解完全的寡糖片段[23]。這可能是由于半乳糖胺較難水解，有研究表明半乳糖胺比其他單糖需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能完全被降解[19,24]。糖醛酸在酸溶液中不穩(wěn)定，易發(fā)生脫羧反應(yīng)，甚至?xí)粡?qiáng)酸完全分解[25]，因此隨降解時(shí)間的延長(zhǎng)糖醛酸的峰面積比例降低。根據(jù)保留時(shí)間和峰面積比例得出，組分F4主要含GlcA、GalNAc和少量的IdoA、Gal，由此得出其主鏈可能是CS。

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)品單糖衍生物的HPLC圖譜Fig. 5 High performance liquid chromatogram of mixture of monosaccharide derivative standards

圖6 組分F4單糖衍生物的HPLC圖譜Fig. 6 High performance liquid chromatogram of monosaccharide derivatives from F4

圖7 水解時(shí)間對(duì)組分F4降解產(chǎn)物峰面積比例的影響Fig. 7 Effect of hydrolysis time on percentage peak areas of degradation products from F4

2.5 組分F4結(jié)構(gòu)的FTIR分析結(jié)果

圖8 組分F4和CS的FTIR圖Fig. 8 Fourier transform infrared spectra of both F4 and CS

由圖8可知，組分F4的FTIR圖與CS標(biāo)準(zhǔn)品基本一致。3 421 cm－1處出現(xiàn)強(qiáng)而寬的峰是O—H和N—H伸縮振動(dòng)，說(shuō)明組分F4存在分子間和分子內(nèi)的氫鍵[26]；2 918 cm－1處的吸收峰表明存在亞甲基[27]；1 646 cm－1處強(qiáng)而稍寬的峰是乙酰氨基中的C＝O對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，另外，1 557 cm－1處N—H變角振動(dòng)峰和1 419 cm－1處C—N伸縮振動(dòng)峰表明存在乙酰氨基[28-29]；1 377 cm－1處的峰是—COO－中的C＝O對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[27]；1 234 cm－1處不太尖銳的峰可能是C—H變角振動(dòng)；1 255 cm－1處硫酸基中的S＝O伸縮振動(dòng)和852 cm－1處硫酸酯基中的C—O—S軸向伸縮振動(dòng)表明存在硫酸基團(tuán)[35]；927 cm－1處的吸收峰是吡喃糖環(huán)的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[30]。

根據(jù)二糖單位中硫酸基數(shù)量和鏈接位置的不同，CS分為A、C、D、E等種類。A型CS（CSA）的硫酸基在C4位，產(chǎn)生的軸向伸縮振動(dòng)峰在850 cm－1附近；C型CS（CSC）的硫酸基在C6位，硫酸基處于平位，吸收峰在820 cm－1附近[31]。本實(shí)驗(yàn)所用CS標(biāo)準(zhǔn)品為E型CS（CSE），在820 cm－1和850 cm－1附近均有吸收峰。組分F4只在850 cm－1附近有吸收峰，表明F4可能為CSA或其衍生物。

2.6 組分F4的二糖組成分析結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果得出組分F4中主要含CS。為進(jìn)一步分析組分F4的二糖組成，采用CS酶ABC將CS完全裂解成不飽和二糖，再經(jīng)MS/MS分析鑒定。根據(jù)硫酸基團(tuán)數(shù)量及鏈接位置，CS二糖分為ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S等。其中，ΔDi-4S是CSA的主要二糖單位，ΔDi-6S是CSC的主要二糖單位。此外，由于具有相同硫酸基團(tuán)數(shù)量的二糖相對(duì)分子質(zhì)量相同，不能通過(guò)準(zhǔn)離子峰區(qū)分開(kāi)，因此通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子進(jìn)行區(qū)分。組分F4完全降解產(chǎn)物和4 種常見(jiàn)的CS二糖標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS結(jié)果如圖9所示。

圖9 組分F4裂解產(chǎn)物和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS圖Fig. 9 MS/MS spectra of degraded products of F4 and disaccharide standards

圖10 CS二糖碎片基本組成圖[32-33]Fig. 10 Basic composition of chondroitin sulfate disaccharide fragments[32-33]

圖10 為CS二糖碎片的基本組成[32-33]。結(jié)合圖10和表2可知，ΔDi-0S和ΔDi-UA-2S的半乳糖胺不含硫酸基，特征碎片結(jié)構(gòu)是[Z1－2H]－，m/z為202.09；ΔDi-UA-2S的硫酸基連接在葡萄糖醛酸C2的羥基上，因此具有[Y2－H]－和[Z2＋Na－H]－特征碎片結(jié)構(gòu)，其m/z分別為236.99、276.98。ΔDi-4S和ΔDi-6S的區(qū)別體現(xiàn)在，ΔDi-4S在m/z282處的離子相對(duì)豐度小于m/z300或不存在，而ΔDi-6S在m/z300處的離子相對(duì)豐度小于m/z282或不存在[34]。圖9中ΔDi-4S在m/z300.06處的離子相對(duì)豐度大于m/z282.05，ΔDi-6S在m/z282.05處的離子相對(duì)豐度較大，在m/z300.06處沒(méi)有碎片峰。此外，還觀察到ΔDi-6S在m/z239.94處的特征峰，其結(jié)構(gòu)為[W1－H]－，可用來(lái)判斷是否存在ΔDi-6S。組分F4完全降解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖中，在m/z202.09、236.99、276.98處沒(méi)有碎片峰，表明組分F4不含ΔDi-0S和ΔDi-UA-2S；在m/z300.06處的離子相對(duì)豐度大于m/z282.05，且不含ΔDi-6S特征峰m/z239.94，說(shuō)明F4的主要二糖單位為ΔDi-4S。結(jié)合FTIR掃描結(jié)果，確定組分F4主要為CSA。

表2 二糖MS/MS特征碎片峰及其結(jié)構(gòu)Table 2 MS/MS characteristic fragment peaks of disaccharides and their structures of disaccharides

2.7 組分F4結(jié)構(gòu)的NMR鑒定結(jié)果

圖11為組分F4的1H、13C、HSQC和HMBC的NMR譜圖。在1H NMR譜圖中，質(zhì)子信號(hào)最強(qiáng)的峰位于δ4.79處，是氘代水產(chǎn)生的溶劑峰，除此之外，所有質(zhì)子信號(hào)均位于2 個(gè)光譜區(qū)。在δ2.0～2.1之間出現(xiàn)了乙酰胺甲基信號(hào)，文獻(xiàn)[35]報(bào)道CSA和CSC的乙酰胺甲基信號(hào)分別在δ2.04、2.02處，組分F4乙酰胺甲基信號(hào)位于δ2.04，說(shuō)明F4可能為CSA；其他質(zhì)子信號(hào)集中在δ3～5之間，說(shuō)明F4為β-構(gòu)型[36]。

圖11 組分F4的NMR 圖譜Fig. 11 NMR spectraof F4

在13C NMR譜圖中，δ174.96和δ174.35的低場(chǎng)信號(hào)表明存在乙酰氨基和己糖醛酸的羧基；δ22.45的高場(chǎng)信號(hào)可能為乙酰胺甲基碳；其他信號(hào)集中在δ50～105之間。此外，由HSQC譜圖中的（2.04，22.47）和HMBC譜圖（2.04，174.38）確定δ22.47為乙酰氨基的甲基碳信號(hào)，δ2.04為乙酰氨基的甲基質(zhì)子信號(hào)，δ174.38為乙酰氨基的羰基碳信號(hào)。參照文獻(xiàn)[35]和[37]對(duì)組分F4的1H、13C NMR譜進(jìn)行歸屬，結(jié)果如表3所示。對(duì)1H、13C、HSQC和HMBC圖譜進(jìn)行綜合分析，得出組分F4主要結(jié)構(gòu)式為[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]n。

表3 組分F4的1、13C NMR信號(hào)歸屬Table 3 1E and 13C nuclear magnetic resonance signal assignment of F4

表3 組分F4的1、13C NMR信號(hào)歸屬Table 3 1E and 13C nuclear magnetic resonance signal assignment of F4

信號(hào)歸屬 1 2 3 4 C-5 6 NAc-1 NAc-2 GlcA-H 4.47 3.38 3.59 3.79 3.67 GlcA-C 103.39 72.07 73.34 80.19 76.27 174.96 GalNAc-H 4.57 4.03 4.02 4.75 3.84 3.79 2.04 GalNAc-C 100.65 51.25 75.35 76.23 74.23 60.73 174.38 22.47

3 結(jié) 論

本研究以魚(yú)鰾為原料，采用酶法提取類肝素，通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂和醇沉進(jìn)行分離純化，制備出得率較高、結(jié)構(gòu)相對(duì)均一的類肝素組分F4，其得率為（2.21±0.03）mg/g，類肝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（85.79±0.63）%。紫外光譜和HPGPC結(jié)果表明組分F4純度較高；分子質(zhì)量分布相對(duì)集中，約為84 000 u。通過(guò)柱前衍生-HPLC得出組分F4主要含GlcA、GalNAc和少量的IdoA、Gal。組分F4的FTIR譜圖和二糖組成與CSA一致，結(jié)合NMR分析得出組分F4主要結(jié)構(gòu)式為[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]n，屬于CSA。CSA具有免疫調(diào)節(jié)[38]、抗炎[39]、抗氧化[40]和抗腫瘤[41]等活性，主要用于預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎、冠心病、神經(jīng)痛及角膜炎等疾病[11]。本研究可為進(jìn)一步分析魚(yú)鰾功能及其作用機(jī)理、提高魚(yú)鰾的利用價(jià)值提供參考。