楊移斌，艾曉輝，宋 懌，董 靖，胥 寧，姜 蘭

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，俗稱黃臘丁、嘎牙子等，隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)[1]，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的特色淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種[2]。目前黃顙魚主要細(xì)菌性病原包括：遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[3-4]、鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)[5]、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)[6]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[7]、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)[8]、柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)[9]、類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)[10]、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[11]、擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)[12]等。隨著病原呈現(xiàn)多元性發(fā)展，種類不斷增多，而防控手段發(fā)展較慢，導(dǎo)致疾病暴發(fā)時(shí)難以及時(shí)有效控制，給養(yǎng)殖戶帶來經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也成為黃顙魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大瓶頸。

2017年6—7月，湖北省荊州某養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)黃顙魚大規(guī)模腹水病，發(fā)病率50%左右，死亡率高，導(dǎo)致了重大經(jīng)濟(jì)損失。筆者經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、取樣，病樣經(jīng)液氮保存后帶回實(shí)驗(yàn)室分析，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定此次黃顙魚發(fā)病是由細(xì)菌引起的，并進(jìn)行病原相關(guān)研究及藥敏特性分析，為黃顙魚腹水病的防控提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試魚

6尾有典型腹水癥狀的黃顙魚取自湖北荊州某養(yǎng)殖場(chǎng)，魚腹部膨大，肛門有出血潰爛狀，鰓部正常，體表無明顯傷痕。感染用黃顙魚(10±0.5)g購(gòu)于武漢江夏某苗種場(chǎng)，無明顯外傷，健壯活力強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7 d后無異常，用于試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH瓊脂、革蘭氏染色液、藥敏紙片及細(xì)菌生化微量鑒定管均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；谷氨酸鹽淀粉酚紅瓊脂(GSP瓊脂)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；2×Taq PCR Mix、引物由上海生工提供。

1.2 方法

1.2.1 臨床調(diào)查

對(duì)荊州某黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)及周邊環(huán)境、黃顙魚腹的病發(fā)病史及用藥情況進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2 病原菌多樣性分析

在無菌條件下，取6條典型患病黃顙魚置于操作臺(tái)上，使用已滅菌剪刀在黃顙魚肚皮上輕輕戳破，分別將腹水裝入10 mL離心管中。取5 mL腹水樣品，加入20%甘油，混勻后置于-80 ℃冰箱保存待用；另取5 mL樣品，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司抽提DNA，并在Illumina Mi-Seq平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 病原菌分離

基于病原菌多樣性測(cè)序結(jié)果，可知此次暴發(fā)腹水病黃顙魚的腹水中氣單胞菌屬種類占據(jù)極大優(yōu)勢(shì)。用接種環(huán)蘸取保存的腹水劃線于平板上，置于28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落進(jìn)一步純化，純化后的細(xì)菌加入20%甘油保存于-20 ℃?zhèn)溆?。分離菌株暫命名HS01。

1.2.4 人工感染及LD50測(cè)定

將HS01接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用槍頭吸取PBS洗下菌苔至無菌離心管中，參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度分別為5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104CFU·mL-1。

將健康黃顙魚分為6組(A—F)，每組30尾。其中A—E組黃顙魚分別腹腔注射5.0×109、5.0×108、5.0×107、5.0×106與5.0×105CFU·mL-1菌液，每尾0.1 mL，對(duì)照組(F)注射等量PBS。試驗(yàn)期間不投喂，溶氧保持在7.5～8.5，水溫24～26 ℃，使用充分曝氣的自來水進(jìn)行養(yǎng)殖。每5 h觀察黃顙魚動(dòng)態(tài)，尤其注意其游泳姿態(tài)、速度及體表可能出現(xiàn)的癥狀，及時(shí)對(duì)發(fā)病臨死黃顙魚進(jìn)行解剖觀察，并進(jìn)行細(xì)菌再分離。記錄發(fā)病死亡數(shù)，并用概率單位圖解法[13]計(jì)算半致死劑量(LD50)。

1.2.5 分離株HS01的理化特性測(cè)定

將分離株HS01接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，并進(jìn)行革蘭氏染色，采用細(xì)菌微量生化鑒定管參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]測(cè)定分離株的理化指標(biāo)。

1.2.6 分離株的16S rRNA和gyrB基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離株HS01接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于恒溫28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落溶于10 μL無菌水中，即可作為菌液PCR的模板。擴(kuò)增通用引物為27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mix 50 μL，雙蒸水47 μL、上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，共100 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。gyrB基因引物參照Yamamoto等[15]為UP1: 5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′；UP2: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mix 50 μL，雙蒸水 47 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，共100 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。16S rDNA和gryB基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證為目的片段后送生工生物工程(上海)股份有限公司純化及序列測(cè)定。

將分離株HS01的16S rRNA及gryB基因序列放到NCBI里面進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果選取同源性較高的病原菌序列，以及水產(chǎn)重要病原菌序列，采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配分析，通過MEGA6.0軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.2.7 分離株細(xì)菌毒力與耐藥基因分析

以分離菌株的DNA為模板，對(duì)毒力基因溶血素基因(hlyA)[16]、氣溶素基因(aerA)[17]、熱不穩(wěn)定性腸毒素(Alt)[18]，以及絲氨酸蛋白酶(aphA)[19]進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時(shí)對(duì)耐藥基因Sul1[20]、qnrA[21]、ant(3’)-Ia[21]及tetA[21]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列、退火溫度和片段大小見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證為目的片段后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化與測(cè)序。

1.2.8 藥敏特性分析

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinic and laboratory standards institute, NCCLS)抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行分離株HS01的藥敏特性分析[22]。

1.2.9 病理學(xué)分析

取帶有典型腹水癥狀的黃顙魚鰓、肝臟、腎臟、脾臟、肌肉及腸道，用10%的中性福爾馬林固定液固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片(厚度4 μm)，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹脂膠封片后，顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床調(diào)查

此次發(fā)病黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)位于湖北荊州，養(yǎng)殖水面約13.33 hm2，發(fā)病率約50%，死亡率近70%。黃顙魚腹水病發(fā)病期較長(zhǎng)，但死亡時(shí)間集中，死亡量大，病死魚規(guī)格都在50 g上下，經(jīng)濟(jì)損失較大。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖戶曾經(jīng)使用調(diào)水產(chǎn)品及殺蟲藥物，但未進(jìn)行淤泥清除及底泥改良，養(yǎng)殖水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)指標(biāo)要求水平，但有機(jī)物濃度較高，有富營(yíng)養(yǎng)化傾向，水溫24～28 ℃。

表1 基因引物序列

Table 1 Sequence information of primers

引物名稱Primer name序列Sequences(5’-3’)退火溫度Annealing temperature/℃擴(kuò)增長(zhǎng)度Length/bphlyA-FGGCCGGTGGCCCGAAGATACGGG66592hlyA-RGGCGGCGCCGGACGAGACGGGGaerA-FCAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA55309aerA-RACGAAGGTGTGGTTCCAGTAlt-FTGACCCAGTCCTGGCACGGC55442Alt-RGGTGATCGATCACCACCAGCaphA-FATTGGATCCCTGCCTATCGCTTCAGTTCA55911aphA-RGCTAAGCTTGCATCCGTGCCGTATTCCSul1-FFCATTGCCTGGTTGCTTCAT62433Sul1-RATCCGACTCGCAGCATTTqnrA-FATTTCTCACGCCAGGATTTG55516qnrA-RGATCGGCAAAGGTCAGGTCAant(3’)-Ia-FATCTGGCTATCTTGCTGACA55284ant(3’)-Ia-RTATGACGGGCTGATACTGGtetA-FGCTACATCCTGCTTGCCTTC55915tetA-RGCATAGATCGCCGTGAAGAG

2.2 細(xì)菌分離與致病性分析

根據(jù)黃顙魚腹水中細(xì)菌16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果，在屬水平上對(duì)腹水中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，氣單胞菌占明顯優(yōu)勢(shì)。采用氣單胞菌選擇培養(yǎng)基谷氨酸鹽淀粉酚紅瓊脂從黃顙魚腹水中選擇性分離氣單胞菌，從而分離純化HS01菌株。經(jīng)人工感染試驗(yàn)，黃顙魚注射不同濃度的HS01菌懸液后，出現(xiàn)不同程度的死亡(表2)。

感染發(fā)病死亡黃顙魚出現(xiàn)腹部膨大、滿腔腹水及肛門紅腫潰爛的癥狀，與自然發(fā)病癥狀相似(圖1)，并且分離到形態(tài)及理化特性與HS01一致的菌株，由此表明分離株HS01是本次黃顙魚腹水病的病原。參照表2建立死亡率(%)與細(xì)菌劑量對(duì)數(shù)[lg(CFU)]的關(guān)系曲線：y=25.33x-112.14(R2=0.95)，分離株HS01對(duì)黃顙魚半數(shù)致死劑量為2.51×105CFU·g-1。

2.3 細(xì)菌鑒定

分離株HS01革蘭氏染色為紅色，表明其為陰性菌。生理生化指標(biāo)見表3，初步判斷HS01為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)。HS01的16S rRNA及gyrB基因的片段大小分別在1 500、1 000左右(圖2)，符合預(yù)期。將分離菌株HS01 16S rRNA及gyrB基因序列與NCBI中已有序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，HS01與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)同源性最高。選取同源性較高氣單胞菌種類及水產(chǎn)重要病原菌種類的16S rRNA及gyrB基因序列，分別構(gòu)建基于16S rRNA及gyrB基因序列發(fā)育樹(圖3、4)，結(jié)果顯示，分離株均跟嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)聚為一支。因此綜合分離株HS01的理化特性與基因分析結(jié)果，判定分離株HS01是嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)。

表2 分離株對(duì)黃顙魚LD50試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Results of LD50of isolation strain inPelteobagrusfulvidraco

組別Group注射劑量Injected dose/CFU·g-1實(shí)驗(yàn)魚數(shù)量Fish number死亡數(shù)量Amount ofdeath死亡率Mortality/%A5.0×1073030100.00B5.0×106302790.00C5.0×105302066.67D5.0×10430723.33E5.0×1033026.67F03000

圖1 自然發(fā)病(A)和人工感染(B)黃顙魚Fig.1 Image for natural infected (A) and artificial infected (B) Pelteobagrus fulvidraco

2.4 藥敏特性

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株HS01對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物全部耐藥，對(duì)氨基糖疳類及大環(huán)內(nèi)酯類部分耐藥，對(duì)酰胺醇類、四環(huán)素類及喹諾酮類全部高度敏感，對(duì)頭孢類及磺胺類中度或高度敏感(表4)。

參照嗜水氣單胞菌毒力基因Alt、hlyA、aphA及aerA擴(kuò)增的特異性引物進(jìn)行合成，PCR特異性擴(kuò)增只獲得Alt及hly目的片段，大小分別為592、309 bp(圖5)；參照文獻(xiàn)合成耐藥基因引物，對(duì)耐藥基因進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，未獲得目的條帶(圖6)。

M，DL 2 000 maker；a，16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物；b，gyrB基因擴(kuò)增產(chǎn)物。M， DL 2 000 maker; a， PCR product of 16S rRNA；b，PCR product of gyrB.圖2 16S rRNA及gyrB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification results of 16S rRNA and gyrB gene

表3 HS01菌株生理生化特征

Table 3 Physiological and biochemical characteristics of HS01

項(xiàng)目Test itemsHS01嗜水氣單胞菌[14]Aeromonas hydrophila項(xiàng)目Test itemsHS01嗜水氣單胞菌[14]Aeromonas hydrophila吲哚 Indole++阿東醇 Adonitol+-V-P++葡萄糖產(chǎn)氣 Glucose gas production++枸櫞酸鹽 Citrate++葡萄糖產(chǎn)酸 Glucose acid production++賴氨酸脫羧酶 Lysine decarboxylase++水楊苷 Salicin++脲酶 Urease--阿拉伯糖 Arabinose++發(fā)酵 Fermentation++纖維二糖 Cellose--H2S++赤蘚醇 Erythritol--苯丙氨酸脫氨酶 Phenylalanine deaminase--半乳糖 Galactose++氧化酶 Oxidase++甘油 Glycerinum++精氨酸雙水解酶 Arginine dihydrolase++肌醇 Inositol--鳥氨酸脫羧酶 Ornithine decarboxylase--D-山梨醇 D-sorbitol--運(yùn)動(dòng)性 Moveability++麥芽糖 Maltose++明膠水解 Gelatin hydrolysate++D-甘露糖 D-mannose--KCN生長(zhǎng) KCN growth++蜜二糖 Melibiose--丙二酸 Malonic acid--水楊苷 Salicin++甲基紅 Methyl red++海藻糖 Trehalose++

“+”，陽性；“-”，陰性。

“+”， positive; “-”， negative.

圖3 HS01 16S rRNA 基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of HS01 strain and its relatives

2.5 病理學(xué)變化

如圖7所示，患病黃顙魚大量腸上皮細(xì)胞脫落，腸上皮細(xì)胞中可見大小不一的圓形脂滴，腸黏膜中可見多量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7-A)；部分肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)可見大小不一的圓形空泡，少量肝竇輕度淤血(圖7-B)；肌肉中多量肌纖維損傷，肌原纖維數(shù)量減少，排列雜亂(圖7-C)；脾組織中紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，脾竇擴(kuò)張(圖7-D)；鰓絲局部失血，鰓小片中紅細(xì)胞數(shù)量減少，組織中可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7-E)；腎臟腎小球毛細(xì)血管邊可見均勻紅染物質(zhì)，腎小球外可見結(jié)締組織包囊，腎小管上皮細(xì)胞水泡變性，胞體腫脹，胞漿淡染，可見局灶性黑色素沉積(圖7-F)。

圖4 HS01 gyrB基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequence of strain HS01

表4 HS01藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table 4 Antibiotic sensitivity test of strain HS01

藥物Drugs抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)Standard of inhibition zone diameter/mm不敏感Resistant中度敏感Medium sensitivity高度敏感Highly sensitive藥物含量Dose/(g·disc-1)抑菌圈直徑Zonediameter/mm敏感性Sensitivityβ-內(nèi)酰胺類青霉素 Penicillin≤1718～20≥2110 U0Rβ-lactam阿莫西林 Amoxicillin≤1314～17≥18200R頭孢類Cephalosporin頭孢唑肟 Cefazolin oxime≤1415～19≥203035S頭孢拉定 Cefradine≤1415～17≥183016I頭孢噻肟 Cefotaxime≤1415～22≥233024S氨基糖疳類慶大霉素 Gentamicin≤1213～14≥151013IAminoglycosides鏈霉素 Streptomycin≤1112～14≥151014I奈替米星 Netilmicin≤1213～14≥153020S卡那霉素 Kanamycin≤1314～17≥183016I妥布霉素 Tobramycin≤1213～14≥151010R新霉素 Neomycin≤1213～16≥173014I大環(huán)內(nèi)酯類Macrolides阿奇霉素 Azithromycin≤1314～17≥181520S紅霉素 Erythromycin≤1314～22≥231510R四環(huán)素類Tetracyclines四環(huán)素 Tetracycline≤1819～22≥233030S強(qiáng)力霉素 Doxycycline≤1213～15≥163025S喹諾酮類Quinolones依諾沙星 Enoxacin≤1415～17≥181030S諾氟沙星 Norfloxacin≤1213～16≥171028S酰胺醇類Amphenicols氯霉素 Chloramphenicol≤1213～17≥1830035S氟苯尼考 Florfenicol≤1213～17≥187522S磺胺類Sulfonamides磺胺異噁唑 Sulfamisoxazole≤1213～16≥1730013I

S，高度敏感；R，耐藥；U，青霉素的含量以單位計(jì)。

S， highly sensitive; R， resistant; U， penicillin content measured in unit.

3 討論

16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)是基于細(xì)菌16S rRNA基因在功能上的高度保守性及一定程度的高變性來檢測(cè)細(xì)菌種類[23-24]。本試驗(yàn)根據(jù)16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果，利用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)氣單胞菌，在患腹水病瀕死黃顙魚腹水內(nèi)分離到一株致病菌HS01，經(jīng)人工感染試驗(yàn)，確定為本次黃顙魚腹水病病原，通過理化特性測(cè)定及保守基因分型，確定分離株HS01為嗜水氣單胞菌，從而確定本次黃顙魚暴發(fā)溶血性腹水病的病原是嗜水氣單胞菌。16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)的引入使得本結(jié)果更加可信，也解決傳統(tǒng)水生動(dòng)物細(xì)菌性病原確定缺點(diǎn)，是對(duì)傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充與完善。

M，DL 2 000 maker；a、b、c、d分別為Alt、hlyA、aphA、aerA基因擴(kuò)增產(chǎn)物。M， DL 2 000 maker; a, b, c, d represented PCR product of Alt， hlyA， aphA， aerA genes.圖5 分離株HS01的毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Results of PCR amplification of virulence gene of HS01 strain

M，DL 2 000 maker；a、b、c、d分別為Sul1、qnrA、ant (3’)-Ia、tet A基因擴(kuò)增產(chǎn)物。M， DL 2 000 maker; a, b, c, d represented PCR product of Sul1， qnrA， ant (3’)-Ia， tet A genes.圖6 分離株HS01的耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Results of PCR amplification of drug-resistant of HS01 strain

A，腸；B，肝；C，肌肉；D，脾；E，鰓；F，腎。A， Intestines; B， Liver; C， Muscle; D， Spleen; E， Gill; F， Kidney.圖7 病理學(xué)觀察Fig.7 Pathological observation

腹水病是水生動(dòng)物養(yǎng)殖過程中常見及危害較大的一種疾病，可分為溶血性與非溶血性腹水，溶血性腹水病是由細(xì)菌性病原引起，而非溶血性腹水病多是由營(yíng)養(yǎng)代謝障礙引起的。目前已報(bào)道的可發(fā)生腹水病的種類有異育銀鯽[25]、中華鱉[26]、鰱鳙[27]、烏鱧[28]、日本鰻鱺[29]與牛蛙[30]等，大多數(shù)是溶血性腹水病。本研究中，患病黃顙魚主要癥狀表現(xiàn)為腹部膨大，肛門紅腫潰爛，腹腔有大量腹水，而腹水離體幾分鐘后即形成膠體狀，肝腎脾有充血腫大，肝發(fā)黃，腸道無食物，與孫其煥等[25]研究比對(duì)可知，本次黃顙魚疾病是典型的溶血性腹水病。

嗜水氣單胞菌是典型的人-畜-魚共患病病原菌，可導(dǎo)致水生動(dòng)物發(fā)生溶血性腹水病[25-30]。本試驗(yàn)從患病瀕死黃顙魚腹水中分離到的HS01株具有強(qiáng)毒力，含有溶血素及氣溶素基因，氣溶素可以使全身臟器廣泛出血，并破壞宿主細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[31]，溶血素是基因組DNA編碼的毒力因子，形成共聚后插入細(xì)胞膜上，形成管道，導(dǎo)致溶血[32]。對(duì)黃顙魚腹水病病理學(xué)研究，進(jìn)一步佐證了嗜水氣單胞菌對(duì)黃顙魚可以產(chǎn)生較大危害，影響其健康生長(zhǎng)，并能導(dǎo)致大規(guī)模死亡。

雖然現(xiàn)代水生動(dòng)物防控技術(shù)發(fā)展日新月異，但藥物仍是治療患病動(dòng)物的主要手段。本研究中，分離株HS01對(duì)β-內(nèi)酰胺類全部耐藥，對(duì)氨基糖疳類及大環(huán)內(nèi)酯類部分耐藥，對(duì)酰胺醇類、四環(huán)素類及喹諾酮類高度敏感，對(duì)頭孢類及磺胺類中度或高度敏感。經(jīng)特異性PCR擴(kuò)增細(xì)菌磺胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類及四環(huán)素類耐藥基因，并未獲得相應(yīng)片段，表明耐藥的表型與基因型存在一定差異。根據(jù)試驗(yàn)測(cè)得的分離株藥敏特性，在實(shí)際生產(chǎn)中可選擇水產(chǎn)上允許使用的而病原菌對(duì)其又高度敏感的藥物進(jìn)行治療。值得一提的是，我國(guó)幅員遼闊，水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域跨度大，因而養(yǎng)殖環(huán)境、品種及方式差異較大，病原的藥敏特性可能會(huì)存在一定的差距。在水生動(dòng)物疾病防控時(shí)，一定要開展藥物敏感性試驗(yàn)，從而確保治療效果，避免藥物濫用。