常 江，羅 怡，唐 標，張 玲，戴賢君，裘罕琦，楊 華，夏效東

(1.西北農(nóng)林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州 310021； 3.中國計量大學 現(xiàn)代科技學院，浙江 杭州 310018)

大腸埃希菌(Escherichiacoli)是一種常見的革蘭氏陰性短桿菌，周生鞭毛和菌毛，是一種重要的水源和食品糞便污染指示菌[1]。大腸埃希菌常見于人與動物腸道中，是一種條件致病菌，部分大腸埃希菌可以產(chǎn)生腸毒素，使嬰幼兒出現(xiàn)嚴重的腹瀉[2]。目前活禽買賣交易已經(jīng)在國內(nèi)大多數(shù)城市被禁止[3]，冷鮮雞因其肉質(zhì)鮮嫩、口感細膩、營養(yǎng)保留完整等優(yōu)點日益受到消費者的歡迎[4]。然而，抗生素因其促生長及預防疾病的作用被廣泛應用于禽類養(yǎng)殖中，在提高禽肉產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的同時也導致了細菌耐藥性問題的出現(xiàn)，引起了人們極大的關注[5]。大腸埃希菌作為重要的耐藥基因儲藏庫，其攜帶的耐藥基因可以通過食物鏈或直接接觸的方式進行傳播。同時，存在于大腸埃希菌中的耐藥基因可以通過水平基因元件(包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等)等發(fā)生垂直和水平傳播，使得細菌耐藥性發(fā)生進一步的擴散[6-7]。雞肉從養(yǎng)殖到屠宰、運輸再到消費者餐桌上的產(chǎn)業(yè)鏈中會攜帶大量的耐藥細菌，對食品安全和人們的健康產(chǎn)生很大的威脅[8-10]。

本實驗以在對雞肉樣本大腸埃希菌監(jiān)測中分離到的一株多重耐藥大腸埃希菌為研究對象，獲得了其全基因組完成圖并進行了序列分析，預測了其可能的多重耐藥機制。實驗結(jié)果將為雞肉污染微生物耐藥性評估提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大腸埃希菌分離

在浙江省寧波市具有代表性的幾個大型超市及農(nóng)貿(mào)市場中采集冷鮮雞樣品20份，根據(jù)《GB4789.38—2012食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌計數(shù)》初步分離鑒定大腸埃希菌。將采集到的冷鮮雞樣品放入含有10 mL緩沖蛋白胨水(BPW)的無菌袋中，充分混勻，36 ℃培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)得到的BPW增菌液劃線于伊紅美藍(EMB)平板上，36 ℃培養(yǎng)24 h；隨后挑取綠色、具有金屬光澤的單菌落再次劃線于EMB平板，36 ℃培養(yǎng)24 h；之后選取綠色、帶金屬光澤的單菌落劃線于LB平板，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，收集菌體于25%甘油中，-80 ℃條件下保藏備用。

1.2 大腸埃希菌鑒定

將-80 ℃保藏的大腸埃希菌疑似菌株劃線接種于LB平板，36 ℃培養(yǎng)18 h后挑取單菌落，按照VITEK?2 COMPACT 全自動微生物分析系統(tǒng)儀的標準操作流程鑒定大腸埃希菌。首先使用無菌棉簽在LB平板上刮取適量菌落于0.45%氯化鈉中，調(diào)整濁度至0.50～0.63麥氏濁度，然后將菌液放置于充填機中，通過真空泵以負壓形式使菌液均勻分布于細菌鑒定卡片。最后取出細菌鑒定卡放置于系統(tǒng)培養(yǎng)室，同時啟動相關程序。分析結(jié)果大概在8～10 h后顯示[11]。細菌鑒定實驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3 細菌藥敏試驗

使用Biofosun?革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板(Fosun Diagnostics，Shanghai，China)，選擇較常見的16種抗生素。采用美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute of America，CLSI)的M100-S26/M45-A2/M31-A2等文件中推薦的微量肉湯稀釋法測試具有多重耐藥表型的大腸埃希菌分離株對氨芐西林(AMP)、奧格門丁(A/C)、慶大霉素(GEN)、大觀霉素(SPT)、四環(huán)素(TET)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異惡唑(SF)、復方新諾明(SXT)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美羅培南(MEM)、安普霉素(APR)、粘桿菌素(CL)、乙酰甲喹(MEQ)的耐藥能力，參考CLSI(M100-S26/M45-A2/M31-A2)的相關藥敏折點判定標準將耐藥能力分為耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)。

1.4 基因組DNA的提取

菌株接種至LB瓊脂培養(yǎng)基于36 ℃活化培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基于36 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)4 h，收集菌體。使用上海捷瑞細菌基因組DNA提取試劑盒按照說明書步驟提取基因組DNA。

1.5 菌株基因組的測序、組裝與注釋

基因組DNA提取后進行質(zhì)量鑒定，在濃度和純度達到測序要求后，對樣品構(gòu)建1個20 k大片段文庫，使用第三代測序儀PacBio RS Ⅱ?qū)NA進行非擴增長片段測序[12]。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預處理過濾接頭以及去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，采用Celera Assembler組裝軟件[13]用OLC組裝算法，調(diào)試參數(shù)進行序列組裝，利用quiver對組裝結(jié)果進行優(yōu)化[14]。使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline對基因組進行基因預測與功能注釋[15]。將測序得到的全基因組序列及注釋結(jié)果上傳至美國國家生物技術信息中心(NCBI)核酸數(shù)據(jù)庫GenBank上，獲得登錄號(accession number)分別為CP033635(染色體)、CP033632(pTB-nb1質(zhì)粒)、CP033633(pTB-nb2質(zhì)粒)、CP033634(pTB-nb3質(zhì)粒)、CP033636(pTB-nb4質(zhì)粒)。

1.6 菌株全基因組序列分析

使用PlasmidFinder-1.3(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)[16]鑒定菌株攜帶質(zhì)粒的復制子類型。使用ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)[17]預測菌株染色體基因組及質(zhì)粒中的獲得性耐藥基因。VirulenceFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)用于鑒定菌株染色體基因組及質(zhì)粒中攜帶的毒力因子[18]。oriTfinder(http://202.120.12.134/oriTfinder/oriTfinder.html)用于預測菌株質(zhì)?；蚪M中的水平轉(zhuǎn)移元件[19]。

1.7 S1-PFGE

根據(jù)S1-PFGE的標準實驗方法[20]，將ECCNB12-2菌株包埋于瓊脂糖凝膠中，使用S1酶進行酶切，使用XbaⅠ酶酶切沙門氏菌H9812作為marker，電泳參數(shù)設置為2.16～63.8 s，電泳時間為16 h。電泳后膠塊經(jīng)EB染色，脫色后使用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏結(jié)果

細菌耐藥表型鑒定結(jié)果如表1顯示，ECCNB12-2表現(xiàn)對氨芐西林、慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復方新諾明、頭孢噻夫、恩諾沙星、氧氟沙星這10種抗生素耐藥，僅對奧格門丁、頭孢他啶、美羅培南及粘桿菌素敏感。

2.2 基因組分析結(jié)果

大腸埃希菌ECCNB12-2的全基因組序列全長5 539 489 bp，GC含量為50.37%，編碼5 742個蛋白，平均覆蓋深度為122.0×，包含8個5S rRNA、7個16S rRNA、7個23S rRNA和93個tRNA。此外，ECCNB12-2菌株攜帶有4個質(zhì)粒。pTB-nb1質(zhì)粒的大小為147 451 bp，復制子類型為p0111，GC含量為51.38%；pTB-nb2質(zhì)粒的大小為139 752 bp，復制子類型為IncB/O/K/Z，GC含量為51.62%；pTB-nb3質(zhì)粒的大小為82 252 bp，復制子類型為IncFⅡ，GC含量為51.44%；pTB-nb4質(zhì)粒的大小為253 793 bp，復制子類型為IncHI2，GC含量為46.80%。S1-PFGE的結(jié)果與全基因組測序結(jié)果相符合(圖1)。

2.3 獲得性耐藥基因預測

使用ResFinder工具預測ECCNB12-2菌株中可能存在的獲得性耐藥基因。如表2所示，在ECCNB12-2的基因組序列中共檢測到40個獲得性耐藥基因。其中，6個耐藥基因位于染色體基因組上，13個耐藥基因位于pTB-nb1質(zhì)粒上，21個耐藥基因位于pTB-nb4質(zhì)粒上，pTB-nb2和pTB-nb3質(zhì)粒上未檢測到耐藥基因。

表1 ECCNB12-2菌株藥敏試驗結(jié)果

Table 1 Antibiotic resistance phenotypes of ECCNB12-2

抗生素名稱Antibiotic最小抑菌濃度MIC/(μg·mL-1)抗生素折點標準Breakpoint standard of antibiotic/(μg·mL-1)SIR耐藥結(jié)果Antibiotic resistanceresult (R/I/S)氨芐西林Ampicillin512≤816≥32R奧格門丁Augmentin8/4≤8/416/8≥32/16S慶大霉素Gentamicin128≤48≥16R大觀霉素Spectinomycin>512≤3264≥128R四環(huán)素Tetracycline64≤48≥16R氟苯尼考 Florfenicol256≤48≥16R磺胺異惡唑 Sulfisoxazole512≤256≥512R復方新諾明Compound sulfamethoxazole>32/608≤2/38≥4/76R頭孢噻呋Ceftiofur>256≤24≥8R頭孢他啶Ceftazidime1≤48≥16S恩諾沙星Enrofloxacin>32≤0.250.5～1≥2R氧氟沙星Ofloxacin64≤24≥8R美羅培南Meropenem≤0.03≤12≥4S安普霉素Apramycin16————粘桿菌素Colistin0.25≤24≥8S乙酰甲喹Maquindox32————

S，I，R分別表示敏感、中介、耐藥。

S， I， R represented susceptible， intermediate， resistant， respectively.

圖1 ECCNB12-2菌株S1-PFGE電泳結(jié)果Fig.1 S1-PFGE result of ECCNB12-2

2.4 毒力因子預測

研究使用VirulenceFinder工具分析ECCNB12-2基因組序列中可能存在的毒力因子。如表3所示，ECCNB12-2基因組共有12個毒力因子被檢出，其中9個存在于染色體基因組中，2個存在于pTB-nb2質(zhì)粒上，1個位于pTB-nb3質(zhì)粒上，pTB-nb1及pTB-nb4質(zhì)粒無毒力因子檢出。結(jié)果表明，ECCNB12-2菌株中含有多種毒力因子存在，具有對機體造成多種毒力作用的潛力。

2.5 水平轉(zhuǎn)移元件

使用oriTfinder工具，預測了ECCNB12-2菌株的4個質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移元件，包括轉(zhuǎn)移區(qū)起點(oriT)，松弛酶，細菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)基因簇(T4SS)和Ⅳ型偶聯(lián)蛋白(T4CP)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pTB-nb1質(zhì)粒僅含有oriT位點，缺乏松弛酶，T4CP和T4SS；質(zhì)粒pTB-nb2含有oriT位點、松弛酶及T4SS，但缺乏T4CP；質(zhì)粒pTB-nb3含有oriT位點、T4CP與T4SS，但缺乏松弛酶，表明質(zhì)粒pTB-nb1、質(zhì)粒pTB-nb2及質(zhì)粒pTB-nb3具有被誘動轉(zhuǎn)移的潛力[21]。預測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pTB-nb4質(zhì)粒具有完整的包含oriT位點、松弛酶，T4CP和T4SS的水平轉(zhuǎn)移元件，反映了質(zhì)粒pTB-nb4高度的可自主轉(zhuǎn)移潛力[21]。

表2 ECCNB12-2菌株獲得性耐藥基因預測結(jié)果

Table 2 Acquired antimicrobial resistance genes prediction results of ECCNB12-2

獲得性耐藥基因Acquired antimicrobialresistance genes位置Location基因位點Position耐藥表型Antibiotic resistance phenotypeaph(6)-Id染色體Chromosome4520751..4521587氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′)-Ib染色體Chromosome4521587..4522390氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistancemdf(A)染色體Chromosome3187238..3188470大環(huán)內(nèi)酯類-林可胺類-鏈陽菌素類耐藥Macrolides-Lincosamides-Streptogramins resistancefloR染色體Chromosome4516402..4517615苯丙醇類耐藥Phenicol resistancesul2染色體Chromosome4522451..4523266磺胺類耐藥Sulphonamide resistancetet(A)染色體Chromosome4518216..4519490四環(huán)素類耐藥Tetracycline resistanceaph(6)-IdpTB-nb13558..4394氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′)-IbpTB-nb14394..5197氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaac(3)-IIdpTB-nb176546..77406氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′)-IIapTB-nb192946..93740氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaadA1pTB-nb1954..1745氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceblaCTX-M-65pTB-nb1103666..104541β-內(nèi)酰胺類耐藥Beta-lactam resistanceoqxBpTB-nb195402..98554喹諾酮類耐藥Quinolone resistanceoqxApTB-nb198578..99753喹諾酮類耐藥Quinolone resistancefosA3pTB-nb1108385..108801磷霉素耐藥Fosfomycin resistancemph(A)pTB-nb180498..81403大環(huán)內(nèi)酯類耐藥Macrolide resistancesul2pTB-nb15258..6073磺胺類耐藥Sulphonamide resistancetet(A)pTB-nb1136438..137637四環(huán)素類耐藥Tetracycline resistancedfrA1pTB-nb11838..2311甲氧芐啶耐藥Trimethoprim resistanceaadA22pTB-nb4103983..104774氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaadA1pTB-nb4143960..144751氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaadA2pTB-nb483152..83943氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaadA1pTB-nb485557..86348氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaac(3)-IVpTB-nb491662..92435氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(4)-IapTB-nb492664..93689氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′)-IapTB-nb497547..98362氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(6)-IdpTB-nb498698..99534氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′')-IbpTB-nb499534..100337氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceblaTEM-1BpTB-nb4108376..109236β-內(nèi)酰胺類耐藥Beta-lactam resistanceblaOXA-10pTB-nb4143143..143943β-內(nèi)酰胺類耐藥Beta-lactam resistanceqnrS1pTB-nb4137177..137833氟喹諾酮類耐藥Fluoroquinolone resistanceInu(F)pTB-nb4103030..103851林可酰胺類耐藥Lincosamide resistancecmlA1pTB-nb4141619..142878苯丙醇類耐藥Phenicol resistancefloRpTB-nb4148371..149584苯丙醇類耐藥Phenicol resistancecmlA1pTB-nb484205..85464苯丙醇類耐藥Phenicol resistanceARR-2pTB-nb4140846..141298利福霉素耐藥Rifampicin resistancesul3pTB-nb488030..88821磺胺類耐藥Sulphonamide resistancetet(A)pTB-nb4131323..132522四環(huán)素類耐藥Tetracycline resistancetet(A)pTB-nb4146869..147742四環(huán)素類耐藥Tetracycline resistancedfrA14pTB-nb4144826..145299甲氧芐啶耐藥Trimethoprim resistance

3 討論

細菌耐藥性問題是目前存在的非常嚴重的公共安全問題，已經(jīng)不斷有從臨床、食品和環(huán)境中分離到多重耐藥大腸埃希菌的報道。本研究從寧波市市售雞肉樣品中分離到一株大腸埃希菌，藥敏結(jié)果顯示，其對氨芐西林、慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復方新諾明、頭孢噻夫、恩諾沙星、氧氟沙星這10種藥物耐藥，確定其為一株具有較強危害性的多重耐藥大腸埃希菌。

表3 ECCNB12-2菌株毒力因子預測結(jié)果

Table 3 Virulence factors prediction results of ECCNB12-2

毒力因子Virulence factor位置Location基因位點Position蛋白功能Protein functionair染色體Chromosome5140659..5149460腸聚集性免疫球蛋白重復蛋白Enteroaggregative immunoglobulin repeat proteinastA染色體Chromosome5210002..5210118EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxinastA染色體Chromosome4255711..4255827EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxineilA染色體Chromosome5149512..5151209門氏菌同系物Salmonella HilA homologgad染色體Chromosome2289917..2291317谷氨酸脫羧酶Glutamate decarboxylasegad染色體Chromosome5433270..5434670谷氨酸脫羧酶Glutamate decarboxylaseiha染色體Chromosome2580237..2582324粘附蛋白Adherence proteiniss染色體Chromosome2794043..2794351提高血清存活率Increased serum survivallpfA染色體Chromosome5062316..5062888長極性菌毛Long polar fimbriaeastApTB-nb269664..69780EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxinastApTB-nb260775..60891EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxinastApTB-nb322596..22712EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxin

雞肉是多重耐藥菌株的重要載體。只帥等[22]研究表明，雞肉源大腸埃希菌中，多重耐藥大腸埃希菌的分離率高達92.1%，高于豬肉源的75.3%，羊肉源的67.8%以及牛肉源的52.2%。同時，雞肉源高風險多重耐藥菌株的占比相較其他肉類也較大，11重及以上耐藥菌株全部來自于雞肉樣品。本研究的實驗結(jié)果進一步證實了雞肉食品中細菌耐藥問題的嚴重性，相關結(jié)果將為雞肉食品的安全評估提供參考數(shù)據(jù)。

獲得性耐藥基因預測結(jié)果顯示，ECCNB12-2菌株攜帶的獲得性耐藥基因高達40個，與藥敏實驗得到的ECCNB12-2菌株的耐藥表型具有一定對應性，例如aph(6)-Id、aph(3′')-Ib、aac(3)-IId等多個可導致氨基糖苷類耐藥表型的耐藥基因的存在可能是介導菌株表現(xiàn)對慶大霉素和大觀霉素耐藥的主要原因；sul2、sul3等耐藥基因的存在可能是導致菌株表現(xiàn)磺胺異惡唑耐藥表型的主要原因。此外，獲得性耐藥基因預測結(jié)果顯示ECCNB12-2可能具有除監(jiān)測抗生素之外的耐藥表型，例如菌株攜帶的ARR-2耐藥基因的表達可能導致對利福霉素的耐藥性、fosA3耐藥基因可能導致菌株表現(xiàn)磷霉素耐藥表型。這些結(jié)果表明，ECCNB12-2菌株可能具有更廣譜的耐藥表型存在，表明了雞肉樣品中細菌耐藥問題的嚴重性。

ECCNB12-2菌株攜帶有多個高風險的耐藥基因例如blaCTX-M-65、blaTEM-1B。blaCTX-M-65與blaTEM-1B基因會導致菌株獲得超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥表型。近年來，超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥問題十分嚴重，已呈全球流行趨勢[23-24]。本實驗的研究對象ECCNB12-2菌株同時攜帶有兩個導致超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥表型的耐藥基因，可能加重該耐藥表型的嚴重性。

菌株質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移元件預測結(jié)果顯示，所有質(zhì)粒都具有轉(zhuǎn)移至其他菌株的能力，其中pTB-nb4質(zhì)粒攜帶有完整的水平轉(zhuǎn)移元件，具有高度的自主轉(zhuǎn)移潛力。同時獲得性耐藥基因預測結(jié)果表明pTB-nb1質(zhì)粒和pTB-nb4質(zhì)粒是耐藥基因的主要攜帶質(zhì)粒，特別是屬于IncHI2類型的pTB-nb4質(zhì)粒，共攜帶有21個耐藥基因。IncHI2型質(zhì)粒是主要的流行性質(zhì)粒之一，在腸桿菌科中非常常見，具有較高的接合轉(zhuǎn)移效率。同時相關研究報道IncHI2型質(zhì)粒與多重耐藥表型具有一定的相關關系，也是攜帶blaNDM-1、mcr-1等高風險耐藥基因的主要質(zhì)粒類型之一[25-27]。因此，pTB-nb4質(zhì)粒攜帶的耐藥基因具有隨著pTB-nb4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移而發(fā)生廣泛水平傳播的潛力，并可能同時隨著雞肉的產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)生廣泛垂直傳播，嚴重危害公共衛(wèi)生健康。

病原性大腸埃希菌會通過毒力因子作用引起局部或全身感染性疾病，對畜禽養(yǎng)殖及人類健康帶來了嚴重的危害，造成了極大的經(jīng)濟損失[28]。毒力因子預測結(jié)果表明，ECCNB12-2菌株攜帶有多個毒力因子，說明該菌株具有潛在的毒力能力。例如，ECCNB12-2菌株攜帶的iss毒力因子被證明與大腸埃希菌的毒力密切相關，iss基因可以增強大腸埃希菌的血清抵抗力，使菌株在宿主體內(nèi)迅速增殖[29]。同時，ECCNB12-2菌株自身的多重耐藥性增加了其本身對不利環(huán)境的耐受性。因此，ECCNB12-2菌株具有較高的傳播風險性。