尹瀟瀟，李燕方，古 江，廖 艷，謝 躍，楊光友，古小彬，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.眉山市畜牧站，四川 眉山 620000)

癢螨病是由癢螨科(Psoroptidae)、癢螨屬(Psoroptes)的綿羊癢螨(P.ovis)寄生于綿羊、山羊、兔、水牛等家養(yǎng)動(dòng)物及麋鹿等野生動(dòng)物體表[1-2]，引起的以結(jié)痂、脫毛、瘙癢為主要特征的慢性傳染性皮膚病[3-5]，可造成養(yǎng)殖業(yè)重大的經(jīng)濟(jì)損失，帶來嚴(yán)重的動(dòng)物福利問題，同時(shí)威脅野生動(dòng)物的生存[6]。

中國(guó)養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展迅速，家兔飼養(yǎng)量達(dá)7億只以上，占全球飼養(yǎng)總量的40%以上[7]。癢螨病是危害我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)的一種常見外寄生蟲病，在我國(guó)23個(gè)省中流行，死亡率高達(dá)70%[8]。目前，對(duì)我國(guó)各地綿羊癢螨(兔亞種)種群的種群變異、種群結(jié)構(gòu)域基因交流信息的了解較少，而這些信息對(duì)于研究綿羊癢螨(兔亞種)的動(dòng)態(tài)歷史及對(duì)養(yǎng)兔業(yè)中癢螨病的控制與消除是非常關(guān)鍵的。線粒體基因因其遺傳穩(wěn)定性好、進(jìn)化速率快，可用于癢螨遺傳分化、遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究[9]。本研究基于線粒體ATP6基因全序列分析，旨在探討我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)的遺傳變異程度及遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 綿羊癢螨(兔亞種)樣品來源

從我國(guó)各地自然感染癢螨病的獺兔和肉兔耳部采集結(jié)痂，收集在潔凈的平皿中，于37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min，除去痂皮，收集蟲體并鑒定[10]，最終獲得88個(gè)癢螨蟲株(表1)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)

從綿羊癢螨(兔亞種)的線粒體基因組(GenBank No. KJ957822.1)獲得ATP6基因全序列，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物：ATP6-F: 5′-AGAGTGTAAAAACTAACTGTTCCAA-3′；ATP6-R: 5′-TAATCACCCCCAAAGCAAAA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 單個(gè)蟲體DNA的提取

取出-20 ℃保存的88份癢螨樣品，參考文獻(xiàn)[11]的方法，采用OMEGA公司Mollusc/Arthropod基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行單個(gè)蟲體基因組DNA提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：Mixture 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，雙蒸水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)不同種群樣品采集情況表

Table 1 Sampling sites ofPsoroptesovisvar.cuniculipopulations in China

種群組 Population group省份 Province采樣點(diǎn) Sampling site樣本數(shù) Sample size編號(hào) No.兔種類 Species西南地區(qū) Southwest China四川 Sichuan德陽 Deyang3XN1～XN3獺兔四川 Sichuan眉山 Meishan1XN4肉兔四川 Sichuan資陽 Ziyang7 XN5～XN11肉兔四川 Sichuan雅安 Yaan4XN12～XN15肉兔云南Yunnan昆明 Kunming10XN16～XN25獺兔西北地區(qū) Northwest China陜西Shaanxi寶雞 Baoji19XB1～XB19獺兔華中地區(qū) Central China湖北 Hubei荊州 Jingzhou8HZ1～HZ8獺兔河南 Henan開封 Kaifeng13HZ9～HZ21獺兔華北地區(qū) North China河北 Hebei保定 Baoding9HB1～HB9獺兔華東地區(qū) East China山東 Shandong濟(jì)南 Jinan14H1～HD14肉兔

擴(kuò)增結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將條帶大小符合預(yù)期的膠塊切下，經(jīng)膠回收(天根普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，編號(hào)：P4418)、膠回收產(chǎn)物連pMD19-T載體、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞、藍(lán)白斑篩選出陽性克隆，交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行正反向測(cè)序。

1.5 序列分析

1.5.1 遺傳多樣性分析

測(cè)序序列經(jīng)DNAMAN 5.2軟件拼接、比對(duì)，經(jīng)DNASTAR 5.1軟件剪切[12]，通過MEGA5.0軟件計(jì)算核酸分歧度(nucleotide divergence，Dxy)、平均核苷酸差異指數(shù)(average index of nucleotide difference，K)和遺傳距離[13]，運(yùn)用DnaSP 5.1軟件計(jì)算核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)和單倍型數(shù)(number of haplotypes，H)[14]，運(yùn)用Arlequin 3.1軟件作分子方差分析(AMOVA)計(jì)算出種群間遺傳差異指數(shù)(Fst)，基因流(Nm)經(jīng)下列公式計(jì)算：Nm=1/4(1/Fst-1)[15]。

1.5.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Arlequin 3.5軟件計(jì)算中性檢驗(yàn)值(neutrality tests)結(jié)果(Tajima’sDtest，F(xiàn)u’sFStest)[15]，DnaSP 5.0軟件分析錯(cuò)配分布曲線[14]。以歐洲屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，GenBank No. GQ469891.1)為外群，MEGA 5.1軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹[13]，為檢驗(yàn)聚類樹置信度bootstraps 1 000次，同時(shí)結(jié)合Network 5.0軟件作單倍型網(wǎng)絡(luò)圖[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊癢螨(兔亞種)ATP6基因全序列的堿基組成及變異

88個(gè)綿羊癢螨(兔亞種)樣品全部擴(kuò)增成功，且測(cè)序獲得ATP6基因全序列，88條ATP6序列長(zhǎng)度均為672 bp，堿基平均組成由高到低分別是：T(45.53%)>A(22.92%)>G(17.82%)>C(13.73%)，表現(xiàn)出明顯的AT偏倚性(68.45%)。88條ATP6序列共有60個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)28個(gè)，單變異位點(diǎn)32個(gè)。

2.2 種群遺傳多樣性

如表2所示，我國(guó)5大地區(qū)綿羊癢螨(兔亞種)種群的單倍型數(shù)(H)為41，單倍型多樣性(Hd)范圍為0.828 57(華中種群)～0.964 91(西北種群)，種群整體單倍型多樣性(Hd)為0.925 81，表明種群?jiǎn)伪缎投鄻有载S富。5個(gè)種群中，核苷酸多樣性(π)最低的是華東種群(0.005 82)，西北種群最高(0.016 96)，種群整體核苷酸多樣性表現(xiàn)較高水平(0.014 94)。我國(guó)5大地區(qū)種群的平均核苷酸差異指數(shù)(K)范圍為8.166 67(華北種群)～11.397 66(西北種群)(表2)。

2.3 種群分化和遺傳結(jié)構(gòu)

如表3所示，我國(guó)西北種群與西南種群遺傳距離最大0.016 47，且差異極顯著(P<0.001)；華北種群與華中種群遺傳距離最小0.012 28，且差異極顯著(P<0.001)；核酸分歧度范圍為0.014 49(華東種群與華北種群)～0.017 63(西北種群與西南種群)，整體表現(xiàn)與遺傳距離的大小相一致。AMOVA分子變異分析顯示，我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)種群變異來源分別為種群內(nèi)部(97.92%)與種群間(2.08%)，可見種群內(nèi)分子遺傳變異主要來自于種群內(nèi)部。

表2 綿羊癢螨(兔亞種)種群遺傳多樣性參數(shù)

Table 2 Genetic diversity indexes ofP.ovisvar.cuniculipopulations in China

同列數(shù)據(jù)中“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。下表同。

In the same line， “*”indicatedP<0.05， “**” indicatedP<0.01, “***” indicatedP<0.001. The same as below.

表3 我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)各地理種群間的核酸分歧度(上三角)與遺傳距離(下三角)

Table 3 Pairwise comparisons of the nucleotide divergence (above triangle) and genetic distance (below triangle) between geographical populations ofP.ovisvar.cuniculiin China

種群 Populations華東 East China華中 Central China華北 North China西北 Northwest China西南 Southwest China華東地區(qū) East China0.015 180.014 490.015 670.015 84華中地區(qū) Central China0.014 81???0.015 280.016 510.016 52華北地區(qū) North China0.015 06???0.012 28???0.015 360.016 96西北地區(qū) Northwest China0.015 57???0.015 20???0.015 15???0.017 63西南地區(qū) Southwest China0.014 88???0.015 55???0.016 03???0.016 47???

如表4所示，我國(guó)5個(gè)地理種群間的Fst值為-0.044 52～0.106 12，以華北與西南種群間的遺傳分化最高(Fst=0.106 12)，西南、華北種群間基因交流程度最低(Nm=2.105 83)。我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)種群的總Fst值為0.020 81，總基因流11.763 5，表明我國(guó)種群內(nèi)存在頻繁的基因交流。

2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)分析

中性檢驗(yàn)結(jié)果見表2，所有種群的Tajima’sD值均為正數(shù)。華中、西北種群的Fu’sFs值為負(fù)值(-1.138 47和-2.714 84)，且差異不顯著(P>0.05)，其余3個(gè)種群Fu’sFs值均為正值，說明5個(gè)種群在歷史進(jìn)化過程中均沒有經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。種群整體的Tajima’sD值和Fu’sFs值均為正值(0.937 98和0.522 06)，且差異都不顯著(P>0.05)。核苷酸不配對(duì)差異分布曲線圖具有多峰現(xiàn)象(圖1)，說明我國(guó)5個(gè)綿羊癢螨(兔亞種)種群在進(jìn)化過程中穩(wěn)定，無種群擴(kuò)張事件。

2.5 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖及進(jìn)化樹分析

從構(gòu)建的NJ樹可見(圖2)，外群歐洲屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，GenBank No. GQ469891.1)明顯區(qū)分于綿羊癢螨(兔亞種)種群?jiǎn)为?dú)成一支，而綿羊癢螨(兔亞種)蟲株被分為2個(gè)大支，且5個(gè)種群的單倍型在2個(gè)大支中都有分布。

表4 我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)各地理種群間基因流(上三角)與遺傳分化度(下三角)

Table 4 Gene flow (above triangle) and genetic variation index values (below triangle) among 5 populations ofP.ovisvar.cuniculiin China

種群 Populations華東 East China華中 Central China華北 North China西北 Northwest China西南 Southwest China華東地區(qū) East China3.850 242.342 59∞∞華中地區(qū) Central China0.060 97∞∞3.622 30華北地區(qū) North China0.096 43-0.044 5235.728 182.105 83西北地區(qū) Northwest China-0.028 81-0.004 250.008 07∞西南地區(qū) Southwest China-0.025 300.064 560.106 12?-0.006 75

圖1 基于線粒體ATP6基因的綿羊癢螨(兔亞種)種群核苷酸不配對(duì)差異分布曲線圖Fig.1 The distribution curve of nucleotide mismatch in P.ovis var. cuniculi population based on mitochondrial ATP6 gene

單倍型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明，5個(gè)種群未出現(xiàn)基于地理位置的聚集，即綿羊癢螨(兔亞種)沒有形成基于地理分布的遺傳變化(圖2)。由單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可知(圖3)，大部分種群?jiǎn)伪缎筒⑽磳?duì)應(yīng)地理位置，所有單倍型以星狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分布共享，大部分單倍型以5個(gè)單倍型(T1、T6、T7、T16、T24)為中心輻射分布，其中T6可能是最為原始的單倍型，并進(jìn)化形成其它單倍型。整體單倍型分布聚類情況與NJ進(jìn)化樹類似，說明我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)種群間未形成基于兔品種、溫度帶或地域來源的種群結(jié)構(gòu)。

CC，華中地區(qū)；NWC，西北地區(qū)；NC，華北地區(qū)；EC，華東地區(qū)；SWC，西南地區(qū)。CC， Central China; NWC， Northwest China; NC， North China; EC， East China; SWC， Southwest China.圖2 基于線粒體ATP6基因單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor Joining (NJ) tree developed by haplotypes based on mitochondrial ATP6 gene

圓圈的大小與單倍型的分布頻率成正比。The circle sizes were proportional to the distribution frequency of haplotype.圖3 基于線粒體ATP6基因構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Haplotype network map based on mitochondrial ATP6 gene

3 討論

寄生蟲的生活史、宿主種類、生活習(xí)性、外環(huán)境、人類活動(dòng)等因素均會(huì)影響其種群變異與種群結(jié)構(gòu)[17-19]。綿羊癢螨作為廣宿主寄生的全球性流行外寄生蟲，其種群變異與種群結(jié)構(gòu)研究非常有限。mtDNA以其嚴(yán)格的母系遺傳和較快的進(jìn)化速率[20]，能夠全面地反映種群間和種群內(nèi)的遺傳差異[21-22]。母系遺傳可促使有利的突變迅速地形成、分離和表達(dá)，并迅速在該群體中得到富集，有利于探查自然選擇在mtDNA留下的印記[23]。另外，ATP6、Cytb基因?qū)ψ匀贿x擇的作用較為敏感[24]，已見有學(xué)者將Cytb基因用于綿羊癢螨(兔亞種)種群的相關(guān)研究[25]。因此，本實(shí)驗(yàn)基于綿羊癢螨線粒體ATP6基因全序列探究我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)種群的遺傳多樣性，以期為癢螨病的合理防控提供基礎(chǔ)資料。

截止2018年12月，GenBank中未見綿羊癢螨(兔亞種)的ATP6基因序列，故而本研究?jī)H對(duì)我們擴(kuò)增得到的88條ATP6序列進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，綿羊癢螨(兔亞種)具有較高的單倍型多樣性，且種群整體的遺傳多樣性水平較高。88個(gè)癢螨樣本來自于我國(guó)7個(gè)省的10個(gè)采樣點(diǎn)，而這10個(gè)采樣點(diǎn)當(dāng)?shù)氐钠骄鶜夂?、降雨量、光照等自然因素均有差異，由此可見，高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性可能有利于各地的綿羊癢螨(兔亞種)發(fā)生進(jìn)化，從而更好地適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境而存活下來[26]。

分析種群遺傳距離可知，種群間的遺傳距離和地理距離未表現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。采用固定指數(shù)法度量種群間的遺傳分化程度[27-28]時(shí)，我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)種群存在廣泛的基因交流，且遺傳分化較弱。本研究的各地種群間地理距離較大，且各種群間有山川、河流等天然屏障隔離，單靠癢螨蟲體的移動(dòng)來完成不同地理種群間的基因交流較難。綿羊癢螨個(gè)體較小，其離開宿主體后最長(zhǎng)能存活18.8 d[29]，癢螨離開宿主后，5 min內(nèi)的最長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)距離不超過3 cm[30]。

本研究中，長(zhǎng)距離癢螨種群間的頻繁基因交流可能與以下因素有關(guān)：(1)我國(guó)各省間兔的頻繁調(diào)運(yùn)。以四川省為例，四川肉兔的消費(fèi)占全國(guó)30%，每年需要從山東、陜西、云南等地調(diào)入兔只，尤以山東調(diào)入最多，這種頻繁的調(diào)運(yùn)導(dǎo)致四川與山東兩地兔體寄生的癢螨群體間進(jìn)行基因交流的機(jī)會(huì)增大，從而可能導(dǎo)致西南種群與華東種群的基因交流趨于無窮大。(2)我國(guó)養(yǎng)殖戶的養(yǎng)兔模式和癢螨的生活史。我國(guó)養(yǎng)兔場(chǎng)多以兔自然交配的形式繁殖后代，兔的交配增加了不同癢螨群體的接觸機(jī)會(huì)，從而增加群體間的基因交流機(jī)會(huì)；同時(shí)，癢螨屬于終生寄生蟲，其整個(gè)生活史均在宿主體完成，這種呈群居生活且同一群體內(nèi)交配繁殖的特性，可增加群體間的基因交流，降低分化度，這點(diǎn)在線蟲中亦得到證實(shí)[17]。(3)綿羊癢螨宿主范圍廣泛。已有研究證實(shí)，分離自兔的癢螨可感染牛，分離自綿羊的癢螨可以感染牛和家兔[31-32]，這種宿主的廣譜性可增加基因流動(dòng)與交流。

我國(guó)癢螨整體種群的中性檢測(cè)Tajima’sD和Fu’sFs檢驗(yàn)結(jié)果均為不顯著的正值，歧點(diǎn)分布為明顯的雙峰分布，表明中國(guó)地區(qū)的綿羊癢螨種群在長(zhǎng)期的歷史上一直處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)，種群早期可能并未經(jīng)歷過群體擴(kuò)張[33]。NJ進(jìn)化樹顯示，我國(guó)綿羊癢螨各種群的單倍型并未基于地理來源聚類，而是混雜分布，未形成明顯的系統(tǒng)地理格局，這點(diǎn)在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中亦得到進(jìn)一步的證實(shí)。由此可見，我國(guó)綿羊癢螨(兔亞種)種群未形成基于兔品種、溫度帶或者地理來源的種群遺傳結(jié)構(gòu)，與趙習(xí)彬等[25]研究的結(jié)論一致，這可能與癢螨在我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)中的高流行率及蟲體高密度寄生有關(guān)[8]。癢螨在養(yǎng)兔業(yè)中廣泛的流行率和蟲體高密度的寄生方式導(dǎo)致種群遺傳結(jié)構(gòu)的缺乏，這點(diǎn)在微細(xì)毛圓線蟲(Trichostrongylustenuis)的種群遺傳研究中得到證實(shí)[34]。