陳勇 李曉可 應(yīng)穎 黃海燕 鄒榮鑫 褚贊波

痛風(fēng)是單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）沉積在關(guān)節(jié)腔、腎臟、軟組織、軟骨等處所致的晶體相關(guān)性疾病，與嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥相關(guān)，臨床上主要表現(xiàn)為特征性急性關(guān)節(jié)炎。痛風(fēng)可分為原發(fā)性痛風(fēng)和繼發(fā)性痛風(fēng)，原發(fā)性痛風(fēng)目前病因尚未十分明確，通常認(rèn)為是由遺傳因素和環(huán)境因素共同致病，原發(fā)性痛風(fēng)具有一定的家族遺傳性，可能與多基因遺傳有關(guān)[1-2]。DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基團(tuán)，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，將胞嘧啶-磷酸-鳥苷酸（CpG）二核苷酸的胞嘧啶甲基化為5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一種化學(xué)反應(yīng)[3]。研究表明，DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中的作用與腫瘤、衰老等相關(guān)。本研究通過對(duì)組間差異甲基化位點(diǎn)的分析，了解基因甲基化參與的生物學(xué)過程及調(diào)控的信號(hào)通路，探究與痛風(fēng)之間的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016年8月至2017年2月就診于中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院門診的3例原發(fā)性痛風(fēng)患者作為痛風(fēng)組，平均年齡33（33,44）歲，均為漢族男性、痛風(fēng)初次發(fā)作，符合2015年ACR/EULAR制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，無(wú)長(zhǎng)期降尿酸藥物使用史。選取同期體檢中心健康體檢者3例作為對(duì)照組，平均年齡43（39,44）歲，均為漢族男性，無(wú)痛風(fēng)或高尿酸血癥家族史。兩組均排除其他風(fēng)濕性疾病、癌癥、精神病、腎病病史，且均無(wú)血緣關(guān)系。本研究已通過中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取兩組研究對(duì)象空腹外周靜脈血2ml于EDTA管中，使用QIAamp DNA試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）提取全基因組DNA。吸取20μl蛋白酶K加入1.5ml干燥滅菌離心管底部，加入200μl血液，再加入200μl Buffer AL后混勻，56℃水浴鍋中孵育10min。轉(zhuǎn)移至離心柱并加入200μl的無(wú)水乙醇（96%～100%）混勻，6 000g 離心 1min；加入 500μl Buffer AW1，6 000g離心 1min；加入 500μl Buffer AW2，20 000g 離心 3min；離心柱置于另一2ml收集管上6 000g離心1min。最后將離心柱放置于1.5ml收集管中，加入100μl Buffer AE，室溫靜置 1min，6 000g離心 1min。封閉 1.5ml收集管，標(biāo)記標(biāo)本號(hào)。

1.2.2 DNA測(cè)定 采用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度及純度，清潔測(cè)量臂并抽取3μl Buffer AE校準(zhǔn)，抽取3μl DNA樣本置于下層測(cè)量底座上進(jìn)行測(cè)量。DNA樣本吸光度 260/280，比值在 1.7～2.0，濃度 50～100ng/μl，總量＞1μg。

1.2.3 DNA 修飾 采用 Zymo EZ DNA Methylation Kit試劑盒（美國(guó)Zymo公司）對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。根據(jù)試劑盒說明準(zhǔn)備試劑，抽取20μl DNA標(biāo)本（濃度稀釋至 10～25ng/μl）及 130μl CT Conversion Reagent置于PCR管中混勻，并將 PCR管置于PCR儀中，在95℃30s、50℃1h條件中進(jìn)行16個(gè)循環(huán)。在離心柱中加入600μl M-Binding Buffer及PCR樣本后離心；加入100μl M-Wash Buffer后＞10 000g離心30s；再加入200μl M-Desulphonation Buffer室溫放置15min后＞10 000g離心30s；加入200μl M-Wash Buffer后＞10 000g離心30s，操作2次；最后將離心柱置于1.5ml收集管上，加入 12μl M-Elution Buffer，轉(zhuǎn)速＞10 000g 離心 30s。

1.2.4 DNA擴(kuò)增、斷裂、雜交 以下部分交由北京怡美通德科技發(fā)展有限公司完成并分析。使用PCR技術(shù)擴(kuò)增后將DNA片段化，片段化的DNA沉淀回溶，與Methylation 850k基因芯片（美國(guó)Infinium公司）進(jìn)行雜交。使用芯片掃描軟件iscan對(duì)芯片灰度掃描，掃描結(jié)果使用GenomestudioV2011（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行分析。

1.2.5 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控 對(duì)每個(gè)樣品提供12 332個(gè)probe作為質(zhì)控項(xiàng)目，包括 Staining、Extension、Target Removal、Hybridization、Stringency、Non-sepecific Binding、Non-ploymorphic等，結(jié)果符合正常實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，芯片狀態(tài)正常。

1.3 數(shù)據(jù)處理 對(duì)芯片灰度進(jìn)行掃描，可以得到芯片上每個(gè)甲基化點(diǎn)非甲基化探針和甲基化探針強(qiáng)度的原始信號(hào)值，經(jīng)過美國(guó)Illumina公司提供的方法進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，得到甲基化點(diǎn)的水平值（Avg_Beta），Detection Pval等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R2.15.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)差異CpG點(diǎn)進(jìn)行聚類分析；對(duì)差異甲基化點(diǎn)所在的基因作Gene Ontology分析，并采用京都基因和基因百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Pathway分析。Gene Ontology分析中進(jìn)行 FDR 校正（FDR＜0.05）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異甲基化位點(diǎn)分析 痛風(fēng)組與對(duì)照組相比，共有20 426個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平發(fā)生改變，涉及10 063個(gè)基因，如 PTPRN2、MAD1L1、INPP5A、DIP2C、GNAS等。其中有5 719個(gè)高甲基化位點(diǎn)，14 707個(gè)低甲基化位點(diǎn)，低甲基化位點(diǎn)約占差異性位點(diǎn)的72%。其中參與嘌呤代謝的包括 POLE4、NME1-NME2、NME2、ITPA、PDE、ENTP6、APRT、ALLC 等。在差異性甲基化位點(diǎn)中隨機(jī)選取5 000個(gè)，對(duì)其水平值進(jìn)行聚類分析（圖1，見插頁(yè)），發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)組較對(duì)照組存在更多的低甲基化位點(diǎn)，而對(duì)照組存在較多高甲基化位點(diǎn)。

2.2 Gene Ontology分析 隨機(jī)選取差異性甲基化CpG位點(diǎn)涉及的1 000個(gè)基因進(jìn)行Gene Ontology分析，包括生物學(xué)過程（biological process，BP）（表 1）、細(xì)胞組成以及分子功能，結(jié)果按P值排序排列（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）。參與的生物學(xué)過程主要為調(diào)控小GTPase介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)形成、親同抗原的細(xì)胞黏附以及神經(jīng)元的分化等；細(xì)胞組成有13個(gè)，如細(xì)胞投射、細(xì)胞組成、突觸形成、細(xì)胞連接以及神經(jīng)元投射等；分子功能有18個(gè)，如蛋白結(jié)合、GTPase活性調(diào)控、核苷三磷酸活性調(diào)控、酶活性調(diào)控以及離子結(jié)合等。

2.3 Pathway分析 痛風(fēng)組與對(duì)照組差異性甲基化CpG位點(diǎn)涉及的1 000個(gè)基因在KEGG映射中，有35個(gè)通路差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2），如磷酸酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、脂肪信號(hào)因子細(xì)胞通路、趨化因子細(xì)胞通路、Notch信號(hào)通路及FcγR介導(dǎo)的吞噬作用等。

表1 痛風(fēng)組與對(duì)照組差異甲基化基因Gene Ontology分析

3 討論

DNA甲基化在不改變核苷酸序列的情況下使基因表達(dá)水平發(fā)生改變，從而產(chǎn)生可遺傳的表型，與人類疾病有著密切關(guān)系[5]。脊椎動(dòng)物中，約半數(shù)基因在啟動(dòng)子區(qū)上有著富含CG的序列，稱為CpG島。多種因素均可以影響含CpG島啟動(dòng)子區(qū)的活性。CpG島上胞嘧啶C甲基化后，可以通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)等，進(jìn)而起到抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用[6]。甲基化芯片可以進(jìn)行高通量的分析，對(duì)少量基因組DNA進(jìn)行快速檢測(cè)，從而進(jìn)行分析基因的甲基化狀態(tài)。本研究通過甲基化芯片技術(shù)，對(duì)痛風(fēng)患者及健康體檢者進(jìn)行全基因組的分析，篩選出差異性甲基化位點(diǎn)，根據(jù)甲基化位點(diǎn)對(duì)相關(guān)基因參與的生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組成及信號(hào)通路進(jìn)行分析，從而探究基因甲基化與痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系。

表2 痛風(fēng)組與對(duì)照組差異甲基化基因Pathway分析

基因異常甲基化與痛風(fēng)的發(fā)展具有相關(guān)性，已有研究發(fā)現(xiàn)在痛風(fēng)患者中，基因UMOD的甲基化水平明顯高于正常人[7]，而NRBP1的啟動(dòng)子區(qū)呈低甲基化[8]，CCL2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平亦偏低[9]。通過聚類分析，筆者發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)組與對(duì)照組相比基因甲基化水平存在明顯差異，其中CpG低甲基化位點(diǎn)約占差異性位點(diǎn)的72%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，痛風(fēng)組基因組中參與嘌呤代謝的基因，如POLE4、NME1-NME2、NME2等基因呈高甲基化，而ITPA、PDE、ENTP6、APRT等呈低甲基化狀態(tài)。其中，痛風(fēng)組基因組中參與嘌呤代謝的PDE1C亦呈低甲基化狀態(tài)（P＜0.01），筆者認(rèn)為這些基因的低甲基化可能增加基因表達(dá)，從而使嘌呤代謝產(chǎn)物一部分轉(zhuǎn)化為尿酸，引起體內(nèi)尿酸水平的升高。

尿酸沉積引起的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎與趨化因子引起的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)，尿酸鹽晶體可以激活NLRP3炎性體，引起IL-1β分泌，從而刺激中性粒細(xì)胞細(xì)胞的活化，使其釋放大量的促炎因子及趨化因子，在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及細(xì)胞因子等的作用下，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。Gene Ontology分析和Pathway分析顯示，痛風(fēng)組與對(duì)照組相比，發(fā)生差異性甲基化基因參與的通路有趨化因子細(xì)胞通路、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路等炎性通路。筆者認(rèn)為上述通路基因的差異性甲基化可以引起炎癥因子水平升高，可能與痛風(fēng)性的急性發(fā)作有關(guān)。

尿酸是人體內(nèi)天然的抗氧化劑、自由基清除劑，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)可能具有一定的保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)，尿酸水平可能與帕金森病、阿爾茨海默病以及肌萎縮側(cè)索硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病相關(guān)[11-13]。在Gene Ontology和Pathway分析中，痛風(fēng)組及對(duì)照組之間差異性甲基化基因分布參與了神經(jīng)系統(tǒng)的形成、發(fā)育以及突觸形成、神經(jīng)元投射等，還參與了膠質(zhì)瘤通路。根據(jù)本次研究結(jié)果，筆者認(rèn)為痛風(fēng)的發(fā)病與神經(jīng)系統(tǒng)疾病在基因水平上可能有聯(lián)系，但在此方面研究較少，需進(jìn)一步研究探討。

此次研究樣本量較少，需要選取相關(guān)基因擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，從而為探討DNA甲基化在痛風(fēng)發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。同時(shí)此次研究?jī)H對(duì)痛風(fēng)患者和健康體檢者基因的差異性甲基化進(jìn)行了分析，沒有進(jìn)行機(jī)體內(nèi)基因表達(dá)水平的測(cè)定，下一步可以對(duì)這些基因所表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分析。