王智能 王 允 吳光旭,2,* 吳慶華,2 蘇東曉 李 利楊華林 陳 莎

(1 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434020；2 長(zhǎng)江大學(xué)荊楚特色食品研發(fā)中心，湖北 荊州 434020；3 廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣東 廣州 510610)

蓮(Nelumbonucifera)睡蓮科蓮屬，是一種常見(jiàn)的多年生水生草本植物，主要分布于東亞和印度[1-2]。荷葉是蓮的葉，是重要的藥食兩用資源[3]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)典籍記載荷葉具有清暑化濕、生發(fā)清陽(yáng)和涼血止血的功能[3-4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究報(bào)道，荷葉還具有抗氧化[5]、降脂減肥[6]、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒[7]、抗癌[8]、抑菌[9]和治療心血管疾病[10]等多種功效，保健用途廣泛，已成為近年來(lái)中藥和保健食品的研究熱點(diǎn)。研究表明，荷葉富含蘆丁、花青素、槲皮素、單寧和紫云英甘等酚類(lèi)物質(zhì)[11-14]，以及生物堿、木脂素等生物活性物質(zhì)，具有良好的生物活性和生理功能[15]。然因其采收季節(jié)性強(qiáng)，僅有少部分被用于醫(yī)療和食品等行業(yè)，其余自然凋零于池塘中或被收集焚燒而未被利用，不僅造成資源浪費(fèi)，還污染環(huán)境[16]。因此，提取荷葉中的酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)于促進(jìn)人體健康和解決資源浪費(fèi)問(wèn)題具有重大意義。

目前，植物中的酚類(lèi)物質(zhì)主要通過(guò)乙醇、丙酮和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取[17]，如荔枝果肉中的游離酚可選用70%乙醇溶液(料液比 1∶3，w/v)進(jìn)行提取，而結(jié)合酚可采用酸水解法和堿水解法進(jìn)行提取[18-19]。植物酚類(lèi)物質(zhì)可作為膳食多酚的來(lái)源，通過(guò)口服方式進(jìn)入人體，到達(dá)胃和腸道中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。體外模擬胃腸消化是通過(guò)調(diào)節(jié)pH值，添加酶和無(wú)機(jī)鹽來(lái)模擬人體胃腸道環(huán)境，進(jìn)一步反映食物及食物中酚類(lèi)物質(zhì)在人體胃腸道中的代謝情況。研究表明，胃腸道中的消化酶、pH值和無(wú)機(jī)鹽均會(huì)影響食物及酚類(lèi)物質(zhì)在人體胃腸道中的吸收與釋放[20-21]。Su等[22]發(fā)現(xiàn)模擬胃液和腸液消化處理均提高了荷葉的總酚釋放量，且模擬腸液消化對(duì)于不同生長(zhǎng)階段荷葉中總黃酮的釋放量還具有促進(jìn)作用。此外，食物的不同加工方式也會(huì)影響其活性成分的釋放[23-25]。鄭慧等[26]發(fā)現(xiàn)蜂花粉多酚溶出量隨粉碎粒徑的減小而增加，粉碎可提高溶出多酚在腸液消化過(guò)程中的保留率。目前關(guān)于荷葉中酚類(lèi)物質(zhì)的研究主要以新鮮荷葉為原料進(jìn)行探究，對(duì)于經(jīng)熱加工處理的荷葉，通過(guò)模擬胃腸消化來(lái)探究荷葉中酚類(lèi)物質(zhì)的釋放及其抗氧化活性的影響未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用體外模擬胃腸消化法探究不同熱處理后的荷葉中總酚和總黃酮釋放量的變化，以及其鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)和ABTS自由基清除能力，以期為荷葉的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮、無(wú)污染的荷葉于2017年8月中旬采集于湖北荊州。

胃蛋白酶、胰蛋白酶、蘆丁和沒(méi)食子酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；二硫代蘇糖醇(DL-Dithiothreitol，TPTZ)、2，2’-聯(lián)氮-雙-乙基苯并噻唑-6-磺酸[2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6)-sulfonic acid, ABTS]、水溶性維生素E(Trolox)、福林酚試劑和硫酸亞鐵(GR)均購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津恒瑞科教儀器有限公司；GZX-9420 MBE鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；FA1104電子天平，上海天平儀器廠；KQ100DE超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；BR-2000渦旋振蕩器，上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；5430R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf公司；DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PB-10型pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 荷葉前處理試驗(yàn) 荷葉生長(zhǎng)過(guò)程分為立葉期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、成熟期和衰亡期，荷葉直徑大小可以代表其不同生長(zhǎng)期，6、7、8月份荷葉的直徑分別為10～20、30～40、50～60 cm[27]，6、7月份為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，8月份為成熟期。挑選新鮮、外觀較好，直徑分別為15±3、34±3、56±4 cm的荷葉進(jìn)行處理。真空微波處理：采用 50Hz 微波2 min，依次記作V15組、V34組、V56組；濕熱蒸汽處理：采用100℃沸水的水蒸汽熏蒸 5 min，依次記作H15組、H34組、H56組；煮沸處理：采用100℃沸水煮沸5 min，依次記作B15組、B34組、B56組。處理后將所有荷葉樣品參考劉慧娟等[16]和Su等[22]的方法60℃熱風(fēng)干燥至荷葉樣品中水分含量為4.5%～5.0%。將上述干燥后的荷葉樣品分別粉碎，過(guò)60目篩，樣品粉末于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 荷葉體外消化處理試驗(yàn)

1.3.2.1 去離子水提取 稱(chēng)取2.00 g 1.3.1中各處理組荷葉粉末，分別按照1∶15(質(zhì)量體積比)的比例加入去離子水，振蕩混勻后于37℃條件下恒溫振蕩(120 r·min-1)2 h，然后5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，并于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫源俗鳛閷?duì)照。

1.3.2.2 模擬胃液消化處理 參考Fu等[28]的方法并略作修改。體外模擬胃消化液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g NaCl和3.2 g胃蛋白酶，加入預(yù)先用900 mL去離子水和7.0 mL濃鹽酸充分混合好的溶液中，通過(guò)磁力攪拌器使其充分溶解，再用6 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH值至1.2，最后將溶液轉(zhuǎn)移并定容至1 000 mL，充分搖勻后靜置過(guò)夜，即為體外模擬胃消化液。

消化處理：稱(chēng)取2.0 g 1.3.1中各處理組荷葉粉末，按照1∶15 g·mL-1的比例加入過(guò)夜靜置的模擬胃消化液，振蕩混勻后于37℃條件下恒溫振蕩(120 r·min-1)2 h，然后5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，并于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 模擬腸液消化處理 參考Fu等[28]的方法并略作修改。體外模擬腸消化液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取6.8 g KH2PO4于燒杯中，加入250 mL去離子水，并通過(guò)磁力攪拌使其充分溶解，再加入190 mL 0.2 mol·L-1NaOH溶液和400 mL去離子水，充分混勻后加入10.0 g胰酶，待胰酶充分溶解后用NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.5±0.1，最后用去離子水定容至1 000 mL，充分搖勻，即得體外模擬腸消化液。

消化處理：稱(chēng)取2.0 g 1.3.1中各處理組荷葉粉末，按照1∶15 g·mL-1的比例加入模擬腸消化液，振蕩混勻后于37℃條件下恒溫振蕩(120 r·min-1)2 h，然后5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，并于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 荷葉總酚釋放量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[29]的方法并略作修改。吸取250 μL模擬消化處理或?qū)φ諛悠飞锨逡?，加?.0 mL去離子水和250 μL福林酚試劑，混勻后靜置6 min，再加入2.5 mL Na2CO3溶液(質(zhì)量體積比為70 g· L-1)和2 mL去離子水，振蕩混勻后室溫條件下暗室反應(yīng) 90 min，測(cè)定其在760 nm波長(zhǎng)處的吸光度值?？偡俞尫帕恳詻](méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)，按照每克樣品中沒(méi)食子酸釋放量當(dāng)量(gallic acid equivalent，GAE)表示，單位為mg·g-1。

1.3.4 荷葉總黃酮釋放量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[29]的方法并略作修改。取3.0 mL去離子水，加入600 μL模擬消化處理或去離子水提取上清液和180 μL 50 g·L-1NaNO2溶液，混勻靜置6 min后加入360 μL 100 g·L-1AlCl3·6H2O溶液，反應(yīng)5 min后再加入1.2 mL 1 mol·L-1NaOH溶液，用去離子水補(bǔ)至6.0 mL，測(cè)定其在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度值?？傸S酮釋放量以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，每克樣品中所含蘆丁質(zhì)量當(dāng)量(rutin equivalents，RE)表示，單位為 mg·g-1。

1.3.5 荷葉FRAP抗氧化能力測(cè)定 參考Thaipong等[30]的方法。準(zhǔn)確吸取0.6 mL樣液，加入5.4 mL FRAP工作液后充分搖勻，避光保存30 min，測(cè)定其在593 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。以硫酸亞鐵作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各樣品的FRAP抗氧化能力值，單位為 μmol FeE·g-1。

1.3.6 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 參考Thaipong等[30]的方法。準(zhǔn)確吸取1.2 mL模擬消化處理或去離子水提取上清液，加入4.8 mL ABTS工作液，振蕩混勻后靜置6 min，測(cè)定其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制ABTS自由基清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品ABTS抗氧化能力值，單位為mmol TE·g-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均平行測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示。采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并以SNK檢驗(yàn)比較各組間顯著性差異，顯著性水平P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬體外消化對(duì)不同熱處理的荷葉總酚釋放量的影響

由圖1可知，相同消化方式不同熱處理下，V56組荷葉中總酚釋放量最高，其次是V34組，B15組最低；相同熱處理不同消化方式下，與去離子水組(DW)相比，模擬腸液消化處理(SIF)能增加不同熱處理組荷葉總酚的釋放量，模擬胃液消化處理(SGF)增加真空微波處理組荷葉的總酚釋放量和降低煮沸處理組荷葉中總酚釋放量，而對(duì)濕熱蒸汽熱處理組荷葉中總酚釋放量影響較小。此外，直徑最大的荷葉(V56組、H56組、B56組)總酚釋放量最高，直徑最小的荷葉(V15組、H15組、B15組)總酚釋放量最低。綜上可知，真空微波處理組對(duì)荷葉中總酚釋放量的提高效果最好，荷葉直徑越大，其酚類(lèi)釋放量越高，模擬腸液消化處理能增加總酚釋放量。

注：不同小寫(xiě)字母表示相同消化處理下不同樣品間差異顯著(P<0.05)。下同。Note：Different lowercase letters indicate significantly difference within the same treatment group at 0.05 level. The same as following.圖1 模擬體外消化對(duì)不同熱處理的荷葉中總酚釋放量的影響Fig.1 Effects of simulated in vitro digestion on total phenolics release in lotus leaves with different heat treatment

2.2 模擬體外消化對(duì)不同熱處理的荷葉總黃酮釋放量的影響

由圖2可知，在荷葉直徑相等和消升方式相同的情況下，不同熱處理中，真空微波組(V56組、V34組和V15組)荷葉總黃酮釋放量高于濕熱蒸汽組(H56組、H34組和H15組)和煮沸處理組(B56組、B34組和B15組)，其中，V56組荷葉總黃酮釋放量最高，B15組最低；在相同熱處理不同消化方式下，與DW組相比，模擬胃液消化使真空微波、濕熱蒸汽和煮沸處理組中荷葉的總黃酮含量降低，而模擬腸液消化則提高其總黃酮的釋放量。在不同熱處理相同消化方式下，真空微波處理組中的總黃酮釋放量顯著高于濕熱蒸汽和煮沸處理組，此外，直徑較大的荷葉(V56組、H56組、B56組)總黃酮釋放量最高，直徑最小的荷葉(V15組、H15組、B15組)總酚釋放量最低。綜上，真空微波處理較其他熱處理方式的提取效果好，荷葉總黃酮釋放量隨著荷葉直徑增大而增加；與去離子水組(DW)相比，模擬胃液消化處理(SGF)會(huì)降低不同熱處理組荷葉中總黃酮的釋放量，而模擬腸液消化處理(SIF)會(huì)增加荷葉總黃酮釋放量。

圖2 模擬體外消化對(duì)不同熱處理的荷葉中總黃酮釋放量的影響Fig.2 Effects of simulated in vitro digestion on total flavonoids release in lotus leaves with different heat treatment

2.3 模擬體外消化對(duì)不同熱處理的荷葉FRAP抗氧化能力的影響

由圖3可知，相同消化方式不同熱處理下，真空微波組荷葉的FRAP值顯著高于濕熱蒸汽處理組和煮沸處理組。DW和SIF中V56組荷葉的FRAP抗氧化能力最強(qiáng)；SGF中V56組和H56組均高于其他熱處理組，但二者無(wú)顯著差異；在DW、SGF和SIF中，濕熱蒸汽處理組和煮沸處理組荷葉FRAP抗氧化能力由強(qiáng)到弱依次分別為H56>H34>H15和B56>B34>B15，這與其總酚含量測(cè)定結(jié)果一致。相同熱處理不同消化方式下，濕熱蒸汽處理組中H56的FRAP抗氧化能力在模擬胃液消化中增強(qiáng)，并與真空微波V56相比無(wú)顯著性差異。此外，荷葉的抗氧化能力隨荷葉直徑的增大而增強(qiáng)，其中直徑較大的荷葉(V56組、H56組、B56組)FRAP抗氧化能力較高，直徑最小的荷葉(V15組、H15組、B15組)FRAP抗氧化能力較低。綜上表明，不同熱處理方式對(duì)荷葉的FRAP抗氧化能力有顯著影響，其中真空微波處理效果最好；此外，模擬胃液消化對(duì)于濕熱蒸汽組中荷葉的抗氧化能力影響最大，對(duì)于真空微波和煮沸處理組中荷葉的FRAP抗氧化能力影響較小，模擬腸液消化則對(duì)于真空微波、濕熱蒸汽和煮沸處理組中荷葉FRAP抗氧化能力的影響均較小。

圖3 模擬體外消化對(duì)不同處理的荷葉FRAP抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of simulated in vitro digestion on the antioxidant capacities of FRAP in lotus leaves with different heat treatment

2.4 模擬體外消化對(duì)不同熱處理的荷葉ABTS抗氧化能力的影響

由圖4可知，相同消化方式不同熱處理下，DW、SGF和SIF中V56組的ABTS值顯著高于其他熱處理組，這與其總酚含量測(cè)定結(jié)果相一致。DW、SGF和SIF組中濕熱蒸汽處理和煮沸處理的荷葉ABTS抗氧化能力由強(qiáng)到弱依次分別為H56>H34>H15和B56>B34>B15，這與FRAP測(cè)定結(jié)果相一致。相同熱處理不同消化方式下，SIF中真空微波組、濕熱蒸汽組和煮沸組荷葉的ABTS抗氧化能力均強(qiáng)于DW和SGF。此外，荷葉直徑越大其抗氧化值越高，其中，直徑為56 cm的荷葉的ABTS抗氧化能力最強(qiáng)，這與其總酚和FRAP抗氧化能力測(cè)定結(jié)果相一致。綜上表明，熱處理對(duì)荷葉的抗氧化能力具有顯著影響，其中真空微波處理能顯著提高荷葉的抗氧化能力。模擬腸液消化對(duì)于真空微波、濕熱蒸汽和煮沸處理組中荷葉的抗氧化能力具有積極影響，能顯著提高荷葉的抗氧化能力，而模擬胃液消化則對(duì)于真空微波處理組中荷葉的抗氧化能力有較大影響，顯著降低其抗氧化能力，但抗氧化活性仍高于濕熱蒸汽和煮沸處理組。

圖4 模擬體外消化對(duì)不同熱處理的荷葉ABTS抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of simulated in vitro digestion on the antioxidant capacities of ABTS in lotus leaves with different heat treatment

3 討論

植物中的酚類(lèi)化合物是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，具有多元酚羥基結(jié)構(gòu)，這類(lèi)化合物的穩(wěn)定性會(huì)受光、熱、氧氣及pH值等多種因素的影響， 這些因素使其活性物質(zhì)損失，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低[31]。新鮮果蔬可通過(guò)直接曬干、烤干、熱風(fēng)干燥和微波干燥等多種加工方式進(jìn)行脫水干燥，但不同加工方式會(huì)影響其活性物質(zhì)的釋放量。研究表明，熱處理可能會(huì)增大細(xì)胞間的孔隙[32-33]，促進(jìn)值物中酚類(lèi)物質(zhì)的溶出和釋放，此外，熱處理還能使植物細(xì)胞壁破裂，改變其萃取性，使得酚類(lèi)化合物更容易釋放[34]?？偡雍康脑黾舆€可歸因于高溫使多酚氧化酶失活，酶催化活性被破壞，酚類(lèi)化合物無(wú)法聚合，阻止酚類(lèi)化合物參與褐變反應(yīng)[35]。本研究通過(guò)分析不同熱處理荷葉中酚類(lèi)釋放量及抗氧化活性的影響來(lái)選擇荷葉干制的最優(yōu)方法，結(jié)果顯示，真空微波處理的荷葉干燥效果最好，荷葉直徑越長(zhǎng)，荷葉總酚和總黃酮釋放量越高，V56組荷葉中總酚、總黃酮釋放量均高于其他處理組。

食物在體內(nèi)消化吸收和代謝過(guò)程比較復(fù)雜，其酚類(lèi)物質(zhì)釋放量和組成會(huì)發(fā)生較大變化，直接影響其生物活性[36]。食品中既含有游離酚，也含有結(jié)合酚[19]。游離酚可能在熱處理過(guò)程中發(fā)生聚合或降解，而結(jié)合酚可能在消化過(guò)程中被釋放出來(lái)。研究表明，胃腸環(huán)境對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)釋放有較大的影響, 山楂通過(guò)胃腸消化后其總酚含量會(huì)顯著增高[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模擬胃液消化處理降低了荷葉中總黃酮釋放量，但增加了總酚釋放量，而模擬腸液消化顯著增加了荷葉中總酚和總黃酮釋放量，這可能是由于黃酮類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成了類(lèi)黃酮-蛋白酶復(fù)合物，從而影響其釋放[38]。

抗氧化活性是體系中所有抗氧化物質(zhì)共同發(fā)揮作用的結(jié)果，胃腸環(huán)境的變化可能影響抗氧化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和相互作用。有研究報(bào)道FRAP和ABTS抗氧化活性與酚類(lèi)物質(zhì)含量呈正相關(guān)[39]。本研究中，荷葉富含酚類(lèi)物質(zhì)，且具有較好的FRAP鐵離子還原能力和ABTS自由基清除能力等抗氧化活性。熱處理方式不僅影響荷葉中總酚及總黃酮釋放量，對(duì)荷葉的FRAP抗氧化能力及ABTS抗氧化能力也有一定影響。其中微波真空處理效果最好，荷葉直徑越大其FRAP抗氧化能力及ABTS抗氧化能力越高，這與熱處理方式對(duì)荷葉中總酚、總黃酮釋放量影響規(guī)律一致。

4 結(jié)論

熱處理方式和消化方式均會(huì)影響不同生長(zhǎng)期荷葉總酚和總黃酮釋放量及其FRAP、ABTS抗氧化活性。相同處理?xiàng)l件下，直徑越大，其酚類(lèi)含量釋放量越高，抗氧化活性越強(qiáng)。此外，相同消化方式不同熱處理下，真空微波處理組中荷葉的酚類(lèi)含量和抗氧化活性與濕熱蒸汽和煮沸處理組相比均較高。在相同熱處理不同消化方式下，模擬腸液消化能顯著提高真空微波、濕熱蒸汽和煮沸處理組中荷葉酚類(lèi)含量和抗氧化活性，且真空微波處理組中荷葉的酚類(lèi)釋放量與其抗氧化活性在模擬胃液和腸液消化中均高于濕熱蒸汽和煮沸處理組。綜上所述，真空微波V56組顯著提高了荷葉中酚類(lèi)物質(zhì)的釋放量以及其抗氧化活性。因此熱處理對(duì)于荷葉中酚類(lèi)物質(zhì)的釋放及其抗氧化活性的提高具有積極影響，這為今后荷葉食品的開(kāi)發(fā)與利用提供了理論基礎(chǔ)。