葉紅霞 呂 律 王同林 海 睿 汪炳良

(浙江大學蔬菜研究所/浙江省園藝植物整合生物學研究與應用重點實驗室，浙江 杭州 310029)

甜瓜(CucumismeloL.)為葫蘆科黃瓜屬一年生蔓性草本植物，也是一種水果型蔬菜，享有“甜于諸瓜，獨得甘甜”的美譽[1]，被視為果品中的珍品。世界各地均有甜瓜栽培，目前我國的甜瓜栽培面積與總產量均居世界首位[2]。甜瓜類型豐富、品種繁多，不同類型(種群、變種)的甜瓜品種不僅在形態(tài)特征、生長發(fā)育上具有較大差異，且在品質特性上也具有多樣性，表現(xiàn)為口感、風味和甜度均不相同[3]。隨著農業(yè)種植結構的調整，甜瓜種植面積日益加大，消費者對甜瓜產量和營養(yǎng)品質的要求亦日益提高，且對品質的要求更趨向于個性化，因此提高甜瓜的產量和品質具有重要意義[4]。

在果實外觀、可溶性固形物含量、果肉質地等影響甜瓜品質的諸多因素中，糖類物質的組成及其含量是最重要的一類品質指標[5]。果糖、葡萄糖和蔗糖是甜瓜果實中主要的可溶性糖，其中果糖的甜度最高，但葡萄糖風味最好[6]。諸多研究者對甜瓜果實發(fā)育過程中糖類物質的積累進行了研究[7-11]。不同類型(基因型)甜瓜的糖分積累規(guī)律存在較大差異，即多數(shù)甜瓜品種(甜型)果實在發(fā)育過程中會出現(xiàn)蔗糖快速積累的轉折點，但也有部分甜瓜品種(非甜型)果實在整個發(fā)育過程中蔗糖積累始終維持在較低水平[12-17]。

研究表明，蔗糖合成酶(sucrose synthase，EC2.4.1.13，SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，EC2.4.1.14，SPS)和轉化酶(invertase，EC3.2.1.26, Ivr)是蔗糖代謝的關鍵酶，其中轉化酶包括酸性轉化酶(acid invertase，AI)和中性轉化酶(neutral invertase，NI)[18]。甜瓜果實在這些酶的共同作用下實現(xiàn)了葡萄糖、果糖，特別是蔗糖的積累[19-21]。通常不同甜瓜品種含糖量的高低主要取決于果實發(fā)育后期SPS活性的提高程度和AI活性的下降幅度；SS對于甜瓜糖的積累作用不顯著，其原因是甜瓜果實整個發(fā)育過程中SS無論是合成方向還是分解方向均無明顯變化；SPS在成熟和完熟甜瓜果實中活性顯著提高，與果實發(fā)育時期蔗糖濃度的提高一致，AI在果實發(fā)育前期活性較高，但隨著果實成熟迅速下降，在成熟果實中幾乎檢測不到其活性[12-13,17]。但也有研究認為SS的合成活性升高也是甜瓜果實蔗糖積累的主要原因, 表現(xiàn)為甜瓜果實進入成熟期后，SS合成活性驟然升高，約是成熟期前的10倍，進入成熟期的果實中蔗糖含量與SS合成方向活性和AI活性均呈極顯著相關[15,22]。研究蔗糖積累能力不同的甜瓜發(fā)現(xiàn)，AI活性具有相似性，但SPS活性各不相同，果實組織中蔗糖含量與合成活性(SPS +SS合成方向)-分解活性(AI活性+NI活性+SS分解方向活性)的最后凈活性相關系數(shù)高達0.85，推測甜瓜中蔗糖的積累由蔗糖的合成活性(SPS活性+SS合成方向活性)和分解活性(AI活性+NI活性+SS分解方向活性)之間的平衡決定[23]。造成這種差異的原因可能與甜瓜不同品種之間果實糖分積累水平和蔗糖代謝參與酶活性變化存在基因型差異相關[12-13]。綜觀相關報道，多數(shù)研究者采用單一材料[2-3,6,10]或同類材料[5,7,9]進行研究，且在甜瓜果實糖分積累與相關酶關系的研究方面仍存在疑問，如越瓜果實發(fā)育期間幾乎無蔗糖積累[14]，這種低蔗糖現(xiàn)象是參與蔗糖合成的酶活性低，還是參與蔗糖分解轉化的酶活性高，亦或者這些糖代謝酶活性均處于低水平，目前尚無定論。

本研究以高糖、中糖及低糖甜瓜品種為試驗材料，研究不同變種甜瓜果實成熟過程中糖分積累及相關酶活性的變化，從而探究糖分積累與蔗糖代謝相關酶的關系，以期為探索甜瓜果實發(fā)育期間的糖代謝積累機制、調控果實糖組分及其含量奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為哈密瓜(厚皮甜瓜亞種)自交系X228(C.melovar.saccharinusNaud. cv. X228)、普通甜瓜(薄皮甜瓜亞種)自交系B154(C.melovar.makuwaMakino cv. B154)和越瓜(薄皮甜瓜亞種)自交系H227(C.melovar.conmmonMakino cv. H227)。其中X228為高糖型，果實發(fā)育期45 d左右，成熟果實可溶性固形物含量達14%～18%；B154為中糖型，果實發(fā)育期30 d左右，成熟果實可溶性固形物含量為10%～12%；H227為低糖型，果實發(fā)育期30 d左右，成熟果實可溶性固形物含量為4.0%～6.0%。

1.2 試驗方法

3個甜瓜自交系種子于2017年2月13日播種，3月15日定植于跨度為8 m的單體大棚中，采用立架栽培，坐果及田間管理同常規(guī)甜瓜栽培。3個甜瓜品種選擇同期開花的兩性花授粉，授粉當天進行標記，分別于X228授粉后15、20、25、30、35、40、45 d取樣，分別于B154和H227授粉后15、20、25、30、35 d取樣。其中，可溶性固形物含量測定每次選取5個發(fā)育正常果實的中心果肉；糖和酶活性的測定每次選擇3個發(fā)育正常果實，采收后切取果實赤道部位厚度約 2 cm的果肉，將果肉樣品混合，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆茫?次生物學重復。

1.2.1 可溶性固形物含量測定 用紗布擠出甜瓜汁液，采用PAL-1便攜式糖度儀(ATAGO，日本)測定果實可溶性固形物含量(total soluble solid，TSS)。具體測定方法：待糖度儀校正后，在玻璃面上滴2滴果肉汁液進行測試，讀取數(shù)顯儀上的數(shù)據(jù)。

1.2.2 糖組分含量測定 糖組分的提?。簠⒖脊軐W玉[24]的方法并稍作改進。取5.0 g果肉混合樣品，加入5 mL 80%乙醇并將樣品研碎，于75℃下浸提10 min，4 000 × g離心15 min，收集上清液，重復3次，合并上清液，定容至25 mL，搖勻后取1 mL溶液于1.5 mL離心管中，并將離心管置于Concentrator plus真空離心濃縮儀(Eppendorf公司，德國)中進行濃縮(30℃)，殘渣用1 mL重蒸水溶解后經0.22 μm濾膜過濾，用于液相色譜，重復3次。

糖組分含量測定：參考朱勇等[25]的方法并稍作改進。Waters2695高效液相色譜儀(配Waters2414型示差折光檢測器，Waters公司)，色譜條件為流動相(乙腈/重蒸水=80∶20，v∶v)，流速1.0 mL·min-1，柱溫40℃，檢測器溫度35℃，進樣量10 μL。色譜柱為Spherisorb-5NH2柱(Waters公司，美國)。以色譜級的果糖、葡萄糖和蔗糖標準品等比例混合配制標準工作液，進行液相色譜分析，以濃度為X軸，峰面積為Y軸進行線性回歸，制作標準曲線。

1.2.3 酶活性測定 參考管學玉[24]的方法。取1.0 g混合樣品，用3 mL HEPES緩沖液(50 mmol·L-1pH值 7.5 HEPES-NaOH，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1MgCl2，2.5 mmol·L-1DTT，10 mol·L-1抗壞血酸)溶解，然后加入60 mg不溶性的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvinylpolypyrrolidone，PVPP)粉末，在冰浴中研磨成勻漿，11 000 × g(4℃)離心20 min，取上清液逐漸加硫酸銨至80%飽和度，放置30 min后11 000 × g(4℃)離心1 h，棄上清液，用2 mL脫鹽緩沖液(稀釋10倍的提取緩沖液)溶解沉淀，再用D25 mm透析袋在脫鹽緩沖液中透析20 h左右。以上酶的提取操作均在0～4℃條件下進行，重復3次。

1)AI活性測定：參照張明方等[26]的方法。采用490 μL反應體系：含80 mmol·L-1pH值4.5醋酸-磷酸鉀緩沖液、100 mmol·L-1蔗糖、210 μL脫鹽后的酶液。37℃反應30 min，加入490 μL 3, 5-二硝基水楊酸(3, 5-Dinitrosalicylic acid，DNS)試劑終止反應，沸水浴5 min，冷卻后在Multiskan ascent臺式酶標儀(Thermo Electron Co.，芬蘭)中測定520 nm波長處的吸光度。以殺死酶液的上述反應混合液作為對照。酶活性單位用Glu μmol·h-1·g-1FW表示。

2)NI活性測定：與酸性轉化酶類似，僅將醋酸-磷酸鉀緩沖液的pH值調整為7.5。

3)SS合成方向測定：參考管學玉[24]的方法。采用70 μL反應體系：含80 mmol·L-1pH 值7.5 HEPES-NaOH緩沖液、100 mmol·L-1果糖、15 mmol·L-1UDPG、1 mmol·L-1EDTA、10 mmol·L-1MgCl2、20 μL脫鹽后的酶液。30℃反應30 min，加入70 μL 5 mol·L-1NaOH終止反應，沸水浴10 min，冷卻后加入1 mL 0.14%蒽酮(溶解于13.8 mol·L-1H2SO4中)，40℃反應20 min，冷卻后測定620 nm波長處的吸光度值。對照組反應體系中不含果糖。

4)SPS活性測定：參考趙智中等[27]的方法。采用70 μL反應體系：含50 mmol·L-1pH值7.5 HEPES-NaOH緩沖液、15 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1EDTA、5 mmol·L-1NaF、16 mmol·L-1UDPG、4 mmol·L-1F-6-P和20 mmol·L-1G-6-P、20 μL脫鹽后的酶液。30℃反應30 min，加入70 μL 5 mol·L-1NaOH終止反應，沸水浴10 min，冷卻后加入1 mL 0.14%蒽酮(溶解于13.8 mol·L-1H2SO4中)，40℃反應20 min，冷卻后測定620 nm波長處的吸光度值。對照反應體系中不含6磷酸果糖(Fructose-6-phosphate，F(xiàn)-6-P)和6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-phosphate，G-6-P)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Office Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 甜瓜果實可溶性固形物含量的變化

隨著甜瓜果實的生長，3個品系的可溶性固形物含量均呈增加的趨勢，其中B154和X228的增加幅度明顯高于H227，而B154和H227的可溶性固形物含量快速積累期較短(授粉后25～30 d)；X228的可溶性固形物含量快速積累期較長(授粉后25～40 d)(圖1)。

圖1 甜瓜果實發(fā)育過程中可溶性固形物含量的變化Fig.1 Changes of total soluble solid content during developing of melon fruits

2.2 甜瓜糖含量的變化

由表1可知，3個甜瓜品系果實發(fā)育過程中葡萄糖、果糖和蔗糖的變化趨勢具有一致性，但也存在明顯的差異。授粉后3個甜瓜品系果實葡萄糖、果糖含量略有起伏，其中H227在授粉后15～30 d果實中葡萄糖含量為10.62～11.77 mg·g-1FW，果糖含量為10.17～10. 76 mg·g-1FW，果實達到成熟期后，葡萄糖和果糖含量略有增加，且果實發(fā)育成熟過程中，葡萄糖/果糖比值(G/F)均在1～1.1之間；B154果實中葡萄糖和果糖含量分別在9.48～15.18 mg·g-1FW和9.71～15.83 mg·g-1FW范圍內波動，而X228果實中葡萄糖和果糖含量分別在12.72～18.83 mg·g-1FW和14.23～20.63 mg·g-1FW范圍內變動，在果實接近成熟時B154和X228的葡萄糖和果糖含量均降低，其中B154顯著降低，B154和×228兩個品系果實內葡萄糖/果糖比值(G/F)由未成熟期的1.1左右降低到1以下。此外，果實蔗糖含量在授粉15 d后除H227維持較低的含量(0.11～0.85 mg·g-1FW)外，B154和X228的蔗糖含量存在明顯的轉折點，其中，B154果實蔗糖含量在授粉后15 ～30 d呈現(xiàn)較快的增長態(tài)勢，蔗糖含量快速積累，之后趨于穩(wěn)定，并在授粉后30 d時果實蔗糖含量開始高于葡萄糖、果糖含量；X228果實蔗糖含量在授粉后15～25 d緩慢增長，之后呈現(xiàn)快速增加的趨勢，授粉后35 d果實蔗糖含量超過了葡萄糖、果糖含量，并在授粉后45 d達到45.8 mg·g-1FW，顯著高于其他發(fā)育時間。同時， H227在果實發(fā)育期間，果實蔗糖與葡萄糖+果糖的比值[S/(G+F)]均在0.04以下，但B154和X228的S/(G+F)隨著發(fā)育進程的推進快速增大，且B154的 S/(G+F)增大速度快于X228，但在果實成熟時X228的S/(G+F)大于B154。

表1 甜瓜果實成熟期間葡萄糖、果糖蔗糖含量的變化Table 1 Changes of sucrose content, fructose content, and glucose contentduring developing of melon fruits

注：每個品種同列中不同字母表示在0.05水平差異顯著。G/F表示葡萄糖/果糖比值；S/(G+F)表示蔗糖/(葡萄糖+果糖)比值。

Note:Different small letters in the same column of each variety indicate significant difference at 0.05 level. G/F represents the ratio of glucose/fructose, and S/(G+F) represents the ratio of sucrose/(glucose+ fructose).

2.3 甜瓜相關酶活性變化

由圖2可知，甜瓜果實發(fā)育過程中與蔗糖代謝相關的SPS、SS、AI、NI活性變化具有一定的規(guī)律性。授粉15 d后，3個甜瓜品系果實SPS活性均呈上升趨勢，其中H227各發(fā)育期果實SPS活性遠低于B154和X228，即使在授粉后35 d(果實達到商品成熟度時)H277果實SPS活性仍處于極低水平；B154果實SPS活性在授粉后30 d達到高峰，之后隨著生育期的推進有所下降；而X228果實SPS活性在授粉25 d后持續(xù)快速上升(圖2-A)。3個品系的SPS活性變化與果實蔗糖含量及其變化趨勢均基本一致。SS活性在授粉15 d后有所起伏，與SPS活性相比，3個品系果實的SS活性始終處于較低水平，其中H227果實SS活性低于B154和X228，且授粉后15～30 d，B154果實SS活性略高于X228(圖2-C)。甜瓜果實發(fā)育期間AI活性的變化趨勢與SPS活性相反，其中H227果實發(fā)育期間AI活性變化較小，一直處于較低水平；隨著果實發(fā)育期的推進，B154果實AI活性持續(xù)降低，尤其在授粉后25～30 d果實蔗糖快速積累期間AI活性降低幅度較大；在授粉后15 d，X228果實AI活性處于較高水平，遠高于B154，隨著發(fā)育期的推進， X228果實的AI活性幾乎呈直線下降，至授粉后25 d，X228果實AI活性下降趨勢變緩(圖2-B)。H227果實NI活性變化與AI活性相似，即在授粉后15～35 d均在低水平起伏；B154果實NI活性變化與AI活性相似，但隨著果實發(fā)育期的推進NI活性的降幅低于AI活性；X228果實NI活性的變化既不同于其他2個品種，也與AI活性變化不同，授粉后15 ～20 d，X228果實NI活性快速上升，并在授粉后20 ～25 d快速下降，之后基本穩(wěn)定(圖2-D)。

圖2 甜瓜果實發(fā)育過程中蔗糖代謝相關酶活性的變化Fig.2 Changes of enzymes activities related to sucrose metabolism during developing of melon fruits

2.4 蔗糖積累與蔗糖代謝相關酶活性的關系

由表2可知，H227果實發(fā)育期間蔗糖含量與SPS、SS、AI、NI活性均呈正相關，但除了與SPS活性的相關性達到顯著水平外，與SS、AI和NI活性的相關性均不顯著；B154果實的蔗糖含量與SPS活性呈正相關，但未達顯著水平，與SS、AI、NI活性呈負相關，其中與NI、AI的相關性分別達顯著和極顯著水平；X228果實蔗糖含量與SPS活性呈極顯著正相關，與SS、AI、NI活性呈負相關，且均未達到顯著水平。進一步分析發(fā)現(xiàn)，(SPS+SS)與不同變種甜瓜品種的蔗糖含量均呈正相關，在H227與B154中差異顯著，但僅與X228蔗糖含量達到極顯著相關水平；(AI+NI)與H227果實蔗糖含量呈正相關，但差異不顯著，與B154、X228果實蔗糖含量呈負相關，其中與B154達到極顯著水平。此外，3個品系甜瓜果實蔗糖含量與蔗糖代謝相關酶的凈活性(SPS+SS-AI-NI)均具有較高的正相關性，其中與X228和B154果實蔗糖含量的相關系數(shù)分別達到顯著和極顯著水平。

3 討論

甜瓜種類(亞種、變種)和品種間果實含糖量的差異主要表現(xiàn)在蔗糖含量方面，可以分為蔗糖積累型和低蔗糖積累型2種。越瓜(C.melovar.conmmon)屬于低蔗糖積累型品種，本研究中的越瓜品種H227在果實發(fā)育過程中蔗糖含量極低，這與前人報道一致[14,19]；浙江大學甜瓜育種課題組研究發(fā)現(xiàn)，普通甜瓜(C.melovar.makuwa)特別是厚皮甜瓜(C. var.cantalupensis)屬于蔗糖積累型，蔗糖是成熟果實中的主要糖分，品種間含糖量的差異主要表現(xiàn)為蔗糖含量的不同。雖然葡萄糖和果糖也是甜瓜果實的主要糖組分，但成熟果實中葡萄糖和果糖含量在種類(變種)、品種間的差異遠小于蔗糖，這與前人研究結果一致[3,13,19]。

表2 甜瓜果實蔗糖含量與蔗糖代謝相關酶活性的相關性分析Table 2 Correlation coefficients between sucrose content and related enzyme activities of melon fruits

注：*、**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著。

Note:*,**indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level，respectively.

在甜瓜果實發(fā)育過程中，葡萄糖和果糖含量變化不大且非常接近，研究結果表明，授粉后15 d開始，甜瓜果實內葡萄糖/果糖比值在1左右，其中2個蔗糖積累型甜瓜品種葡萄糖/果糖比值隨著果實的成熟略有下降趨勢，但越瓜品種H227果實發(fā)育過程中比值基本無變化。在蔗糖積累型甜瓜品種中，蔗糖積累存在一個明顯的轉折點，此轉折點不僅表現(xiàn)在蔗糖含量的顯著增加，而且也體現(xiàn)在蔗糖/單糖(葡萄糖+果糖)比值的變化。果實發(fā)育期較短的B154的蔗糖積累轉折點發(fā)生在授粉后20～25 d，而果實發(fā)育期較長的X228的轉折點發(fā)生在授粉后30 d左右。類似的結果在不同品種的研究中也有報道[5,28-30]，如Villanueva等[30]發(fā)現(xiàn)厚皮甜瓜品種Piel de Sapo和Rochet果實蔗糖積累的轉折點出現(xiàn)在授粉后26～35 d。

本研究結果表明，蔗糖積累型品種在授粉后15～20 d(X228)、15～25 d(B154)果實AI活性較高，之后下降，與前人的報道一致[5,12,30]。AI通過水解蔗糖為葡萄糖和果糖，以保持細胞的滲透壓[5]，并為果實的快速生長提供作為碳源的己糖[12, 30]，所以在果實發(fā)育初期，AI活性較高；此外，研究表明AI活性降低是蔗糖積累的必備條件[16]。本研究結果表明，甜瓜果實蔗糖含量的上升與SPS活力的上升相伴隨，類似的結果前人也有報道[9, 21-22, 29]。SPS催化F-6-P成為6-磷酸蔗糖(sucrose-6-phosphate，S-6-P)，這是一個可逆反應，但S-6-P通常會被與SPS以復合體形式存在于植物體內的磷酸蔗糖磷酸化酶(phosphoric acid sucrose phosphatase，SPP)迅速降解成蔗糖和磷酸根離子，因此催化產生蔗糖的反應實際上是一個不可逆過程[31]。

本研究所涉及的3個不同類型的甜瓜品系中，對果實蔗糖積累起決定作用的酶存在明顯差異，越瓜品系H227的SS、AI、NI活性與普通甜瓜品系B154、哈密瓜品系X228無明顯差異，蔗糖較低主要是由極低的SPS活性所致；而同為蔗糖積累型的B154與X228在果實成熟期蔗糖含量存在較大的差異，與SPS、AI活性差異關系密切，果實發(fā)育后期SPS活性的下降及仍維持相對較高的AI活性是B154果實蔗糖含量相對較低的主要原因，持續(xù)增加的SPS活性及較低的AI活性導致X228果實具有較高的蔗糖含量。但蔗糖積累能力不同的甜瓜品種具有相似的AI活性，而SPS活性存在明顯差異[23]，這與本研究結果不完全一致，其原因可能是本研究采用了不同蔗糖積累型(不同變種)的甜瓜，而Hubbard等[23]采用的均為厚皮甜瓜。

越瓜品種H227在商品成熟時果實的主要糖組分是葡萄糖和果糖，幾乎無蔗糖積累，其爽口清甜的口味深受我國東南沿海地區(qū)消費者的喜愛。隨著生活水平及健康意識的提高，人們對甜瓜需求也更加趨向于多樣化，消費者不再追求單一高甜型的甜瓜品質，松脆、清甜的低糖型甜瓜品種(越瓜)在市場也有較大的發(fā)展?jié)摿ΑＭㄟ^分析不同甜瓜變種果實發(fā)育期間糖代謝的差異，了解不同類型甜瓜在品質育種上的利用價值，為甜瓜果實品質調控和品質育種提供了理論依據(jù)。

4 結論

本研究結果表明，甜瓜果實中SPS、AI活性是決定甜瓜果實蔗糖含量的關鍵酶，低糖型越瓜H227果實中非常低的蔗糖含量與果實中極低的SPS活性有關；普通甜瓜B154果實中相對較高的蔗糖含量取決于相對較高的SPS活性及相對較高的AI活性；高糖型哈密瓜X228積累的高蔗糖含量與較高的SPS活性及相對較低的AI活性有關。本研究結果進一步明確了不同蔗糖積累型甜瓜果實的糖代謝機理。為了更好地指導甜瓜生產及不同糖含量甜瓜品種選育，有必要從糖代謝酶的分子調控及遺傳機理方面做進一步深入研究。