何 巖 于 洋 董婉維 周生來 王 惟 楊 葳 鄭志紅

(中國醫(yī)科大學實驗動物部，沈陽 110000)

脫氫表雄酮(DHEA)及其硫酸鹽(DHEAS)是一種C19類固醇激素，由腎上腺與性腺(睪丸和卵巢)分泌，是外周血睪酮和雌二醇的前體[1]。DHEA在體內(nèi)大部分以硫酸鹽的形式存在，并對生殖系統(tǒng)有重要的作用。已有研究證明，DHEA可以顯著改善臨床妊娠率[2]，出生率，子宮內(nèi)膜的厚度和恢復卵巢功能[3]。對于卵巢功能減退(diminished ovarian reserve，DOR)的患者，體外補充DHEA可以改善體外受精的效果。有研究人員比較DOR患者使用DHEA治療前后，試管嬰兒的胚胎數(shù)和分級顯著升高[4]。因此，DHEA可以提高懷孕率，降低流產(chǎn)率[3]。此外，對于生理性或者病理性卵巢功能減弱的女性，體外補充DHEA可以恢復卵巢功能[4]。用4-乙烯基環(huán)己烯二氧化二甲苯誘導大鼠的DOR模型中，經(jīng)過DHEA處理后，卵巢組織中閉鎖卵泡的數(shù)量明顯減少[5]。在綿羊的DOR模型中，DHEA可能通過調(diào)節(jié)AMH的表達促進卵泡的發(fā)育[6]。但是DHEA作用機制仍不清楚，基于DHEA可以減少閉鎖卵泡的數(shù)量，恢復卵巢功能，那么它是否可以作為一種輔助用藥提升超排卵的效果，目前尚無報道。由于使用激素進行超排卵本身對于卵母細胞的質(zhì)量有不良影響[7]，本研究旨在以C57BL/6J雌鼠為研究對象，探索DHEA是否能夠提高C57BL/6J雌鼠的超排卵效果以及卵母細胞的質(zhì)量，以進一步探討DHEA改善超排卵的機制。

卵母細胞的質(zhì)量直接影響后續(xù)的實驗效率以及實驗結(jié)果，過去對于卵母細胞的質(zhì)量評價多通過形態(tài)學的方法，現(xiàn)在越來越多的研究認為，卵丘細胞可以作為一項指標來評價卵母細胞甚至是胚胎的質(zhì)量。卵丘細胞是顆粒細胞包圍卵母細胞形成的，累積卵母細胞周圍形成卵丘復合體(COC)，其在卵泡發(fā)育中起到促進卵母細胞發(fā)育和成熟的作用。卵丘復合物與卵母細胞通過特殊的連接間隙，進行雙向的傳遞信號。若除去卵丘復合物與卵母細胞之間的連接，會導致卵母細胞質(zhì)量降低，胚胎發(fā)育不良，妊娠失敗[8]。因此，可以通過鑒定卵丘細胞中某些基因的表達來評價卵母細胞的質(zhì)量和體外受精的結(jié)果。許多相關研究報道，卵丘細胞中Grem1、Has2、Ptgs1、Ptgs2和Vcan等基因的表達標志著卵母細胞的成熟能力[9]、胚胎質(zhì)量及發(fā)育、妊娠的結(jié)果和活產(chǎn)率的高低[10]。本研究試圖用DHEA處理C57BL/6J雌鼠，然后誘導超排卵，檢測DHEA作用后超排卵效果以及卵丘細胞中標志卵母細胞質(zhì)量的基因表達水平，從而鑒定卵母細胞質(zhì)量，并初步探索DHEA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:近交系3周齡C57BL/6J雌鼠30只，雄鼠5只，所有SPF級小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號 SCXK (京)2016-0006。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學實驗動物部SPF級動物房，飼養(yǎng)條件：溫度控制在(22±3)℃，自動光控(12 h/12 h)。

1.1.2試劑:孕馬血清促性腺激素(PMSG，C151214，寧波市激素制品有限公司)，絨毛膜促性腺激素(HCG，S160113，寧波市激素制品有限公司)，M16培養(yǎng)液、HTF培養(yǎng)液、KMSO培養(yǎng)液、礦物油和透明質(zhì)酸酶(Sigma 美國)，單細胞RNA提取試劑盒(sigma 美國)。

1.1.3儀器設備:體視顯微鏡(OLYMPUS 日本)，胚胎移植管(自制)，熱臺(OLYMPUS 日本)，常規(guī)手術(shù)器械(瑞沃德 中國)，電子天平(梅特勒 美國)，發(fā)光儀Roche LightCycler?96(Roche 瑞士)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(Eppendorf 德國)。

1.2 方法

1.2.1超排與取卵:C57BL/6J雌鼠30只，腹腔注射PMSG 5 IU /只，間隔48 h后再次腹腔注射相同劑量的HCG，于腹腔注射HCG 15 h后取卵，動物經(jīng)頸椎脫位法處死，取出壺腹膨大部顯微鏡下取卵。將每組的10只隨機選取5只進行體外受精，另5只進行卵丘細胞的分離收集。

1.2.2體外受精:按Nakagata[11]的方法，取3月齡的C57BL/6J雄鼠2只，頸椎脫位法處死，分別取其附睪尾，沿與曲細精管垂直方向剪口，用滅菌的解剖針從附睪尾部挑取一滴濃密的精液，放入已預培養(yǎng)的HTF培養(yǎng)液中，于CO2培養(yǎng)箱37 ℃條件下進行培養(yǎng)獲能1.5 h，并以血球計數(shù)板計數(shù)該精子懸濁液的濃度。將適量獲能后的精子分別放入含未受精卵的培養(yǎng)液中，使其精子終濃度為200個/μL，然后放入CO2培養(yǎng)箱中受精6 h。 體外受精6 h 后在實體顯微鏡下觀察受精情況，將有二極體和雙原核的卵判定為受精卵。計算受精率，次日紀錄2細胞胚胎數(shù)、未受精卵數(shù)、異常卵數(shù)和卵總數(shù)，統(tǒng)計受精率和異常卵比例。

1.2.3Real-time PCR：檢測卵丘細胞中基因轉(zhuǎn)錄水平：通過1.2.1中的方法超排卵，經(jīng)過透明質(zhì)酸酶消化分離卵丘細胞和卵母細胞，收集卵丘細胞，按單細胞RNA提取試劑盒說明書步驟提取卵丘細胞總RNA，采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，應用Roche LightCycler?96進行Real-time PCR(SYBR Green熒光染料購自TAKARA公司)。表1為qRT- PCR 引物序列。目的基因和內(nèi)參基因β-actin分別在同一批次的96孔板上、不同的PCR管中擴增。PCR總反應體系為20 μL，上、下游引物各1 μL，1∶100稀釋后的cDNA模版1 μL，ddH2O 7 μL，SYBR 10 μL。95 ℃預變性30 s后，再進行如下40個循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。每一份標本進行復管檢測。得到各管標本的擴增曲線和目的序列的Ct值，以及檢測該管標本內(nèi)參基因β-actin的Ct值，計算各管標本的待測序列的ΔΔCt值[ΔΔCt=(待測目的基因Ct值-待測組內(nèi)基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)]，則該基因的mRNA相對表達為2—ΔΔCt。

表1 qRT-PCR引物序列5′-3′Table 1 qRT-PCR primer sequence 5′-3′

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本t檢驗和卡方χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 超排卵和受精情況

3周齡C57BL/6J雌鼠經(jīng)過低劑量(2 mg/kg·d-1)和高劑量(5 mg/kg·d-1)DHEA灌胃一周，經(jīng)激素超排卵后，表2統(tǒng)計結(jié)果顯示，總卵數(shù)：低劑量處理組與高劑量處理組排卵數(shù)量與對照組比較略升高。異形卵數(shù)及比率：實驗組與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。受精率：實驗組與對照組比較沒有明顯差異。說明DHEA可以顯著降低經(jīng)過激素超排卵后異形卵比例，但對于超排卵總數(shù)量和受精率影響不大。

表2 超排卵后卵母細胞形態(tài)以及受精率的變化Table 2 Changes of oocyte morphology and fertilization rate after superovulation

注：受精率=2-cell數(shù)/總卵數(shù)，異常卵比率=異常卵數(shù)/總卵數(shù).*P<0.05

Note：Fertilization rate=No. of 2-cell embryos / total number of oocytes, abnormal oocytes rate=No. of abnormal oocytes / Total number of oocytes.*P<0.05

2.2 卵丘細胞中胚胎質(zhì)量相關基因轉(zhuǎn)錄水平

圖1中卵丘細胞中mRNA表達水平顯示，DHEA處理組Grem1表達水平與對照組相比降低，且高劑量組比低劑量組降低的倍數(shù)更大。DHEA對于Ptgs2的mRNA水平與其對Grem1的表達水平有相似的結(jié)果，即實驗組mRNA水平比對照組降低。而另外的胚胎質(zhì)量相關標記物Has2、Vcan和Ptgs1的mRNA水平如圖2顯示，實驗組與對照組比較顯著上調(diào)。Has2上調(diào)最明顯。以上差異均有統(tǒng)計學意義。

圖1 卵丘細胞中胚胎質(zhì)量相關基因下調(diào)基因表達情況注：橫坐標中，High：高劑量處理組；Low：低劑量處理組；Con：對照組縱坐標表示基因mRNA表達水平的倍數(shù).**P<0.01，***P<0.001Fig.1 Downregulation of genes related to embryo quality in cumulus cellsNote：In abscissa, High: high dose group; Low: low dose group; Con: control group. Longitudinal coordinates represent multiple levels of gene expression.**P<0.01，***P<0.001

2.3 卵丘細胞中凋亡相關基因轉(zhuǎn)錄水平

圖3中卵丘細胞中凋亡相關基因Caspase3表達水平顯示，DHEA處理組與對照組相比顯著下調(diào)，高劑量組下調(diào)倍數(shù)比低劑量組更明顯，即低劑量組下調(diào)0.8倍，高劑量組下調(diào)0.3倍。Bcl2l10的mRNA表達水平顯示，實驗組mRNA表達水平高于對照組。以上差異均有統(tǒng)計學意義。

圖2 卵丘細胞中胚胎質(zhì)量基因表達上調(diào)基因表達情況注：橫坐標中，High：高劑量處理組；Low：低劑量處理組；Con：對照組。縱坐標表示基因mRNA表達水平的倍數(shù)。**P<0.01，***P<0.001Fig.2 Upregulation of genes related to embryo quality in cumulus cellsNote：In abscissa, High: high dose group; Low: low dose group; Con: control group. Longitudinal coordinates represent multiple levels of gene expression.**P<0.01，***P<0.001

圖3 卵丘細胞中凋亡相關基因表達情況注：橫坐標中，High：高劑量處理組；Low：低劑量處理組；Con：對照組?？v坐標表示基因mRNA表達水平的倍數(shù)。**P<0.01，***P<0.001Fig.3 Expression of apoptosis-related genes in cumulus cellsNote：In abscissa, High: high dose group; Low: low dose group; Con: control group. Longitudinal coordinates represent multiple levels of gene expression.**P<0.01，***P<0.001

3 討論

Has2是透明質(zhì)酸合成酶，是卵丘細胞擴張的重要因素，能夠促進卵母細胞成熟和排卵[12]。Ptgs1、Ptgs2是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1和2，二者在排卵反應中參與細胞外基質(zhì)的形成與信號傳導，其表達水平的高低預示著卵母細胞的質(zhì)量。Vcan是多功能蛋白聚糖，是經(jīng)過排卵刺激后產(chǎn)生的蛋白多糖，其N’端可以與蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域結(jié)合，C’端與ERF受體、整合素等細胞表面蛋白相互作用。其表達在卵母細胞成熟、排卵和受精過程中起重要作用[13]。Grem1基因編碼的蛋白屬于分泌性蛋白，且具有高度保守性，是骨形態(tài)形成蛋白(BMP)拮抗劑家族成員，在胚胎發(fā)育的早期表達量高，并發(fā)揮重要作用[14]。有研究報道顆粒細胞中Has2、Ptgs1、Ptgs2以及Vcan的轉(zhuǎn)錄水平與卵丘的擴增有關，其表達水平越高卵母細胞的質(zhì)量越好[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J雌鼠經(jīng)過DHEA灌胃一周，超排卵后，與對照組相比，排卵數(shù)量沒有明顯提升，但是異常卵比率明顯下降。DHEA可以提高顆粒細胞中Has2、Ptgs1和Vcan基因的轉(zhuǎn)錄水平，優(yōu)化了卵母細胞的質(zhì)量。因此，DHEA可以作為一種輔助用藥促進C57BL/6J青春期前雌鼠的超排卵質(zhì)量。本研究中用DHEA處理后，卵丘細胞中Ptgs1的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)而Ptgs2的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這可能與Ptgs1與Ptgs2出現(xiàn)表達的時間有關，Ptgs1的表達出現(xiàn)在超排卵后的12 h，相當于排出第一級體后開始表達，而Ptgs2的表達出現(xiàn)較早，發(fā)生在超排卵后4～8 h，排卵后表達隨之降低。兩種同源基因表達存在時空差可能是Ptgs1與Ptgs2存在功能互補的原因[13]。Grem1也是較多研究者認為可以標志著卵母細胞和胚胎質(zhì)量的基因[15]，但是Myers等人報道了Grem1在原始卵泡形成前起到重要的作用，出生后Grem1的表達并不能代表胚胎質(zhì)量和受精能力，本研究中DHEA使Grem1下調(diào)的機制可能是由于Grem1是BMP4信號通路的拮抗劑，應用DHEA處理時，激活BMP4信號通路，因此降低了Grem1的表達[14]。綜上，DHEA可以優(yōu)化青春期前卵母細胞的質(zhì)量，DHEA對于成年C57BL/6J小鼠的作用效果還有待于進一步研究。

對于DHEA作用機制的研究，一方面的關注DHEA對相關激素的調(diào)節(jié)，例如DHEA可以通過增強抗繆勒管激素(AMH)、抑制素B，增加有腔卵泡的數(shù)量，改善DOR患者的卵巢功能[16]。但是也有研究者發(fā)現(xiàn)DHEA對于血清AMH和FSH并沒有明顯改變[17]。另一方面，DHEA可能通過增加對胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的表達從而增加卵巢的反應性[18]。此外，雌鼠缺乏雄激素受體(AR)表現(xiàn)出較長的發(fā)情周期和較低的生育能力[19]，因此有研究報道DHEA可通過誘導顆粒細胞中雄激素受體(AR)和FSH受體的表達增加，恢復卵巢的功能[20]。但是，也有文獻報道，DHEA可以增加DOR患者AR的表達，但并沒有增加FSH受體的表達，相反DHEA可以降低DOR患者中高表達的FSH受體水平，表明DHEA調(diào)節(jié)FSH受體的機制可能存在其他方式[21]。近年還有研究報道，對于卵巢反應性低下的女性，DHEA可以通過減少其卵丘細胞的凋亡，增加線粒體的功能，提高卵母細胞的質(zhì)量和體外受精的結(jié)果[22]。在本研究用DHEA處理C57BL/6J小鼠并超排卵后，卵丘細胞中凋亡相關基因Bcl2l10與對照組相比表達上調(diào)，Caspase3表達與對照組相比表達下調(diào)，與Lin 等人的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)DHEA可以提高卵母細胞的質(zhì)量，降低經(jīng)過激素超排卵后異形卵的比例，并對DHEA影響卵丘細胞發(fā)育的機制做了初步探索，為后續(xù)DHEA的功能研究提供基礎理論。