尤金煒 董 敏 劉 彪 趙志剛 王麗嫻 馬 暢 張旭亮 劉 捷 惲?xí)r鋒

(1.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地，南京 210002) (2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210002)

GFP裸鼠是一種將綠色熒光蛋白穩(wěn)定表達(dá)于裸鼠各個(gè)組織器官的轉(zhuǎn)基因小鼠類型，其同時(shí)具有普通裸鼠的胸腺缺陷特性和穩(wěn)定、系統(tǒng)表達(dá)綠色熒光的特性，在生物、醫(yī)學(xué)研究中具有重大意義[1]。

本課題組自成功構(gòu)建GFP裸鼠模型后，已將其多種生理生化指標(biāo)檢測(cè)完善，主要組織中綠色熒光分布特點(diǎn)也基本明確[2-4]。GFP裸鼠模型構(gòu)建過程中，主要的難點(diǎn)在于該種系裸鼠繁殖能力低下，特別是雌鼠不孕情況多發(fā)。本課題組已檢測(cè)該種系雌鼠的動(dòng)情周期，發(fā)現(xiàn)GFP裸鼠雌鼠動(dòng)情周期發(fā)生率明顯低于BALB/c 裸小鼠[5]。裸鼠動(dòng)情周期發(fā)生率主要取決于其下丘腦-垂體-卵巢性腺軸分泌的激素水平，但此方面文獻(xiàn)報(bào)道較少[6]。為確定雌性GFP裸鼠血清中性激素水平，明確其不孕的發(fā)生原因，本課題組將不孕、孕早期、孕中期、孕晚期、泌乳早期、泌乳中期、泌乳晚期共7種不同生殖階段雌性綠色熒光裸鼠血清及生殖相關(guān)各組織(下丘腦、延髓、腎上腺、卵巢、子宮)中泌乳素水平加以對(duì)照，為后期研究GFP裸鼠的生殖功能鋪平道路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

分別取不孕、孕早期(妊娠6 d)、孕中期(妊娠12 d)、孕晚期(妊娠18 d)、泌乳早期(泌乳后6 d)、泌乳中期(泌乳后12 d)、泌乳晚期(泌乳后18 d)SPF級(jí)雌性GFP裸鼠(GFP nu/nu)各10只，GFP裸鼠為本實(shí)驗(yàn)室提供[SCXK(軍)2012-0014]。動(dòng)物均在SPF級(jí)設(shè)施飼養(yǎng)[SYXK(軍)2012-0047]。

1.2 妊娠時(shí)間確定方法

合籠后第二天早8點(diǎn)采用觀察陰道栓的方法確定是否受精，如受精，則定該天為妊娠第1天；雌鼠產(chǎn)下新生鼠當(dāng)日為產(chǎn)后第1天，第1 天至第6 天為泌乳早期，第7天至第12天為泌乳中期，第13天至第18天為泌乳晚期。

1.3 血清性激素水平檢測(cè)

使用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)小鼠血清中雌二醇、泌乳素、孕激素水平，試劑提供商為德國羅氏診斷公司。

1.4 組織泌乳素水平檢測(cè)

按照羅氏公司提供說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。試劑提供商為德國羅氏公司，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Quantitative PCR primer sequence

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 各組數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析法,兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。運(yùn)用Pearson Bivariate Correlation 進(jìn)行雙側(cè)相關(guān)分析。以P<0.05 和P<0.01 作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各期GFP裸鼠雌鼠血清中雌二醇、孕激素、泌乳素水平

在GFP裸鼠雌鼠血清中，可以觀察到，雌激素在妊娠早期達(dá)到高峰之后隨妊娠進(jìn)程不斷下降，至泌乳晚期降至最低；孕激素在妊娠早期有一個(gè)幅度較大的下降，之后上升至未孕水平，泌乳期時(shí)孕激素水平不斷緩慢下降；泌乳素與雌激素較為相似，但其在泌乳早期多了一個(gè)分泌高峰,見圖1、圖2、圖3。

圖1 各組GFP裸鼠雌鼠血清中雌激素水平(pg/mL)Fig.1 The levels of estrogen in the serum of female mice in each group

圖2 各組GFP裸鼠雌鼠血清中孕激素水平(ng/mL)Fig.2 The levels of progesterone in the serum of female mice in each group

圖3 各組GFP裸鼠雌鼠血清中泌乳素水平(ng/mL)Fig.3 The levels of prolactin in the serum of female mice in each group

2.2 各期GFP裸鼠雌鼠下丘腦、延髓、腎上腺、卵巢、子宮中泌乳素水平

泌乳素在延髓和腎上腺表達(dá)普遍較其他組織高，最高峰位于泌晚期，泌乳期整體較妊娠期PRL合成多；泌乳素受體與之相反，妊娠期整體較泌乳期表達(dá)高，且妊娠早期表達(dá)最高，隨妊娠進(jìn)行，泌乳素受體逐漸表達(dá)下降,見圖4和圖5。

圖4 各期GFP裸鼠雌鼠下丘腦、延髓、腎上腺、卵巢、子宮組織中PRL mRNA水平對(duì)比Fig.4 Comparison of PRL mRNA levels in hypothalamus, medulla oblongata, adrenal gland, ovary and uterus in different stages

圖5 各期GFP裸鼠雌鼠下丘腦、延髓、腎上腺、卵巢、子宮組織中PRLR受體 mRNA水平對(duì)比Fig.5 Comparison of PRLR mRNA levels in hypothalamus, medulla oblongata, adrenal gland, ovary and uterus in different stages

3 討論

哺乳動(dòng)物在妊娠時(shí)高劑量的孕激素對(duì)胚胎發(fā)育是有益且必須的，但高劑量雌激素會(huì)影響胚胎結(jié)構(gòu)抑制胎兒生長(zhǎng)[7]。我們?cè)贕FP裸鼠雌鼠妊娠血清中同樣發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象：雌激素在妊娠早期含量最高，隨著妊娠進(jìn)展不斷下降；孕激素在妊娠早期沒有明顯升高，甚至比未孕鼠血清中含量還低，但隨著妊娠發(fā)展，孕激素水平不斷升高且直至泌乳晚期均維持在較高水平。

本課題組同時(shí)發(fā)現(xiàn)：GFP裸鼠雌鼠血清中泌乳素水平在妊娠早期升至最高，以后不斷下降。此結(jié)果與前期其他課題組在普通小鼠血清中發(fā)現(xiàn)的妊娠期及泌乳期泌乳素水平變化趨勢(shì)相同[8]。結(jié)合我們同期觀察發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于子宮的泌乳素受體含量在妊娠早期最高，說明與普通裸鼠相似，GFP裸鼠雌鼠于妊娠早期同樣需要大量泌乳素發(fā)揮生物學(xué)功能。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GFP裸鼠雌鼠在妊娠早期大量分泌泌乳素，泌乳素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的自身負(fù)反饋?zhàn)饔每赡軙?huì)抑制下丘腦合成泌乳素，而接下來的試驗(yàn)證實(shí)了此猜測(cè)。我們觀察到妊娠早期的下丘腦、延髓、腎上腺組織中泌乳素mRNA 含量均位于較低水平，同時(shí)各個(gè)器官中泌乳素受體的表達(dá)均較高?？赡苁怯捎诿谌樗卦谌焉锖笃陂_始合成升高，各靶器官中空出大量泌乳素結(jié)合位點(diǎn)，為泌乳素在妊娠結(jié)束后發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用打下基礎(chǔ)。

結(jié)合早期研究發(fā)現(xiàn)的GFP裸鼠模型主要存在的不孕、易流產(chǎn)等問題，本課題組從內(nèi)分泌水平提出解決思路：在未孕鼠合籠早期給與雌激素、泌乳素，而在妊娠全程提供孕激素，妊娠晚期至泌乳期結(jié)束提供泌乳素。此種思路結(jié)合不同階段裸鼠不同生理需求，最大程度地模擬裸鼠自身內(nèi)分泌周期，有較大應(yīng)用前景。但仍存在一定不足，主要是各個(gè)階段各種激素需求量不盡相同，具體定量工作仍未完成，且各個(gè)綠色熒光裸鼠不同個(gè)體可能需要激素量也不同，需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。