石靜文,馬春麗,梁佳祺,邵伯悅,亓藝潔

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

蘋果多酚是蘋果中所含多元酚類的總稱,包含有黃酮醇、原花青素、表兒茶素等成分,具有很強(qiáng)的抗氧化性[1-2]。蘋果多酚可以提高人體的免疫力,預(yù)防衰老以及輔助治療心血管疾病、炎癥[3],還可以用作水果飲料和果汁中的澄清劑[4]。但蘋果多酚在潮濕、陽光、高溫等不利條件下極易氧化[5],失去活性,這些不利因素限制了蘋果多酚的應(yīng)用。研究表明:微膠囊是一種能夠?yàn)槲⑸?、酶、生物活性物質(zhì)提供保護(hù),使其免受不良環(huán)境破壞的有效方法之一[6-7]。大量研究表明蘋果多酚安全無毒,對(duì)人體沒有任何毒副作用[8]。

目前關(guān)于微膠囊化的常見方法包括:噴霧干燥、乳化法、擠壓法等[9-10]。其中擠壓法多采用生物活性物質(zhì)與親水性的壁材相混合,通過噴嘴,滴加到反應(yīng)進(jìn)程中,是一種簡(jiǎn)單、高效、成本低廉的方法[11],擠壓法在制作多酚類微膠囊的時(shí)候由于反應(yīng)條件溫和,能夠最大程度地保存多酚的生物活性,且形成的微膠囊在模擬胃液和模擬腸液中都表現(xiàn)出相對(duì)較高的穩(wěn)定性[12]。梁旭等[13]使用殼聚糖和玉米淀粉包埋蘋果多酚,但是未對(duì)包埋后的蘋果多酚微膠囊進(jìn)行胃腸道中的緩釋實(shí)驗(yàn)。

本試驗(yàn)采用擠壓法制備蘋果多酚微膠囊并對(duì)微膠囊的制備條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在較低成本的條件下提高蘋果多酚的包埋率,為蘋果多酚抵抗不良環(huán)境提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果多酚(食品級(jí),含量≥75%) 上海源葉生物技術(shù)有限公司;海藻酸鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;氯化鈣 華美生物工程公司;殼聚糖、福林酚 Biotopped公司;沒食子酸、磷酸氫二鉀、鹽酸 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;碳酸鈉 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;胃蛋白酶(3000 IU/g) Oxoid公司;胰蛋白酶(4000 IU/g) Amresco公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

GL-12B型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;精密pH計(jì) 北京朋利馳科技有限公司;PL403型電子天平 Mettler Toledo(上海)有限公司;UV-2401PC型紫外分光光度計(jì) 北京京科瑞達(dá)科技有限公司;DL-360A型超聲清洗器 上海之信儀器有限公司;FD-5型真空冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠;磁力攪拌器 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微膠囊制備 本試驗(yàn)采用擠壓法制備微膠囊[14]。按芯壁比取海藻酸鈉溶液與多酚溶液混合,42 ℃水浴攪拌30 min;再取一定量的殼聚糖溶液與氯化鈣溶液混合,調(diào)整pH,定容至50 mL;將配制好的殼聚糖與氯化鈣混合液置于燒杯中,取海藻酸鈉與多酚混合液,緩慢滴于燒杯中,低速攪拌20 min,靜置20 min,過濾分離,收集濾液,經(jīng)冷凍干燥得微膠囊制品。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 采用1.2.1的方法對(duì)蘋果多酚進(jìn)行包埋,包埋條件為:氯化鈣濃度0.040 g/mL、pH7.0、芯壁比2∶1,研究海藻酸鈉濃度(0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g/mL)對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響;海藻酸鈉濃度0.020 g/mL、pH7.0、芯壁比2∶1,研究氯化鈣濃度(0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 g/mL)對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響;海藻酸鈉濃度0.020 g/mL、氯化鈣濃度0.040 g/mL、芯壁比2∶1,研究pH(6.2、6.6、7.0、7.4、7.8)對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響;海藻酸鈉濃度0.020 g/mL、氯化鈣濃度0.040 g/mL、pH7.0,研究芯壁比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取海藻酸鈉濃度(A)、氯化鈣濃度(B)、pH(C)、芯壁比(D)四個(gè)因素,以微膠囊包埋率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),確定蘋果多酚微膠囊包埋的最佳工藝(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Levels and code of independent variable used for response surface analysis

1.2.4 微膠囊包埋率測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu測(cè)定蘋果多酚含量[15],按照沒食子酸當(dāng)量法測(cè)定蘋果多酚含量,繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7.23208X-0.00417,R2=0.9994,線性范圍在0～100 μg/mL。根據(jù)1.2.4.3公式計(jì)算出各工藝條件下蘋果多酚的微膠囊包埋率,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.2.4.1 微膠囊表面蘋果多酚含量測(cè)定 稱取1.0 g微膠囊成品,定容在100 mL容量瓶中,混勻10 min,用移液管取1 mL上清液定容在25 mL容量瓶中,10 min后在760 nm處測(cè)定吸光值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微膠囊表面蘋果多酚的含量。

1.2.4.2 微膠囊內(nèi)部蘋果多酚含量測(cè)定 稱取1.0 g微膠囊樣品,用30 mL無水乙醇溶液溶解壁材,超聲清洗30 min,取1 mL溶解液,定容在25 mL容量瓶中,10 min后在760 nm處測(cè)定吸光值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微膠囊內(nèi)部蘋果多酚含量[16]。

1.2.4.3 微膠囊包埋率計(jì)算

式(1)

式中:m1為微膠囊表面蘋果多酚的含量,mg;m2為微膠囊內(nèi)蘋果多酚的含量,mg。

1.2.5 微膠囊在人工胃液和腸液中穩(wěn)定性的測(cè)定 模擬人工胃液[17]:鹽酸溶液16.4 mL,胃蛋白酶10 g,加去離子水?dāng)嚢杈鶆蚝?定容至100 mL,此時(shí)pH約為2,備用。

模擬人工腸液:稱取磷酸二氫鉀6.8 g,胰蛋白酶10 g,加去離子水使之溶解,定容至1 L,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=6.8備用。

取0.5 g微膠囊分別加入裝有100 mL人工胃液、人工腸液的三角瓶中,于37 ℃搖床中振蕩處理0.5、1、1.5、2、2.5 h;分別取樣,測(cè)定蘋果多酚含量,并計(jì)算微膠囊緩釋率[18]。

微膠囊緩釋率計(jì)算公式:

微膠囊緩釋率(%)=釋放的蘋果多酚含量(mg)/包埋的蘋果多酚含量(mg)×100

式(2)

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行相關(guān)性和差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析,并采用Origin 8.5進(jìn)行作圖,并進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉濃度對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響見圖1。

圖1 海藻酸鈉濃度對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

由圖1可知蘋果多酚微膠囊的包埋率隨著海藻酸鈉濃度的增加而顯著升高(p<0.05),當(dāng)海藻酸鈉濃度達(dá)到0.020 g/mL時(shí),微膠囊包埋率達(dá)到最大,為82.44%,海藻酸鈉濃度繼續(xù)增加,微膠囊包埋率反而逐漸下降,這可能是因?yàn)楫?dāng)海藻酸鈉濃度過低時(shí),溶液粘度較小,形成的微膠囊壁材較薄,導(dǎo)致包埋率降低;當(dāng)海藻酸鈉濃度過大時(shí),海藻酸鈉的粘度也隨之增大,蘋果多酚溶液沒有與壁材均勻混合以及形成的微膠囊壁較厚,導(dǎo)致蘋果多酚微膠囊的包埋率降低[19-20]。

2.2 氯化鈣濃度對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

氯化鈣濃度對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響見圖2。

圖2 氯化鈣濃度對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

由圖2可知蘋果多酚微膠囊的包埋率隨著氯化鈣濃度的增加而顯著增加(p<0.05),當(dāng)氯化鈣濃度到達(dá)0.040 g/mL時(shí),微膠囊包埋率達(dá)到最大值,隨著氯化鈣濃度的繼續(xù)增加,包埋率逐漸降低。溶液中Ca2+濃度過低時(shí),不利于海藻酸鹽沉淀的形成,降低蘋果多酚微膠囊包埋率;Ca2+濃度逐漸增大,增加了Ca2+與海藻酸鈉之間的凝膠化反應(yīng)[21],有利于微膠囊的形成,包埋率也隨之增大;Ca2+濃度過大時(shí),溶液中大量的Ca2+增加了微膠囊的表面張力,海藻酸鈉無法再與氯化鈣進(jìn)行凝膠反應(yīng),導(dǎo)致微膠囊的包埋率逐漸下降[22]。

2.3 pH對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

pH對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響見圖3。

圖3 pH對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

由圖3可知pH<6.2時(shí),微膠囊無法形成,pH>7.8時(shí),微膠囊相互粘連,成囊效果差,成囊后粒徑變大,考慮蘋果多酚在過酸過堿的環(huán)境下自身結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞,影響微膠囊的包埋率,蘋果多酚微膠囊的包埋率在pH=7時(shí)達(dá)到最大。因此在6.2

2.4 芯壁比對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

芯壁比對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響見圖4。

圖4 芯壁比對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

由圖4可以看出蘋果多酚微膠囊的包埋率隨著芯壁比的增加逐漸增大,當(dāng)芯壁比為2∶1時(shí),蘋果多酚微膠囊的包埋率最大。芯壁比過高和過低造成微膠囊成囊不均、無法成囊,且包埋率也受到影響。芯壁比超過2∶1時(shí),包埋率顯著降低(p<0.05)。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以包埋率為響應(yīng)值,選擇海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、pH、芯壁比四個(gè)因素進(jìn)行29組試驗(yàn),響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results of response surface method

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性擬合,可得出蘋果多酚包埋率(%)與各因素編碼值之間的多元二次回歸模型:Y=85.30+0.19A+0.36B+0.18C+0.015D-1.15AB+0.92AC-0.47AD-2.09BC-0.17BD+0.62CD-6.12A2-5.44B2-4.97C2-4.92D2。

對(duì)模型方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),見表3。

表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Significance test of regression equation and variance analysis(ANOVA)

由表3可知,模型中全部二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值Y(包埋率)的影響都極顯著(p<0.01);一次項(xiàng)中A、C、D對(duì)響應(yīng)值Y影響顯著(p<0.05),B對(duì)響應(yīng)值Y影響極顯著(p<0.01);交互項(xiàng)除BD外對(duì)Y的影響全都極顯著(p<0.01),BD對(duì)Y的影響不顯著(p>0.05)。由此可知,各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響具有交互作用,并非是單純的線性關(guān)系。

2.5.2 各因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線圖分析 通過Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行擬合,得各因素間交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線,見圖5。響應(yīng)曲面中各因素對(duì)應(yīng)曲線的陡峭程度與其響應(yīng)值影響程度呈正相關(guān)。

響應(yīng)面中的等高線圖、曲線圖都反映了兩個(gè)不同條件相互交互作用對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率的影響,曲線圖反映的更為直觀,研究表明,等高線的形狀越接近圓形,表明兩個(gè)因素相互交互作用越弱,越接近橢圓形相互交互作用越強(qiáng),影響越顯著[11,23]。

圖5中等高線圖形接近橢圓形,表明兩個(gè)變量的交互作用對(duì)蘋果多酚微膠囊包埋率有顯著影響。其中(1)和(4)的等高線圖為橢圓形,這也體現(xiàn)了兩種壁材濃度的交互作用對(duì)微膠囊包埋率的影響顯著,當(dāng)一種壁材濃度不變時(shí),微膠囊的包埋率隨另一種壁材濃度的增加而增加,隨后逐漸平緩。壁材與pH之間的交互作用也對(duì)微膠囊包埋率的影響顯著,當(dāng)壁材濃度不變時(shí),微膠囊包埋率隨pH升高而增大隨后不變;當(dāng)pH不變時(shí),微膠囊的包埋率隨壁材濃度的增加而增加,隨后平緩[24]。

2.5.3 最優(yōu)條件的確定及驗(yàn)證 通過軟件分析得出的使用海藻酸鈉和殼聚糖包埋蘋果多酚的最佳工藝參數(shù)為:海藻酸鈉濃度為0.020 g/mL,氯化鈣濃度為0.040 g/mL,pH為7.01,芯壁比為2.02∶1,此時(shí)蘋果多酚的微膠囊包埋率為85.31%。為了實(shí)際操作中的便捷,將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為:海藻酸鈉濃度為0.020 g/mL,氯化鈣濃度為0.040 g/mL,pH為7.0,芯壁比為2∶1。在此條件下進(jìn)行三次平行試驗(yàn),測(cè)得蘋果多酚的包埋率為85.13%,與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.21%,結(jié)果穩(wěn)定,預(yù)測(cè)值可信。因此采用響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)優(yōu)化得到的蘋果多酚微膠囊的工藝條件準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

2.6 優(yōu)化后的微膠囊模擬胃腸道測(cè)定

優(yōu)化后蘋果多酚微膠囊在模擬胃腸液中釋放曲線如圖6。

圖6 優(yōu)化后蘋果多酚微膠囊體外釋放曲線

由圖6可知微膠囊在模擬胃液中,壁材受胃液影響,逐漸被破壞,釋放蘋果多酚,在1.5 h時(shí)達(dá)到最大釋放量,為73.18%。在0～1.5 h內(nèi)微膠囊釋放率逐漸增加,說明蘋果多酚含量逐漸增多,1.5 h后蘋果多酚的濃度趨于穩(wěn)定(p>0.05)。微膠囊在模擬腸道中,1 h時(shí)蘋果多酚的釋放量達(dá)到最大,1 h后蘋果多酚的濃度趨于穩(wěn)定,最大釋放率為83.00%(p>0.05),并且從圖6中可以明顯看出,微膠囊在模擬腸液中的釋放時(shí)間小于模擬胃液,釋放率大于模擬胃液,這是由于在pH>5.5的環(huán)境中,Ca2+與磷酸根的結(jié)合能力比海藻酸鈉的結(jié)合能力要強(qiáng)[25],對(duì)微膠囊的破壞大于模擬胃液,且在胃液環(huán)境中,Ca2+的交聯(lián)作用要大于腸液。

3 結(jié)論

在單因素基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面的方法進(jìn)行分析,得出的制備蘋果多酚微膠囊的最佳工藝條件:海藻酸鈉濃度為0.020 g/mL,氯化鈣濃度為0.040 g/mL,pH為7.0,芯壁比為2∶1。在此條件下,獲得的蘋果多酚的包埋率為85.13%。此條件下微膠囊成囊率高,在模擬胃液和模擬腸液中緩釋效果良好,腸液中的最大釋放率為83.00%。該方法簡(jiǎn)便可行,是一種制備蘋果多酚微膠囊的有效方法,并且微膠囊產(chǎn)品在模擬胃腸液中有良好的釋放能力。微膠囊化的蘋果多酚改善了多酚不穩(wěn)定易被破壞的缺點(diǎn),并且增加蘋果多酚的緩釋特性,為蘋果多酚的廣泛應(yīng)用提供了一種新的途徑。