張宇華 王曉彬 劉 佳 穆 鵬

絨毛膜癌是1種高度惡性的腫瘤，多繼發(fā)于葡萄胎、流產或足月分娩以后。早期絨毛膜癌癥狀不典型甚至無癥狀，隨著瘤體增大而表現(xiàn)不規(guī)則陰道流血、子宮變大而軟等癥狀，此時多已進展到中晚期[1]。目前，絨毛膜癌的篩查手段主要包括血清學指標人絨毛膜促性腺激素β亞基(β-Human chorionic gonadotropin，β-HCG)和超聲。然后，血清β-HCG缺乏特異性，其在多種生理、病理狀態(tài)下均會增高[2-3]；報道也指出B超對絨毛膜癌的診斷率僅為67.4%左右[4]。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類重要的非編碼RNA，其與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關，是近年研究的熱點[5]。研究發(fā)現(xiàn)多種非編碼RNA在絨毛膜癌患者體內存在異常表達，且與癌細胞增殖、侵襲與轉移等密切相關[6-7]，但關于circRNA在絨毛膜癌中的臨床價值卻尚未見報道。本研究旨在探討絨毛膜癌患者血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3聯(lián)合β-HCG的診斷及預后價值，以期為絨毛膜癌的診療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 研究對象的納入

收集本院2014年2月到2015年5月確診的絨毛膜癌患者140例，患者均為首次住院且經內鏡組織學檢查確診。絨毛膜癌的診斷和分期依據(jù)西班牙醫(yī)學腫瘤學會(SEOM)發(fā)布的2017版妊娠滋養(yǎng)細胞疾病臨床管理指南[8]。其中Ⅰ～Ⅱ期患者77例，Ⅲ～Ⅳ期患者63例；發(fā)生遠處轉移54例(陰道轉移39例、肺轉移7例、腦轉移4例、肝脾轉移4例)，未發(fā)生遠處轉移86例。同期選取我院體檢的健康女性140例。納入標準：①語言表達能力正常，能與調查人員進行正常的溝通；②研究對象自愿參與本研究。排除標準：①既往有其他腫瘤疾病史者；②排除腦卒中、老年癡呆等神經系統(tǒng)疾病導致的無法采集相關信息和精神分裂癥的患者；③孕婦或哺乳期女性。本研究的開展經醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 臨床資料與樣本的采集

由專業(yè)的研究人員記錄所有研究對象年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙史、飲酒史等基本信息。兩組間在年齡、BMI、吸煙史及飲酒史的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明兩組間具有可比性，見表1。

使用促凝采血管收集經禁食10 h以上絨毛膜癌患者接受治療前及健康對照者入院體檢時的靜脈血5 ml。收集的標本在1 h內于4 ℃條件下以3 500 g離心力(離心半徑為10 cm)離心10 min，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z測。

表1 兩組間臨床資料比較

1.3 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平的檢測

按照血清RNA提取試劑盒說明書步驟進行血清總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN說明書進行，反應體系為：Mix 10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.4 μl。熒光定量PCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)，每組設置3個復孔。應用PrimerPremier5.0進行PCR引物設計，使用的circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3與GAPDH引物序列見表2，引物合成由北京賽百盛基因技術有限公司提供。采用2-ΔΔCt法計算circRNAs的相對表達量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和GAPDH基因熔解曲線峰型單一，說明引物沒有形成引物二聚體，也沒有非特異性擴增。

血清β-HCG的檢測采用化學發(fā)光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供。質控品采用英國朗道公司腫瘤高、低值質控品，質控判斷標準為Westgard多規(guī)則分析。

同時計算血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG檢測的批內、批間變異系數(shù)值，以評估實驗的重復性和精確度。

表2 circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3與GAPDH的引物序列

1.4 隨訪

依據(jù)患者納入研究的時間，對患者進行40個月電話隨訪，并記錄患者的生存時間。隨訪終點為：①40個月內患者死亡；②40個月內患者退出該項研究；③40個月隨訪結束。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平比較

本次實驗血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG的批內變異系數(shù)分別為2.7%、2.6%、2.5%，批間變異系數(shù)分別為3.0%、2.8%、2.9%，均小于5%，提示樣本檢測具有良好的重復性和精確度。絨毛膜癌患者血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平顯著高于健康對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組間血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平比較

2.2 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG與絨毛膜癌臨床特征的關系

如表4所示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌患者年齡、吸煙史、飲酒史和BMI等因素均無明顯關系(P>0.05)。此外，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3水平與絨毛膜癌TNM分期(PTENP1：γ=0.514，P=0.004；HIPK3：γ=0.465，P=0.009)及遠處轉移(PTENP1：γ=0.501，P=0.005；HIPK3：γ=0.449，P=0.013)呈線性關聯(lián)。

表4 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG與絨毛膜癌臨床特征的關系

2.3 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌的鑒別價值

ROC曲線分析顯示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區(qū)分絨毛膜癌與健康對照的AUC分別為0.841(95%CI：0.754～0.927，P<0.001)、0.815(95%CI：0.672～0.908，P<0.001)和0.612(95%CI：0.558～0.706，P=0.002)；在各指標約登指數(shù)為最大值時對應的靈敏度/特異度分別為：73.7%/90.7%、78.5%/86.9%和70.2%/59.3%；診斷界值分別為78.6(-log)、29.0(-log)和7.5 mIU/ml。聯(lián)合血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區(qū)分絨毛膜癌與健康對照的AUC為0.923(95%CI：0.893～0.974，P<0.001)，靈敏度92.3%，特異度83.4%，見圖1。

圖1 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌鑒別價值

2.4 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌的風險評估

二元logistic回歸分析結果，見表5。單因素分析顯示，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平是絨毛膜癌發(fā)病的危險因素(P<0.05)；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素后，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平仍是絨毛膜癌發(fā)病的獨立危險因素(P<0.05)。

2.5 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌預后的關系

經40個月隨訪，共48例絨毛膜癌患者死亡，0例失訪。140例絨毛膜癌患者分別依據(jù)PTENP1、HIPK3和β-HCG水平的中位數(shù)分為高PTENP1與低PTENP1組、高HIPK3與低HIPK3組和高β-HCG與低β-HCG組。相比低PTENP1組，高PTENP1組生存率顯著降低(χ2=5.694，P=0.006，圖2A)；相比低HIPK3組，高HIPK3組生存率顯著降低(χ2=17.859，P<0.001，圖2B)；而低β-HCG組和高β-HCG組間生存率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.173，P=0.216，圖2C)。

3 討論

絨毛膜癌的惡性程度高，侵襲能力強，是威脅女性人群健康的主要疾病之一。生物標志物是血液、尿液或者組織中能檢測疾病狀態(tài)的分子指標，可用于疾病的檢測[9]。它們在體液中的濃度變化可以提供疾病的進展情況，理想情況下，生物標志物應具有檢測早期小塊腫瘤的高敏感性、高特異性，并且在非腫瘤中不會增加。目前，絨毛膜癌診斷仍缺乏有效指標。β-HCG是絨毛膜癌輔助診斷的重要指標，但多種病理、生理狀態(tài)下β-HCG均可出現(xiàn)升高[10-11]：正常懷孕、雙胞胎，葡萄胎、或在內分泌疾病中如腦垂體疾病、甲狀腺功能亢進、婦科疾病如卵巢囊腫、子宮癌等；此外，其他系統(tǒng)實體瘤畸胎瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等β-HCG亦可升高。值得注意的是，本次研究我們也發(fā)現(xiàn)β-HCG用于鑒別絨毛膜癌與健康女性對照的特異度不高，僅為59.3%，這與早前報道β-HCG缺乏特異性相一致[10-11]。

circRNA是1類新型的基因調控因子，能與DNA、RNA或蛋白質結合，在轉錄或轉錄后水平，以順勢調控或反式調控的方式，調節(jié)基因的表達，參與幾乎人類所有的生理及病理性生物學過程，已被證實在多種腫瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌等中存在異常表達。血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3是近年研究發(fā)現(xiàn)的在女性乳腺癌及多個生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的促癌基因。研究先后指出，circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3的差異表達可直接對靶基因如miR-17、P53等轉錄后的調控而促進癌細胞的增殖、遷移，并抑制細胞凋亡[12-15]。Zheng等[12]通過收集并提取膀胱癌與健康者血清外泌體PTENP1發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者PTENP1水平顯著高于健康對照，且高水平PTENP1與膀胱癌患者不良預后相關。Yu等[13]的機制研究同樣證實，經脂質體轉染PTENP1 mimics于膀胱癌T24細胞以上調T24細胞中PTENP1的表達水平，觀察到上調PTENP1后可顯著下調下游靶基因miR-17的表達，進而促進T24細胞的增殖與遷移能力，并抑制癌細胞凋亡，提示PTENP1對膀胱癌癌細胞的生物學活性具有促進作用。近期，Chen等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，PTENP1可通過AKT-MAPK通路促進乳腺癌上皮間質轉化及乳腺癌細胞的增殖和遷移。HIPK3作為促癌基因，有關價值研究也很深入。Li等[15]利用二代測序技術與生物信息學分析，在膀胱癌患者中篩選出了HIPK3，機制研究發(fā)現(xiàn)HIPK3在膀胱癌組織和細胞系中顯著上調，并分別與膀胱癌分級、浸潤和淋巴結轉移呈正相關，且過量表達HIPK3能有效促進膀胱癌細胞在體外的遷移、侵襲和血管生成，促進膀胱癌生長和轉移。然而，關于circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3在絨毛膜癌中的表達情況未見報道，其是否具有成為早期腫瘤診斷標志物的潛力是本次研究需要探討的。本研究通過對140例絨毛膜癌患者血清學的分析發(fā)現(xiàn)，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3在絨毛膜癌中顯著增高，此外，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3水平與絨毛膜癌患者分期和遠處轉移呈正相關，兩者在Ⅲ～Ⅳ期及發(fā)生遠處轉移患者中的水平增高最為顯著，提示兩者與絨毛膜癌的進展相關，該部分結果與前期研究基本相符[13-15]。

表5 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌的風險評估

注：a為校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素。

圖2 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌預后的關系

進一步ROC曲線分析顯示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區(qū)分絨毛膜癌與健康對照的靈敏度/特異度分別為73.7%/90.7%、78.5%/86.9%和70.2%/59.3%；而聯(lián)合三者后在區(qū)分絨毛膜癌與健康對照的靈敏度顯著提高，達到92.3%，提示聯(lián)合血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG具有較高的診斷價值。進一步二元logistic回歸分析顯示，在校正了年齡、BMI、吸煙、飲酒后，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平仍是絨毛膜癌發(fā)病的獨立危險因素，證實了血清miR-145、miR-29和miR-217水平差異可作為絨毛膜癌的診斷指標。生存分析結果提示，高PTENP1組和高HIPK3組患者的預后更差，這與前期多個研究結果相符[13-15]。然而，本次研究仍有如下不足：①本次研究納入的研究對象均來自于本院，這可能會對研究結果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊列研究來進一步驗證我們的結果；②本研究納入140例絨毛膜癌患者，納入的例數(shù)仍然是有限的，后期需要更大樣本量的研究來證實血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG的臨床價值。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對絨毛膜癌的潛在診斷價值，并發(fā)現(xiàn)circRNA-PTENP1與circRNA-HIPK3在絨毛膜癌風險評估和預后評價中有重要意義，有望為絨毛膜癌的臨床診治提供新的途徑。