劉 芳，楊釗楠，楊睿祺，王摸云，姚 焱，張 平

（1.植物抗逆基因功能研究廣州市重點實驗室/廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006；2.廣州大學化學化工學院，廣東 廣州 510006）

【研究意義】鉈（Tl）是一種劇毒的重金屬,隨著礦冶工業(yè)釋放入環(huán)境。土壤中鉈離子活躍，比砷(As)、汞(Hg)等重金屬更容易被農作物吸收和積累，也更容易對人體健康造成危害［1-2］。我國是一個富鉈資源國家，《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》也將鉈列為重點防控的重金屬污染物之一。水稻作為我國的主要糧食作物，其生產安全關系到國家的糧食安全，提高產量的同時對水稻重金屬抗逆的研究受到較多關注［3-4］。我國是世界水稻種植大國，全國人口有近2/3以稻米為食。研究不同水稻品種根系形態(tài)及有機酸分泌能力與重金屬鉈吸收能力的關系，有助于篩選鉈吸收能力低的水稻品種適應食品安全的需要，同時有助于深入了解植物根系對鉈吸收的機制。

【前人研究進展】根系是水稻地上部分與地下部分物質交換和信息交流的重要樞紐，植物的根系首先是與外源重金屬接觸的部位，重金屬通過根系的吸收進入根系細胞內。根是植物體與重金屬結合的關鍵部位，也是最易受重金屬毒性影響的部位，水稻苗期根系性狀如總根體積、總根面積、總根長、分枝數(shù)的變化可以反映植物抗重金屬脅迫的強度［5］。重金屬脅迫導致根系細胞結構破壞、細胞核裂解、線粒體數(shù)目減少、細胞壁腫脹等結果，而植物根系會通過增加邊緣細胞數(shù)目、提高細胞抗逆作用,維持較高水平的POD、CAT和SOD活性來對抗重金屬脅迫毒, 通過改變上述自身形態(tài)來應對土壤中的重金屬等非生物逆境脅迫［6-8］。

【本研究切入點】目前，關于鉈脅迫與水稻根系性狀的關系未見相關報道，但有研究表明不同的植物根系影響植物獲得重金屬耐受性狀。作為植物和外界重金屬接觸的第一道屏障，植物的根系形狀有可能影響到植物對重金屬的吸收或是耐受。在重金屬環(huán)境下植物分泌有機酸是一種重要的耐性機制。根系通過分泌低分子量有機酸改變根際微生物的環(huán)境，同時有機酸可以與重金屬離子形成金屬配位體復合物，轉化為無毒或者毒性較小的螯合形態(tài)，降低重金屬對植物體的危害［9］。植物根系分泌的有機酸，主要有檸檬酸、蘋果酸、草酸等［10］。不同植物在不同重金屬脅迫下有機酸分泌種類不同，如鉛脅迫能夠持續(xù)促進楊梅根系蘋果酸的分泌［11-12］，在黑麥草應對Zn脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，根系分泌的草酸和酒石酸含量會隨著重金屬脅迫程度的增加而升高［13］；鎘脅迫不同莧菜品種根系分泌有機酸以檸檬酸和蘋果酸為主，分泌量均隨供鎘濃度增加而增加［14］。在根系分泌物中，有機酸通過對重金屬的螯合作用的外部排斥機制來降低植株對重金屬的吸收［15-16］，而重金屬的濃度也會影響水稻根際pH和有機酸的分泌，其中草酸、蘋果酸、檸檬酸含量的增加可以促進水稻對重金屬的吸收［17］。本研究著重分析植物體的根系形狀和有機酸分泌對重金屬鉈吸收的影響?！緮M解決的關鍵問題】選取華南地區(qū)18個水稻品種，利用水培試驗的方法，比較各品種間鉈吸收量與根系長度、根系數(shù)量關系，以及與有機酸分泌量的關系，明確水稻根系對鉈吸收的主要影響因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種18個，編號為V1～V18，均來自華南地區(qū)常規(guī)品種。

供試材料于2019年春季在廣州大學生化樓實驗室培養(yǎng)，18個水稻品種種子分格放入育苗盤中，加入雙蒸水漫過種子，遮光放入恒溫培養(yǎng)箱中。等種子露白后，使用鑷子調整水稻種子位置，保證萌發(fā)出的根系穿過育苗盤的間隙向下生長。5 d后每升雙蒸水中加入10 mL大量元素儲備液（NH4NO3114.3 g/L、NaH2PO450.4 g/L、K2SO489.3 g/L、CaCl2110.8 g/L、MgSO4·7H20 410.8 g/L、MgSO4200 g/L），1.25 mL微量元素貯備液（MnCl2· 4H2O 1 500 mg/L、（NH4）6Mo7O24· 4H2O 74 mg/L、H3BO3934 mg/L、ZnSO4· 7H2O 35 mg/L、CuSO4· 5H2O 31 mg/L、FeCl3·6H2O (FeCl3) 7 700（4 621）mg/L、檸檬酸（水合物）11 900 mg/L）作為水稻受試材料的培養(yǎng)液。置于光照強度為350 μmol/m2·s，光照12 h/d，溫度28（±2）℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

鉈儲備液（Tl+1 g/L）：稱取1.303 g TlNO3，用少許去離子水溶解并加入硝酸維持酸性環(huán)境，轉移至1 000 mL棕色容量瓶定容，備用。使用時，用雙蒸水稀釋重金屬母液至所需濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同水稻品種重金屬鉈吸收量測定 2019年春于廣州大學生化樓實驗室，將12 d的幼苗浸泡在3.0 mmol/L Ca(NO3)2溶液（pH 6.0）中過夜后放入5 mg/L Tl+處理液中24 h。處理條件為光照強度350 μmol/m2·s，光照12 h/d，溫度28（±2）℃。24 h后取出供試水稻材料，利用移液器取出3 mL培養(yǎng)液通過原子吸收分光光度計測定，記為處理后的培養(yǎng)液重金屬濃度，計算不同品種水稻鉈吸收量：

1.2.2 不同水稻品種根系性狀測定 培養(yǎng)24 h后取出植株放入10 mL無菌水中，收集6 h根系分泌物后，分組放在育苗盆中，照相機拍下根系性狀照片，利用imageJ統(tǒng)計測定根系長度、根系數(shù)量。

1.2.3 不同水稻品種根系有機酸分泌量測定 將處理24 h的水稻苗移至無菌水中收集6 h根系分泌液。將含有根分泌物的無菌水放入-80℃冰箱6 h后，再放入真空冷凍干燥機冷凍干燥至無水分殘留，用1 mL K2HPO4緩沖液（0.01 mol/L，pH 2.75）溶解冷凍干燥后的殘余物，并用針式濾膜（0.45 μm）過濾至高效液相色譜儀（LC-20A，島津，日本）的進樣瓶中，上機測定。樣品測定采用外標法，以保留時間定性，峰面積定量。色譜條件為：色譜柱C18（150 mm×4.6 mm，d×5μm），流動相由0.01 mol/L K2HPO4緩沖液（pH 2.75）和甲醇（體積比97：3）組成，流速為0.6 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL，檢測波長210 nm。

標準曲線制作及標準溶液配置：依據(jù)前期研究，水稻在鉈脅迫下根系分泌單一有機酸-草酸［18］。故準確稱取草酸100 mg，去離子水溶解定容至100 mL作為母液。將這些母液稀釋成不同倍數(shù)的稀釋液(4個梯度)分別上機測定, 每個樣品3次重復, 測定其峰面積, 以平均峰面積(y)對濃度(x)作圖, 繪制標準曲線。

每個水稻品種設置3次重復，每個重復10株苗。測定數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析及差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同水稻品種重金屬鉈吸收量比較

重金屬鉈脅迫處理24 h后，18個水稻品種單位植株鮮重鉈吸收量可分為4個組，各組間吸收量存在差異，但組內無差異：最高吸收量的V1、V2品種，單位植株鮮重鉈吸收量為112.01、107.79 mg/kg；較高吸收量的V3～V7品種，鉈吸收量為78.47～94.68 mg/kg；中等吸收量的V8～V12品種，鉈吸收量為64.06～73.22 mg/kg；較低吸收量的V13～V18品種，鉈吸收量為 55.29～63.81 mg/kg，鉈吸收量最高的V1品種是最低品種V18的2倍（圖1）。

圖1 鉈脅迫下不同水稻品種的吸收差異Fig.1 Absorption differences of different rice varieties under Tl treatment

2.2 不同水稻品種根系性狀與鉈吸收量的關系

為了分析水稻根系性狀與吸收量的關系，測量了18個品種水稻根系總長度和根系數(shù)量，并建立了18個品種鉈吸收量與根總長、鉈吸收量與根數(shù)的相關性（圖2）。如圖2A所示，根系總長度與鉈吸收量線性相關方程為y=-0.0099x +75.767，相關系數(shù)r=-0.014，根系長度與鉈吸收量相關性極低。如圖2B所示，根系數(shù)量與鉈吸收量線性相關方程為y=-0.0889x + 81.187，相關系數(shù)r=-0.135，表明根系數(shù)量與鉈吸收量相關性也很低。

圖2 根系性狀與鉈吸收量的相關性Fig.2 Correlation between root traits and thallium absorption

2.3 不同水稻品種有機酸分泌量比較

進一步研究不同鉈吸收量的水稻品種根系外泌有機酸量與鉈吸收量的關系。選取兩個高吸收量品種V1和V2、兩個中等吸收量品種V6和V7、兩個低吸收量品種V13和V15測定根系外泌有機酸量。如圖3所示，6個品種草酸分泌量在1.46～ 2.11 mg/g 范圍內，其中V2品種草酸分泌量最低，為1.46 mg/g，V15品種草酸分泌量最高，為2.11 mg/g。V2品種草酸分泌量顯著低于V13、V15品種草酸分泌量。

圖3 不同水稻品種草酸分泌量Fig.3 Oxalate secretion of different rice varieties

2.4 有機酸分泌量與鉈吸收量的關系

6個品種鉈吸收量與有機酸分泌量的關系如圖4所示，線性回歸方程為y=-0.0101x + 2.6295，相關系數(shù)r=-0.931（P＜0.01），說明鉈吸收量與有機酸分泌量呈極顯著負相關。

圖4 不同水稻品種草酸分泌量與鉈吸收量的相關性Fig.4 Correlation between oxalate secretion and thallium absorption in different rice varieties

3 討論

重金屬脅迫導致根系細胞結構破壞，細胞凋亡等結果，而植物根系會通過增加邊緣細胞數(shù)目、提高細胞抗逆作用來對抗重金屬脅迫, 水稻苗期根系性狀如總根體積、總根面積、總根長、分枝數(shù)相應也發(fā)生變化。相關研究表明植物根系會通過改變自身形態(tài)和分布來應對土壤中的重金屬等非生物逆境脅迫［6-7］。本試驗對18個水稻品種的鉈吸收能力進行分析，18個水稻品種鉈吸收量在55.29～112.01 mg/kg范圍內，最高吸收量約為最低吸收量的2倍，吸收量均值為74.86 mg/kg。依據(jù)鉈吸收能力分為存在差異的4個組對根系長度和根數(shù)與鉈吸收能力的相關性進行進一步的研究。分析發(fā)現(xiàn)根系長度和根數(shù)均與鉈吸收能力無相關性，根總長和根數(shù)并不會影響水稻對鉈的吸收能力。在衡量水稻鉈吸收量方面，根長和根數(shù)并不是主要的影響因素和指標，還需要擴展其他根系性狀進行進一步的研究。

其他研究者對根系有機酸分泌和重金屬吸收量的研究中發(fā)現(xiàn)，植物受到重金屬脅迫時植物根系分泌出大量有機分泌物,根系分泌的一些有機酸可與重金屬離子形成配位化合物或發(fā)生絡合反應，降低植物根際環(huán)境中有效態(tài)重金屬離子活性和移動性［19］。在蕎麥［20］、小麥［21］、玉米［22］等農作物的研究中發(fā)現(xiàn)根系分泌的有機酸如草酸蘋果酸等可以螯合重金屬離子從而降低植物對重金屬的吸收。根系有機酸在植物抗逆應對重金屬脅迫中起到十分關鍵的作用［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，6個品種有機酸分泌量在1.46～2.11 mg/g范圍內，最高與最低分泌量之間差異顯著。6個品種水稻有機酸分泌與鉈吸收量相關系數(shù)r=-0.931（P＜0.01），說明鉈吸收量與有機酸分泌量呈極顯著負相關，有機酸分泌會降低水稻根系對鉈的吸收?？赡軝C制是水稻根系草酸分泌促進草酸與鉈形成絡合物，降低水稻根系對鉈離子的吸收能力。這提示我們在研究重金屬耐性方面更應該關注植物的生理生化特征，也指明根系有機酸可以作為水稻重金屬吸收能力的重要指示指標。

4 結論

本試驗結果表明，不同水稻品種鉈處理24 h后吸收量在55.29～112.01 mg/kg范圍內，鉈吸收能力上會有一定的差異。篩選出的6個水稻品種有機酸分泌量在1.46～2.11 mg/g范圍內，有機酸分泌量與鉈吸收量呈顯著負相關，相關系數(shù)r=-0.931（P＜0.01），表明不同水稻品種鉈吸收量的差異與根系有機酸的分泌呈顯著負相關，有機酸分泌會降低水稻對鉈的吸收，而與根系長度和根數(shù)性狀沒有相關性。