徐寅，喻斌

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

慢性應(yīng)激性胃潰瘍是一種特殊類型的胃潰瘍，是指在長期嚴(yán)重心理應(yīng)激狀態(tài)下或長期服用對胃黏膜有損害的藥物所致的胃黏膜病變。其發(fā)病機制可能與神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、體液免疫反應(yīng)異常、胃黏膜損傷因素增強或屏障機制減弱、心理應(yīng)激等有關(guān)。前期研究[1-3]發(fā)現(xiàn)肝胃百合湯能有效改善胃潰瘍肝胃氣滯證患者的臨床癥狀，可能通過減少白介素-1(IL-1)、TNF-α等炎性介質(zhì)產(chǎn)生，上調(diào)抗炎因子白介素-10(IL-10)的水平，促進表皮生長因子(EGF)的表達，從而修復(fù)胃黏膜、抗炎癥反應(yīng)的治療作用。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，探討肝胃百合湯對慢性應(yīng)激性胃潰瘍的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康BALB/c小鼠(SPF級)40只，均為雄性，6周齡，體質(zhì)量19～22 g，小鼠購進后常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，無不良反應(yīng)者可納入實驗。實驗動物均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(湘)2011-003。

1.2 實驗藥品

1.2.1 肝胃百合湯

處方：百合15 g，柴胡9 g，郁金9 g，烏藥9 g，川楝子9 g，丹參9 g，白芍9 g，蒲公英15 g，甘草6 g，均購自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。將上述飲片放入涼水中，并沒過藥物5 cm，浸泡30 min后用武火煎煮至沸騰，再用文火煎煮20 min，過濾藥汁。再用相同方法煎煮第二道，將兩次煎煮的藥汁混合后過濾，濃縮至每1 mL含生藥1 g，放置于離心機中去掉殘渣，4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 鹽酸雷尼替丁膠囊

產(chǎn)自佛山手心制藥，規(guī)格為0.15 g/粒，30粒/盒，批號1602224。

1.3 主要實驗儀器及試劑

搖床(其林貝爾TS-92)，恒溫箱(北京六一DYY-6C)，凈化工作臺(YJ 1450)，高速冷凍離心機(TCL16M)，冷凍切片機(萊卡)，切片機(浙江金華益迪試驗器材)，包埋機(常州中威電子儀器)，普通冰箱(榮事達)，精密pH計(雷磁)，數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(GIS-1000)，奧林巴斯攝像顯微鏡(PM 8AD)，Image-Pro-Plus圖像分析軟件(Media Cybernetics)。IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、GC、ACTH、CRH酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購自于Bio-swamp生物技術(shù)公司。

1.4 動物分組及模型制備

將動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后稱質(zhì)量，按體質(zhì)量分層隨機分為空白組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只，用苦味酸標(biāo)記后分組飼養(yǎng)。按照相關(guān)文獻[4-5]選取10種不可預(yù)知刺激因素制備慢性應(yīng)激小鼠模型，并依據(jù)前期預(yù)實驗改進方法，具體方法如下：①潮濕墊料+傾斜飼養(yǎng)、熱水泳、禁食24 h、禁水24 h、夾尾5 min、行為束縛、陌生物品、晝夜交替、陌生氣味。每天隨機從上述10種刺激方式中選取1種，需避免前后兩天使用同一種刺激方式。每日上午9點更換刺激方法，連續(xù)造模28 d。空白組常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食。分別于造模前、造模第14天、第28天觀察小鼠行為學(xué)的改變，利用曠場試驗計算各組小鼠水平、垂直、清潔評分，應(yīng)較空白組明顯減少。抽樣采集小鼠胃組織黏膜，肉眼下及光鏡下發(fā)現(xiàn)潰瘍及糜爛。同時符合以上表現(xiàn)則表明模型制備成功。

1.5 給藥方法及途徑

造模14 d后中藥組給予肝胃百合湯灌胃，給藥量為12.2 g/(kg·d)。西藥組給予鹽酸雷尼替丁膠囊(60 kg成人每次用量0.15 g，2次/d)，給藥前用蒸餾水溶解，給藥量為40 mg/(kg·d)。空白組與模型組則給予同等換算體積的蒸餾水灌胃，灌胃容積按照1 mL/(100 g·d)體質(zhì)量換算。在每日更換造模方法前1 h每組分別給予相應(yīng)藥物或蒸餾水灌胃。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

實驗過程中觀察小鼠毛色、精神狀況、飲食量、大便情況、行為變化等。利用曠場試驗觀察小鼠水平得分(小鼠四爪全部穿越的方格數(shù)，每完全通過1次計1分)、垂直得分(小鼠直立、前爪離開地面或爬在墻壁的次數(shù)，每次計1分)及清潔評分(小鼠清潔自己皮毛的次數(shù)，每清潔1次計1分)。每次評定完后均應(yīng)清理干凈小鼠留在箱內(nèi)的排泄物，防止影響下個動物的評定。取小鼠血清，按照ELISA試劑盒操作步驟檢測IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、GC、ACTH、CRH的含量。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠一般行為學(xué)變化

空白組小鼠精神良好，毛發(fā)濃密，富有光澤，食量正常，活動如常，二便正常，體質(zhì)量有所增長。造模后模型組、中藥組及西藥組小鼠精神欠佳，萎靡不振，毛發(fā)缺乏光澤，食量明顯少于同期空白組小鼠，喜歡聚集，倦怠少動，反應(yīng)遲緩，大便顏色變深甚至出現(xiàn)黑便，體質(zhì)量增長幅度緩慢。各組小鼠給予相應(yīng)灌胃處理后，模型組小鼠精神狀況、食量、活動及大便情況與前相比，未見改善，體質(zhì)量增長緩慢。中藥組小鼠精神狀態(tài)改善，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，反應(yīng)靈敏，活動增多，食量逐漸增加至造模前水平，體質(zhì)量增長幅度較前增加，大便逐漸正常，未再出現(xiàn)黑便。西藥組小鼠精神狀態(tài)較前稍有改善，毛色無明顯改變，食量較前稍有增多，大便顏色仍較深，但未再出現(xiàn)黑便。

2.2 造模前及治療后各組小鼠曠場實驗評分結(jié)果

各組小鼠在造模前行為學(xué)指標(biāo)與體質(zhì)量組間相互比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模14 d后模型組、中藥組、西藥組小鼠水平、垂直、清潔得分明顯下降，體質(zhì)量增長緩慢，與空白組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 造模前及治療后各組小鼠曠場實驗評分結(jié)果(n=10，分，

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與西藥組比較，▲P<0.05

2.3 各組小鼠胃黏膜病理改變

光鏡觀察下，空白組胃黏膜光整平滑，無明顯充血、水腫，極個別可見少量點狀糜爛，未見潰瘍及出血點，可見少量炎性細(xì)胞浸潤。模型組胃黏膜充血、水腫明顯，可見散在糜爛及點狀潰瘍，上皮破損，炎性細(xì)胞浸潤明顯。西藥組胃組織表面尚光整，面膜充血、水腫，可見較多點狀糜爛，未見明顯潰瘍，有較多炎性細(xì)胞浸潤。中藥組胃組織表面比較光整，部分黏膜輕度充血、水腫，有少量點狀糜爛，未見明顯潰瘍，有少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠胃組織病理HE染色圖片(×400倍)

2.4 各組小鼠治療后潰瘍指數(shù)

各組灌胃后，與模型組相比，西藥組、中藥組UI數(shù)值明顯降低，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。中藥組UI與西藥組相比較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中藥組潰瘍抑制率明顯高于西藥組。結(jié)果表明肝胃百合湯可明顯降低小鼠潰瘍指數(shù)，促進潰瘍愈合。見表2。

表2 各組治療后潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較

注：與模型組比較，△P<0.01；與西藥組比較，#P<0.05

2.5 各組小鼠血清中GC、CRH及ACTH含量

與空白組比較，模型組血清GC、CRH、ACTH的含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥組、西藥組上述各指標(biāo)含量與模型組相比明顯減少，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。肝胃百合湯組上述各指標(biāo)含量低于雷尼替丁組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠血清中GC、CRH及ACTH含量

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01；與西藥組比較，▲P<0.05

2.6 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的含量

與空白組比較，模型組血清IL-2、IFN-γ含量明顯升高，IL-4、IL-10的含量明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，中藥組與西藥組血清IL-2、IFN-γ減少、IL-4、IL-10的含量升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。中藥組與西藥組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，治療后的水平更接近空白組。見表4。

表4 各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10含量

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與西藥組比較，#P<0.05

3 討論

社會壓力的日益加大，使得越來越多的人群處于慢性心理應(yīng)激狀態(tài)。機體長期已久的處于應(yīng)激狀態(tài)下，可能導(dǎo)致免疫能力、抗病能力下降，從而產(chǎn)生多種疾??；由慢性心理應(yīng)激誘發(fā)的各種疾病受到了人們更多的關(guān)注。根據(jù)其他文獻研究[4-5]及前期預(yù)實驗，我們選取了10種可行性較高的慢性應(yīng)激的造模方法，隨機選取給予造模；為了成功模擬慢性應(yīng)激，需要適度強度刺激以避免由過度強度引起的急性應(yīng)激；一般情況下，慢性應(yīng)激的時間需在21 d以上，于是我們采取了28 d以模擬充分的應(yīng)激時間。依據(jù)造模過程中曠場試驗小鼠行為學(xué)的改變以及治療前后解剖并活檢的小鼠胃黏膜改變，足以說明運用此種方法可以復(fù)制比較理想的慢性應(yīng)激胃潰瘍小鼠模型。

實驗研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激能改變胃黏膜的炎癥和免疫反應(yīng)[6]。慢性應(yīng)激通過對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的影響，逐漸產(chǎn)生大量炎癥因子，隨著炎癥因子含量升高引起胃黏膜損傷。Th1細(xì)胞可由IL-12、IFN-γ誘導(dǎo)而分化，產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、IL-12等，同時可抑制Th2細(xì)胞的增長；IL-4可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化產(chǎn)生IL-10并與IL-10等細(xì)胞因子一起抑制Th1細(xì)胞增殖。研究指出，胃潰瘍患者血清IL-2、IFN-γ水平較健康人群高，炎癥因子隨著機體防御系統(tǒng)的啟動釋放，當(dāng)炎癥因子達到一定水平后，會打破機體免疫防御系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致機體無法繼續(xù)正常的產(chǎn)生免疫應(yīng)答，過度反應(yīng)增加IL-2、IFN-γ的分泌，并參與胃黏膜損傷過程而加重患者病情。而IL-4、IL-10能抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，發(fā)揮抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清IL-2、IFN-γ含量增高，IL-4、IL-10的含量下降，本實驗論證了慢性應(yīng)激胃潰瘍小鼠存在著Th1/Th2細(xì)胞失衡，提示Th1/Th2細(xì)胞失衡可能是慢性應(yīng)激胃潰瘍的病理基礎(chǔ)之一。

HPA軸是以下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal)興奮為主的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。過度的尤其是慢性應(yīng)激反應(yīng)引起HPA軸持續(xù)激活，造成糖皮質(zhì)激素濃度長期處于高水平狀態(tài)，從而導(dǎo)致機體出現(xiàn)不同程度的生理、心理障礙，甚至引起軀體疾病。研究認(rèn)為[7]，機體神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)，胃黏膜損傷因子作用相對增強，保護因子及其機制削弱等多方面因素都與應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生有關(guān)。其發(fā)生的中樞機制可能是通過下丘腦-交感神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦-迷走神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)發(fā)揮作用，并進一步影響胃酸分泌及胃黏膜血流量導(dǎo)致潰瘍產(chǎn)生[8]。慢性應(yīng)激能改變胃黏膜的炎癥和免疫反應(yīng)，黏膜免疫系統(tǒng)可以由中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)和糖皮質(zhì)激素(GC)產(chǎn)物調(diào)節(jié)。同時慢性應(yīng)激也可以影響HPA軸，上調(diào)GC的代謝產(chǎn)物，從而影響胃黏膜。其中，糖皮質(zhì)激素可以使胃壁細(xì)胞數(shù)目增多，胃酸和胃蛋白酶分泌增多，導(dǎo)致胃黏膜糜爛、潰瘍愈合延遲[9]，同時糖皮質(zhì)激素還抑制胃黏膜細(xì)胞更新，破壞胃黏膜的完整性，以及HPA軸的亢進使得機體對外源性應(yīng)激因子的易感性增加，都被認(rèn)為是HPA軸功能異常而導(dǎo)致胃腸道損傷的途徑。本研究結(jié)果提示模型組小鼠血清GC、ACTH、CRH均升高，證實了慢性應(yīng)激胃潰瘍小鼠HPA軸的失常。

中醫(yī)學(xué)無“胃潰瘍”病名，根據(jù)慢性應(yīng)激的臨床表現(xiàn)多認(rèn)為本病與“胃脘痛”“胃瘍”更為接近，病位多責(zé)之于肝、胃、脾。慢性應(yīng)激性胃潰瘍從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來說，多與心理應(yīng)激因素有著重要的關(guān)系。肝胃百合湯由已故名老中醫(yī)夏度衡教授創(chuàng)制，夏老根據(jù)古時歷代醫(yī)家著作及自身多年行醫(yī)經(jīng)驗，提出“后天脾胃難離肝”的觀點，在遣方用藥時非常重視肝胃之間的關(guān)系。肝胃百合湯對慢性應(yīng)激胃潰瘍小鼠胃黏膜損傷的干預(yù)作用，且效果優(yōu)于H2受體阻滯劑(雷尼替丁)，可能是通過使Th1細(xì)胞合成IL-2、IFN-γ的能力相對降低，分泌到血漿中的IL-2、IFN-γ也隨之減少，使炎癥反應(yīng)減輕，同時Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-10水平也上調(diào)而抑制了炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，Th1/Th2細(xì)胞間的失衡也得以糾正；減少GC、CRH、ACTH分泌，使糖皮質(zhì)激素正常發(fā)揮對HPA的負(fù)反饋機制，以減輕并修復(fù)胃黏膜損傷，促進潰瘍愈合。本研究結(jié)果提示肝胃百合湯治療慢性應(yīng)激性胃潰瘍不僅局部修復(fù)胃黏膜損傷，且調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞間平衡和調(diào)節(jié)HPA軸，從神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)途徑減少胃黏膜損傷，修復(fù)胃黏膜，治療慢性應(yīng)激胃潰瘍。