吳福林，王涵，董慶海，曹瑩，譚靜，林紅強，李平亞

(吉林大學藥學院，吉林 長春 130021)

婦科血瘀證是以疼痛、腫塊、出血色紫暗或夾有瘀塊等為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，是婦科臨床常見的一種病證[1]。中醫(yī)學認為,婦科血瘀證可由情志內(nèi)傷、寒邪侵襲、環(huán)境改變等多種原因誘發(fā),其病機實質(zhì)是瘀阻沖任、胞宮、胞脈,并有不同程度的全身血液運行障礙，主要治療的方法為活血化瘀法?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明,婦科血瘀證發(fā)生機理可能主要在于血液流變學、血流動力學、病理結(jié)構(gòu)的改變及體內(nèi)免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)的改變等方面[2]。臨床實踐發(fā)現(xiàn)，氣滯血瘀和寒凝血瘀二種血瘀證類型最為常見[3]。

止痛化癥膠囊(ZhiTong HuaZheng Capsule, ZTHZC)，是由黨參等19味中藥炮制而成。用于氣虛血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、癥瘕，癥見行經(jīng)后錯、經(jīng)量少、有血塊、行經(jīng)小腹疼痛、腹有癥塊；慢性盆腔炎見上述證候者[4]。近年來，ZTHZC廣泛用于治療痛經(jīng)、盆腔炎、子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病等婦科疾病[5-8]，臨床效果較好，但其作用機制還不明確。本研究通過皮下注射腎上腺素結(jié)合冰水浴建立大鼠急性血瘀證模型，探究止痛化癥膠囊對血瘀模型大鼠血液流變學、血漿GMP-140及vWF含量的影響，為闡明止痛化癥膠囊的藥效物質(zhì)基礎及作用機制提供一定的科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥品與試劑

止痛化癥膠囊,批號：160502，國藥準字Z22020845，吉林金寶藥業(yè)股份有限公司；桂枝茯苓膠囊，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z10950005，產(chǎn)品批號：171113；鹽酸腎上腺素注射液，上海禾豐制藥有限公司出品，國藥準字H31021344,批號：41170602；大鼠血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)ELISA檢測試劑盒，批號：E20181201A，北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；大鼠血管性血友病因子(vWF)ELISA檢測試劑盒，批號：E20181201A，北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 實驗儀器

FA1104N型萬分之一電子分析天平(上海菁華科技儀器有限公司)；T.G.L-16-aR飛鴿牌離心機(上海安亭科學儀器廠)；KES-900B型血流變檢測儀(無錫康爾生儀器公司)；TECAN SUNRISE 酶標儀(瑞士帝肯集團公司)；DHG-9053A型電熱恒溫干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設備廠)。

1.3 實驗動物

取Wistar雌性大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，購置于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，質(zhì)量合格證號：No.SCXK(遼)2015-0001。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及給藥

按照大鼠的體質(zhì)量隨機分成正常對照組、血瘀模型組、止痛化癥膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組及陽性對照組共6組，每組8只。止痛化癥膠囊高、中、低劑量分別為1.60 g/kg、0.80 g/kg和0.4 g/kg，陽性對照組為桂枝茯苓膠囊，劑量為1 g/kg。在室溫(22±2)℃，濕度為40%～60%的飼養(yǎng)室中，適應性飼養(yǎng)1周后，次日上午開始灌胃給藥，灌胃劑量為10 mL/kg，實驗過程中正常對照組及血瘀模型組給予等量的蒸餾水，各給藥組均給予供試藥液，連續(xù)給藥7 d。

2.2 急性血瘀模型的制備

除對照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，給藥1 h后，除對照組大鼠外，其它各組大鼠放置0～2℃冰水中，浸泡游泳4 min，連續(xù)進行7 d，并于第7天末次給藥1 h后，給大鼠皮下注射0.1%腎上腺素2次，劑量為0.8 mL/kg ，中間相隔時間為4 h，在第 1 次大鼠皮下給予鹽酸腎上腺素注射液 0.8 mg/kg，2 h后，將大鼠置于0～2℃冰水中，浸泡游泳4 min，再過2 h后，注射第2次鹽酸腎上腺素注射液，造成大鼠急性血瘀證模型[9]。

2.3 血液流變學指標的測定

給大鼠第2次注射腎上腺素后，將大鼠禁食不禁水12 h，次日，除對照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛將其麻醉 ，進行大鼠腹主動脈取血。將血液放置在肝素抗凝管中，然后測定大鼠全血黏度和血漿黏度。首先，將放置肝素抗凝管中的血液取出適量，用血流變檢測儀對全血黏度的低切(10/s)、中切(60/s)及高切(150/s)進行測定，然后將余下全血離心10 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，取血漿適量進行血漿黏度(140/s)測定。所有的實驗操作在采血后3 h內(nèi)完成。

2.4 血漿GMP-140及vWF含量的測定

給大鼠第2次注射腎上腺素后，將大鼠禁食不禁水12 h，次日，除對照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛將其麻醉 ，進行大鼠腹主動脈取血，將血液放置在肝素抗凝管中離心10 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/min。吸取上層血漿，分別按照大鼠血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)及大鼠血管性血友病因子(vWF)試劑盒說明書進行測定含量。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

3 實驗結(jié)果

3.1 止痛化癥膠囊對血液流變學的影響

通過對比模型組與對照組數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，模型組大鼠全血高、中、低切黏度均明顯增加，血漿黏度明顯增加，數(shù)據(jù)表明，大鼠急性血瘀模型復制成功。對照組急性血瘀模型大鼠全血高、中、低切黏度及血漿黏度顯著降低(P<0.05，P<0.01)。止痛化癥膠囊中、高劑量組顯著低于模型組血漿黏度以及全血黏度(P<0.01)，低劑量組明顯降低模型大鼠全血高、中切黏度及血漿黏度(P<0.05)。表明止痛化癥膠囊能夠影響急性血瘀模型大鼠的血液流變學，效果顯著，見表1。

表1 止痛化癥膠囊對血瘀模型大鼠全血黏度及血漿黏度的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.2 止痛化癥膠囊對血漿GMP-140及vWF含量的影響

通過比較模型組與對照組，結(jié)果表明，模型組大鼠血漿GMP-140及vWF含量明顯增加(P<0.01)。與血瘀模型組相比，桂枝茯苓膠囊能夠明顯降低急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF水平(P<0.01)。止痛化癥膠囊低、中、高劑量組均可使急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量明顯減低(P<0.01)。研究表明，止痛化癥膠囊可使急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF水平明顯降低。見表2。

表2 止痛化癥膠囊對血瘀模型大鼠血漿GMP-140 及vWF含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

4 討論

血瘀證在婦科中是一種常見的疾病,血液循環(huán)受到阻礙，瘀血在體內(nèi)運行不暢均對婦女造成傷害[10]。ZTHZC廣泛運用于治療婦科疾病，其丹參素，丹酚酸B等活性成分已被報道具有抗血栓、抗動脈粥樣硬化及改善血液循環(huán)的作用[11-12]。血液流變學能夠評估血液循環(huán)狀態(tài)，可以作為一種檢測指標[13]，當血液流變學發(fā)生異常，就會使人體內(nèi)的血液循環(huán)產(chǎn)生阻礙，就會發(fā)生血瘀證，誘發(fā)各種疾病。GMP-140是血小板α顆粒膜蛋白，是血小板活化的標志性成分。GMP-140可參與血小板與單核巨噬細胞及內(nèi)皮細胞的相互作用，能夠反映出體內(nèi)血小板的活化程度和聚集，對血栓的形成具有監(jiān)督作用[14-15]。血管性血友病因子vWF可以作為內(nèi)皮細胞受到傷害的標志性成分，是一種血管內(nèi)皮細胞和巨核細胞合成的糖蛋白。當內(nèi)皮細胞受到損害時，可參與血小板的相互作用，使血小板發(fā)生聚集、黏附，導致血栓的發(fā)生[16-17]。

本研究首次采用皮下注射腎上腺素結(jié)合冰水浴建立大鼠急性血瘀證模型，通過檢測血液流變學及GMP-140、vWF試劑盒，探究ZTHZC改善血瘀證的藥效學研究。結(jié)果表明ZTHZC中、高劑量組能夠降低血瘀模型大鼠全血高、中、低切黏度，也使血漿黏度顯著降低(P<0.01)，低劑量組也能夠降低模型大鼠全血高、中切黏度降低和血漿黏度(P<0.05)，有明顯改善急性血瘀模型大鼠的血液流變學作用。ZTHZC各劑量組均能夠明顯降低急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量(P<0.01)，從而影響血小板相互作用及活化而達到抗血瘀效果。研究表明，ZTHZC可以顯著改善血液流變學的相應指標，具有改善血瘀證的藥效作用，下一步將從ZTHZC改善血瘀的代謝組學進行分析，明確相關代謝通路，為闡明ZTHZC的作用機制提供科學依據(jù)。