陳媛媛，賴美紅，贠小蕓，王 魁，徐 暉

（廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室（廣州中醫(yī)藥大學），國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣州510006）

毛冬青Ilex pubescensHook.et Arn.為冬青科冬青屬的植物，其根和葉均可入藥，是南方常用中藥材，具有清熱解毒、活血通脈、消腫止痛等功效［1］。近年研究表明，毛冬青對于心腦血管疾病以及腎病、婦科疾?。?-5］有一定的治療價值。

毛冬青的主要有效成分為三萜及三萜皂苷，而且大部分為熊果烷型［6-8］（α-amyrin衍生物），少數(shù)為齊墩果烷型（β-amyrin衍生物）。三萜類化合物雖然在植物中廣泛存在，但人們對其具體的生物合成途徑了解還不十分全面，對毛冬青三萜類化合物的生物合成途徑的認識亦是如此。三萜化合物的生物合成過程可大致分為前體形成、骨架構(gòu)建以及骨架修飾三個環(huán)節(jié)［9-11］。骨架的修飾過程是植物調(diào)控形成眾多種類單體皂苷的重要過程，機制至今尚未完全闡明。

細胞色素P450酶（CYP450）是一類在自然界中廣泛存在，具有氧化功能的亞鐵血紅素蛋白酶家族，參與微生物、動物、植物體內(nèi)各種代謝反應。在植物中，CYP450在萜類、黃酮類、生物堿類、植物激素等多種物質(zhì)的生物合成中都發(fā)揮重要的生理功能［12］。在三萜皂苷的生物合成途徑下游，CYP450起著對三萜骨架的修飾作用，豐富了結(jié)構(gòu)多樣性，是植物體內(nèi)含有種類繁多的三萜類化合物的因素之一［11］。因此，細胞色素P450基因（CYP450）的鑒定是揭示三萜生物合成機制的關(guān)鍵。

近幾年，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學方法成為篩選鑒定CYP450基因的重要手段之一。Luo等［13］對三七根進行了轉(zhuǎn)錄組測序，并從中篩選到了可能參與三七皂苷生物合成的兩個細胞色素P450基因（Pn02132和Pn00158）和一個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（Pn00082）。Misra等［14］將茉莉酸甲酯誘導前后的紫花羅勒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建成EST文庫，從中挖掘并鑒定了兩個參與三萜C-28位氧化的基因，CYP716A252和CYP716A253。

釀酒酵母自身的生物合成途徑能夠產(chǎn)生三萜皂苷前體2，3-氧化鯊烯［15］，被廣泛用于三萜化合物合成相關(guān)基因的功能研究。本課題組前期構(gòu)建了一株高產(chǎn) amyrin（α-amyrin和 β-amyrin）的釀酒酵母菌株WAT11tfAX，可作為研究五環(huán)三萜類化合物合成相關(guān)CYP450基因功能的宿主（未公開發(fā)表數(shù)據(jù)）。毛冬青中三萜類化合物的C-28位多被氧化為羧基，因此本研究利用課題組前期獲得的毛冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（Genbank Accession No.SRP102344）［16］，對毛冬青中的三萜 C-28位氧化酶基因進行挖掘，并通過在酵母工程菌中進行異源表達來確定其功能。

1 材 料

1.1 植物來源

本實驗所用植物為毛冬青，采自廣州中醫(yī)藥大學大學城校區(qū)藥王山，植株經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥資源與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為毛冬青Ilex pubescensHook.et Arn.。

1.2 培養(yǎng)基

LB／Amp培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，121℃滅菌20 min，加入氨芐青霉素使終濃度為100μg／mL。

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，121℃滅菌20 min，用前加入過濾除菌的葡萄糖溶液使終濃度為2%。

色氨酸缺陷（SC-T）培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源6.7 g，缺陷型氨基酸（不含色氨酸）1.92 g，121℃滅菌20 min，用前加入過濾除菌的葡萄糖或半乳糖溶液使終濃度為2%。

固體培養(yǎng)基配制時在上述培養(yǎng)基中加入2%瓊脂粉。

1.3 菌株和質(zhì)粒

大腸埃希菌Escherichia coliTrans1-T1（基因型：F-φ80（lacZ）ΔM15ΔlacX74hsdR（r-k，mk+）ΔrecA1398endA1tonA），購自北京全式金公司。

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeWAT11tfAX（基 因 型：WAT11，trp1：：PGAP1-SctHMGR1-TCYC1，ura3：：PGAP1-ScERG20-TCYC1，leu2：：PGAP1-SeACSL641PTCYC1，his3：：PTEF1-IaAS1-TCYC1），實驗室保存。

質(zhì)粒pEASY（購自北京全式金公司），質(zhì)粒pESC-TRP（Stratagene，實驗室保存），質(zhì)粒 pEASYIpAO2、質(zhì)粒pESC-TRP-IpAO2（本研究構(gòu)建）。

1.4 試 劑

大腸埃希菌培養(yǎng)用的LB培養(yǎng)基，釀酒酵母培養(yǎng)用的YPD培養(yǎng)基購自英國Oxiod公司，SC-T培養(yǎng)基購自美國Sigma公司。

PrimeSTAR Max酶（大連TaKaRa公司）；植物RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（廣州美基公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、零背景克隆試劑盒、抗His標簽小鼠抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（北京全式金公司）；限制性內(nèi)切酶（英國NEB公司）；ClonExpress IIOne Step Cloning Kit（南京諾唯贊公司）；葡萄糖、半乳糖、氨芐青霉素（北京 Coolaber公司）；α-amyrin、β-amyrin、熊果酸、齊墩果酸對照品（上海甄準公司）；色譜正己烷（天津科密歐公司）；BSTFA（美國Sigma公司）；其余試劑均為市售分析純。

1.5 儀 器

PCR儀（蘇州東勝公司）；TGem微量分光光度計（北京天根公司）；mini-protan小型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（法國Vilber公司）；Agilent 7980B氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（美國Agilent公司）。

2 方 法

2.1 毛冬青三萜C-28位CYP基因的篩選及其編碼氨基酸的序列分析

在前期獲得的毛冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢索出注釋為“cytochrome P450”且長度大于1 100 bp的Unigene，將篩選出的CYP基因可能編碼的氨基酸序列與已鑒定參與三萜C-28位氧化的CYPs氨基酸序列（共13個）合并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。所用軟件為MEGA 7.0，方法選擇鄰接法。用ESPript 3.0在線工具（http：／／espript.ibcp.fr／ESPript／cgi-bin／ESPript.cgi）對篩選出的CYP氨基酸序列進行比對分析。

2.2 目的基因的克隆

提取毛冬青嫩葉的總RNA，以其為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)篩選得到的Unigene 0036170（命名為IpAO2）DNA序列設計特異性引物AO2-F和AO2-R（引物序列見表1），用PrimeSTAR Max高保真酶PCR擴增基因。PCR程序為：98℃2 min，98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增得到的DNA片段，切膠回收后測定DNA的濃度，用零背景克隆試劑盒將IpAO2基因連接到pEASY克隆載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTrans1-T1感受態(tài)細胞，菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基（含100 μg／mL氨芐青霉素），于37℃培養(yǎng)過夜后挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，陽性克隆進一步通過測序驗證。將獲得的含IpAO2基因的質(zhì)粒命名為pEASY-IpAO2。

2.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將酵母表達載體pESC-TRP用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI進行雙酶切，回收載體片段。以pEASY-IpAO2為模板，設計引物 V-AO2-F和V-AO2-R（引物序列見表1），進行PCR擴增，獲得DNA片段，切膠回收后用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit將其插入pESC-TRP的多克隆位點2。陽性克隆的篩選步驟同上。將獲得的質(zhì)粒命名為pESC-TRP-IpAO2。

Table 1 Primers used in this study

2.4 在酵母中表達毛冬青IpAO2基因

將質(zhì)粒pESC-TRP-IpAO2用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeWAT11tfAX中，菌液均勻涂布于SC-T固體培養(yǎng)基（含葡萄糖），平板在30℃培養(yǎng)48 h。挑取重組酵母單菌落接種于SC-T液體培養(yǎng)基（含葡萄糖）15 mL中，30℃，225 r／min培養(yǎng)36 h后，換至SC-T液體培養(yǎng)基100 mL中（含半乳糖），誘導培養(yǎng)7 d。

2.5 Western blot分析

取誘導后8 h的酵母菌體，提取酵母細胞的總蛋白進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后取下凝膠轉(zhuǎn)膜，再經(jīng)一抗、二抗標記后，用化學發(fā)光法顯影，以轉(zhuǎn)化了空載體pESC-TRP的菌株為陰性對照。

2.6 重組酵母代謝產(chǎn)物的提取和分析

離心收集酵母菌體，加入提取液（40%KOH-無水乙醇，1∶1）10 mL，混勻后水浴加熱回流30 min，調(diào)節(jié)提取液pH至2.0～2.5，用等體積的正己烷萃取3次，分取正己烷層，揮干，殘渣加BSTFA硅烷化試劑衍生化，然后用GC-MS進行檢測。

氣相條件：進樣口溫度為 250℃；進樣量1μL，不分流；色譜柱為 HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25μm）；柱溫箱升溫程序150℃起始，保持1 min，以10℃／min升至300℃，保持20min；載氣為He，柱流量0.7 mL／min。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子掃描范圍50～600m／z，四極桿溫度150℃，離子源溫度230℃，GC-MS連接口溫度280℃，化合物檢索的譜庫為NIST14.L。

2.7 IpAO2蛋白結(jié)構(gòu)的預測

用 Phyre2在線工具（http：／／www.sbg.bio.ic.ac.uk／phyre2／html／page.cgi？id=index）預 測IpAO2蛋白的跨膜域和蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 果

3.1 IpAO2基因的篩選及其編碼蛋白的序列分析

將從毛冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢索篩選出的可能編碼CYP450的Unigenes對應氨基酸序列與文獻報道已知參與五環(huán)三萜C-28位氧化的CYP450氨基酸序列（共13個）合并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖1。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)Unigene 0036170與其它已知的催化C-28位氧化的CYP450聚為一支，推測其編碼的蛋白很可能具有類似功能，參與毛冬青五環(huán)三萜的C-28位氧化。將該基因命名為IpAO2，其包含一個1 443 bp的開放閱讀框，編碼480個氨基酸。

將IpAO2基因編碼的氨基酸序列與CYP716A154、 CYP716A252、 CYP716A253、CYP716A52v2、CYP716A75、IpAO1的氨基酸序列進行比對，結(jié)果見圖2，分析結(jié)果顯示IpAO2與上述三萜C-28位氧化酶CYP450序列相似性較高，可達70%，進一步說明IpAO2可能具有類似的功能。

3.2 IpAO2基因在酵母中的異源表達

將獲得的重組酵母菌株S.cerevisiaeWAT11tfAX／pESC-TRP-IpAO2命名為 strain 1，質(zhì)粒上的GAL1啟動子被2%半乳糖誘導激活，啟動轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，表達IpAO2基因。提取重組釀酒酵母strain 1的總蛋白后，利用目的蛋白序列C端連接的6×His抗原標簽進行Western blot實驗。結(jié)果（圖3）表明酵母合成了和預期大小相符的重組蛋白（55.2 kD）。

3.3 重組酵母代謝產(chǎn)物分析

收集誘導培養(yǎng)7 d后的重組酵母菌體，提取其代謝產(chǎn)物，硅烷化后用GC-MS進行檢測。圖4分別為總離子流圖（A）、質(zhì)譜圖（B）以及選擇離子流圖（C）。在轉(zhuǎn)化了空載體pESC-TRP的酵母代謝產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)在保留時間11.9和12.3 min處出現(xiàn)了預期的β-amyrin（Peak 1）色譜峰和 α-amyrin色譜峰（Peak 2），雖然與標準品β-amyrin和α-amyrin的保留時間存在一定漂移，但選擇離子流圖顯示檢測到了特征離子峰（m／z498.4、218.2、189.1），且質(zhì)譜離子碎片也與標準品一致；轉(zhuǎn)化了IpAO2基因的重組酵母strain 1的代謝產(chǎn)物中，除了在11.9 min和12.3 min時仍能檢測到底物β-amyrin（Peak 1）、α-amyrin（Peak 2）外，還出現(xiàn)了4個新的色譜峰Peak 3（14.7min）、Peak 4（15.5min）、Peak 5（14.1 min）和Peak 6（15.6 min）。通過NIST14.L譜庫檢索，4個新的化合物初步確認分別為oleanolic acid（匹配度 93%）、ursolic acid（匹配度 95%）、uvaol（匹配度94%）和ursolic aldehyde（匹配度99%）。Peak 3和Peak 4分別與相應的齊墩果酸和熊果酸標準品的保留時間存在一定漂移，但選擇離子流圖顯示檢測到了特征離子峰（m／z585.5、320.2、203.2），且質(zhì)譜離子碎片也與標準品一致，說明了菌株strain 1生成了齊墩果酸和熊果酸。由此，推斷IpAO2基因編碼一個三萜C-28位氧化酶，能夠分別催化底物β-amyrin和α-amyrin氧化生成齊墩果酸和熊果酸。

3.4 IpAO2蛋白結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果

Phyre2在線工具預測結(jié)果見圖5，IpAO2預測為跨膜蛋白，跨膜區(qū)域為12 aa至27 aa。以lanosterol 14-alpha demethylase（PDB ID：c4lxjA）為模板同源建模，3D模型的覆蓋率達96%，可信度為100%。比對預測3D模型和模板的骨架原子，模型整體結(jié)構(gòu)均方根RMS為2.54?。

Figure1 Phylogenetic tree analysisComplete amino acid sequences of pentacyclic triterpene C-28 modifying cytochrome P450 monooxygenases（CYP450s），together with that of Ilex pubescens unigene 0036170 were analyzed by MEGA7.0.Sequence alignmentwas carried out following CLUSTALW analysis and the phylogenetic tree was built using the neighbor-joiningmethod.Evolutionary distanceswere computed using the Poisson correction method.The sequence numbers of the proteins used for tree building are as follows：Arabidopsis lyrata subsp.lyrata CYP716A1（EFH44718.1），Arabidopsis thaliana CYP716A2（BAU61505.1），Medicago truncatula CYP716A12（ABC59076.1），Vitis vinifera CYP716A15（BAJ84106.1），Vitis vinifera CYP716A17（BAJ84107.1），Maesa lanceolata CYP716A75（AHF22088.1），Barbarea vulgaris subsp.Arcuata CYP716A80（ALR73782.1），Barbarea vulgaris subsp.Arcuata CYP716A81（ALR73781.1），Panax ginseng CYP716A52v2（AFO63032.1），Catharanthus roseus CYP716A154（AEX07772.1），Ocimum basilicum CYP716A252（AFZ40057.1），Ocimum basilicum CYP716A253（AFZ40058.1），Ilex pubescens IpAO1［17］（a homolog of CYP716A210，MH370828）.Outgroup：Pseudomonas putida CYP101A1（P00183.2）

Figure 2 Multiple sequence alignments of IpAO2 with other known CYP450s

Figure3 Western blot analysis of recombinant protein expressed in S.cerevisiae WAT11tfAX

Figure4 In vivo enzymatic activity assay in yeastA：Total ion chromatograms（TICs）of yeast extracts.Mixture ofβ-amyrin（1），α-amyrin（2），oleanolic acid（3）and ursolic acid（4）was used as standrad sample；B：Mass fragmentation patterns obtained from authentic standards and yeastextracts；C：The abundancee of selected ion chromatograms of strain 1 extract

Figure5 Predicted transmembrane helices（A）and protein 3Dmodel of IpAO2（B）Image coloured by rainbow N→C terminus Model dimensions（?）：X：84.889 Y：64.537 Z：62.809

4 討 論

植物次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復雜多樣，許多具有廣泛的生物學活性。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成與調(diào)控也日益受到關(guān)注。毛冬青三萜類化合物具有抗炎、降壓、抗凝血等藥理活性［18］，為毛冬青的主要藥效成分，具有較高的藥物開發(fā)價值，但對于其生物合成途徑，特別是對下游部分的認識還非常有限。本研究發(fā)掘并鑒定了1個具有五環(huán)三萜C-28位氧化功能的CYP450基因——IpAO2，其編碼的蛋白能將底物α-amyrin和β-amyrin氧化為熊果酸和齊墩果酸。實驗中還檢測到uvaol（Peak 5）和ursolic aldehyde（Peak 6），但限于沒有標準品，無法確證。文獻報道［19-21］多個五環(huán)三萜C-28位氧化酶是通過連續(xù)的三步氧化反應將底物C-28的甲基氧化為羧基，因此推測 IpAO2也是通過催化 α-amyrin生成uvaol、ursolic aldehyde，最終形成熊果酸。IpAO2基因的鑒定豐富了對毛冬青中三萜化合物下游生物合成路徑的認知，同時為后期進一步利用代謝工程手段在釀酒酵母中生產(chǎn)以熊果烷型為主的三萜化合物奠定了基礎。

據(jù)文獻報道，已知的具有五環(huán)三萜C-28位氧化功能的CYP450多以香樹脂醇和羽扇豆醇作為底物，如Medicago truncatula中的CYP716A12能夠分別氧化α-amyrin，β-amyrin和羽扇豆醇生成熊果酸、齊墩果酸和白樺脂酸［22］，Panax ginseng中的CYP716A52v2［23］和Maesa lanceolata中 的CYP716A75［20］具有 β-amyrin的 C-28位氧化功能。本研究發(fā)現(xiàn) IpAO2能夠同時氧化 α-amyrin和β-amyrin，與前期已鑒定的毛冬青另一個C-28位氧化酶IpAO1功能相同，但氨基酸序列相似性僅為78.79%。不同的三萜C-28位氧化相關(guān)CYP450對底物是否存在選擇性差異，具體哪些關(guān)鍵氨基酸殘基決定了底物的特異性等問題值得深入研究。