徐宏江，施 偉，宋 偉，張 穎，趙凱迪，張寅生，楊 玲，汪紀(jì)楠

（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司研究院，江蘇省抗病毒靶向藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210042）

異甘草酸鎂具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，臨床應(yīng)用廣泛［1-3］。而用于異甘草酸鎂藥理機(jī)制研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣t局限于體外細(xì)胞模型或藥物、毒物誘導(dǎo)的肝損傷動(dòng)物模型，與真實(shí)的乙型肝炎病毒（HBV）感染導(dǎo)致的炎性病理?yè)p傷機(jī)制相差較遠(yuǎn)，因此使用適當(dāng)?shù)牟《靖腥緞?dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究顯得尤為必要。

目前已知除人以外，HBV只能感染猩猩等少數(shù)物種［4-5］，而用此類動(dòng)物制作HBV感染模型具有一定的局限性，因此尋找替代動(dòng)物模型尤為必要。前人已在鴨、鵝、土撥鼠和絨毛猴體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一系列HBV相關(guān)的嗜肝病毒［6］，其中土撥鼠和北京鴨是已建立的HBV相關(guān)動(dòng)物模型的代表，但主要缺點(diǎn)是其肝病毒種屬與人HBV在遺傳學(xué)上相差較遠(yuǎn)。研究人員在1985年率先使用受精卵顯微注射法構(gòu)建了部分HBV基因以及全長(zhǎng)、1.1倍、1.2倍和2.0倍全長(zhǎng)HBV基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠模型［7-8］，但這些小鼠的HBV復(fù)制表達(dá)水平不夠理想。目前最廣泛使用的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠是Guidotti等［9］報(bào)道的1.3倍全長(zhǎng)HBV基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠，該品系小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生乙型肝炎表面抗原（HBsAg），乙型肝炎核心抗原（HBcAg），乙型肝炎E抗原（HBeAg）和完整的病毒顆粒，而且HBV復(fù)制水平較高，是理想的研究乙型肝炎治療藥物和抗病毒藥物篩選的動(dòng)物模型。

使用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠研究抗炎保肝藥物時(shí)，關(guān)鍵之處在于小鼠肝臟是否會(huì)發(fā)生類似肝炎的免疫病理?yè)p傷。康愛君等［10］研究發(fā)現(xiàn)C57BL／6J-Tg（Alb1HBV）44Bri轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟產(chǎn)生局部明顯的炎癥反應(yīng)且發(fā)現(xiàn)兩只48周齡小鼠患肝細(xì)胞癌。Huang等［11］將1.2倍全長(zhǎng)HBV基因組利用腺病毒載體結(jié)合水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染野生型C57BL／6小鼠肝細(xì)胞，HBsAg表達(dá)可持續(xù)6個(gè)月，并且小鼠肝臟可發(fā)生類似肝炎的免疫病理?yè)p傷，甚至能夠誘發(fā)肝癌［12］。因此類似肝炎的免疫病理?yè)p傷可能同時(shí)與HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳背景和日齡相關(guān)，即HBV高水平復(fù)制表達(dá)的持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，肝臟出現(xiàn)炎性病理?yè)p傷的概率越大、程度越深。

本研究采用較大月齡（6月齡）的C57BL／6JTg（Alb1HBV）44Bri轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象，一方面考察該轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟病理?yè)p傷情況，為今后的抗炎保肝藥物篩選工作選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型；另一方面在此基礎(chǔ)上初步探索了異甘草酸鎂的抗炎保肝機(jī)制，為今后的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

異甘草酸鎂注射液（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測(cè)定試劑盒和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測(cè)定試劑盒（浙江藍(lán)森生物科技有限公司）；HBsAg診斷試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）；FITCRat Anti-Mouse CD4、APC Rat Anti-Mouse CD8a、CD11b-PE-Cyanine7抗 體、Ly6G-PE抗體、Ly6C-FITC抗體、CBA小鼠Th1／Th2／Th17測(cè)定試劑盒（美國(guó) BD公司）；CD45-APCVio770抗 體、Rat lgG2a-FITC、Rat lgG2b-APCVio770、FcR Blocking Reagent、10×紅細(xì)胞裂解液（德國(guó) Miltenyi Biotec公司）；F4／80-APC抗體、Rat lgG2a-PE、Rat lgG2a Iso control-APC、Rat lgG2a Iso control PE-Cy7（美國(guó)eBioscience公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

XL-300全自動(dòng)生化儀（德國(guó) ERBA公司）；Thermo varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、NanoDrop 2000C核酸定量?jī)x（美國(guó)Thermo公司）；LC-480II熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；Accuri C6流式細(xì)胞儀、BD FACSCanto II（美國(guó)BD公司）。

1.3 動(dòng) 物

20只雄性清潔級(jí) C57BL／6J-Tg（Alb1HBV）44Bri小鼠購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部），許可證號(hào)SCXK（京）2011-0012，體質(zhì)量18～22 g，日齡135～150 d。

1.4 引 物

GAPDH-F引物（GCCAAGAGGGTCATCATCTC）；GAPDH-R 引 物 （CCTTCCACAATGCCAAAGTT）；50.4-ayw-HBsAg-F引 物 （TGTACCAAACCTTCGGACGG）；50.4-ayw-HBsAg-R引物（ATGCTGTACAGACTTGGCCC）。以上引物均為上海生工生物工程有限公司提供。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組和處理

將飼養(yǎng)30 d（180日齡）的HBV小鼠（d0）稱重，隨后進(jìn)行眼眶內(nèi)眥取血約150μL，分離血清，用XL-300全自動(dòng)生化儀檢測(cè)AST和ALT，間隔5 d后（d6）再次取血測(cè)定。結(jié)合d0和d6天的體重和血清轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定結(jié)果，將小鼠平均分成對(duì)照組和異甘草酸鎂［15 mg／（kg·d）］組，每組10只。

于分組當(dāng)天（d6）灌胃給藥（異甘草酸鎂組）或生理鹽水（對(duì)照組），給藥或生理鹽水體積0.1 mL／10 g，1次／天，連續(xù)給藥 5周，每周（d13、d20、d27、d34、d41）稱量體重并于給藥前取血約200μL，取血前禁食10～12 h。至第42天，每組留2只，其余小鼠給藥前取血、取材用于測(cè)定不同指標(biāo)。用麻醉劑（異氟烷）麻醉后心臟采血，每只動(dòng)物采2管全血待測(cè)血液淋巴細(xì)胞分群，部分血液樣本分離血清檢測(cè)HBsAg和細(xì)胞因子。心臟采血后處死小鼠，立刻取部分肝臟放入液氮凍存待測(cè)HBsAgmRNA；取部分肝臟用10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，用于組織病理學(xué)檢測(cè)。

2.2 隨增齡小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)

每周采集的部分血清按照天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行處理和操作，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清AST和 ALT。

2.3 隨增齡小鼠血清HBsAg檢測(cè)

將d0和d20采集的血清用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清HBsAg。依據(jù)HBV表面抗原診斷試劑盒說明書，采用雙抗體夾心法檢測(cè)HBsAg，采用抗 HBsAg包被板條，用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗HBsAg為酶標(biāo)記物，以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和過氧化物為底物。反應(yīng)終止后用多功能酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)下吸收度。

2.4 肝組織HBsAgmRNA檢測(cè)

將d42取材的部分肝臟用Trizol法提取小鼠肝臟組織RNA，用NanoDrop 2000C核酸定量?jī)x進(jìn)行定量，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后使用SYBR Green試劑盒和LC-480II熒光定量PCR儀檢測(cè)小鼠肝組織中HBsAg基因的表達(dá)量。

2.5 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)

將d42取材的部分肝臟固定于10%福爾馬林溶液內(nèi)，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，切片（4μm厚）、蘇木精-伊紅（HE）染色。光學(xué)顯微鏡下檢查：（1）肝細(xì)胞有無變性（水腫和脂變）、壞死；（2）肝竇有無淤血，肝小葉及門管區(qū)有無炎癥；（3）門管區(qū)小膽管周圍有無纖維組織增生（纖維增生），有無炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。根據(jù)各種病變由輕到重的程度，依次半定量為0～4分，輕微或極少量“0.5”，輕度或少量“1”，中度或較多“2”，重度或多量“3”，極重度或大量“4”，正常“0”。

2.6 血液淋巴細(xì)胞檢測(cè)

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD4+／CD8+淋巴細(xì)胞比例。將d42采集的全血取100μL，對(duì)照組不加抗體，CD4單陽(yáng)組和CD8單陽(yáng)組分別加入CD4抗體2μL和CD8抗體5μL，異甘草酸鎂組加入CD4抗體2μL以及 CD8抗體5μL。混勻，室溫避光孵育15 min。各組加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，室溫避光孵育 10 min。1 200 r／min離心5 min，去上清液。加入PBS 2 mL洗1次。再加入PBS 0.4 mL重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。并進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理。CD4抗體為FITC標(biāo)記，CD8抗體為APC標(biāo)記，分別對(duì)應(yīng)流式中的FL1和FL4。

2.7 血清細(xì)胞因子檢測(cè)

將d27、d41采集的全血分離血清，用流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)（CBA）法檢測(cè)細(xì)胞因子。按照CBA小鼠Th1／Th2／Th17測(cè)定試劑盒說明書，將待測(cè)血清用Assay Diluent稀釋6倍后處理操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，樣本數(shù)據(jù)收集完畢（FCS2.0格式）后，用CBA專用分析軟件FCAP Array v1.0進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及數(shù)據(jù)分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié) 果

3.1 異甘草酸鎂對(duì)血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

根據(jù)體重和血清轉(zhuǎn)氨酶活性對(duì)小鼠進(jìn)行平均分組，連續(xù)給藥5周，每周取血一次檢測(cè)ALT和AST活性變化情況，隨日齡增加，ALT和AST活性呈先上升后下降趨勢(shì)。異甘草酸鎂組小鼠血清ALT和AST活性均顯著低于對(duì)照組（圖1-A，B），而體重增加顯著高于對(duì)照組（圖1-C）。

Figure 1 Alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）activity and body weight of hepatitis B virus（HBV）transgenic mouse with age（±s，n=10）MgIG：Magnesium isoglycyrrhizinate

3.2 異甘草酸鎂對(duì)血清HBsAg和肝臟組織HBsAg mRNA的影響

異甘草酸鎂組和對(duì)照組小鼠隨日齡增加，血清HBsAg含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，d20血清HBsAg含量高于d0（無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。血清樣本間差異比較大，部分血清樣本HBsAg含量低，異甘草酸鎂組血清HBsAg與對(duì)照組無顯著差異（圖2-A）。

d42小鼠肝臟組織中可穩(wěn)定檢測(cè)到HBsAg mRNA，內(nèi)參基因GAPDH以及HBsAg溶解曲線正常。異甘草酸鎂組小鼠肝臟組織HBsAgmRNA與對(duì)照組無顯著差異（圖2-B）。

Figure 2 Hepatitis B surface antigen（HBsAg）in serum and HBsAgmRNA in liver tissueA：HBsAg in serum（±s，n=10）；B：HBsAgmRNA in liver tissue（±s，n=8）

3.3 異甘草酸鎂對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)

異甘草酸鎂組和對(duì)照組小鼠肝臟的主要病理改變?yōu)楦渭?xì)胞變性，壞死，局灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，這些均為肝炎的形態(tài)學(xué)改變。異甘草酸鎂組小鼠肝臟的病變程度明顯輕于對(duì)照組。例如對(duì)照組1＃和5＃小鼠（圖3-A，3-B）肝細(xì)胞可見多處變性、壞死，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)見糖原空泡，肝小葉內(nèi)見局灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。而異甘草酸鎂組3＃和6＃小鼠（圖3-C，3-D）肝細(xì)胞少數(shù)變性、壞死，肝小葉或門管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少數(shù)肝細(xì)胞見核內(nèi)包涵體。總體來看，對(duì)照組小鼠肝臟細(xì)胞變性壞死居多，也有炎癥，異甘草酸鎂組小鼠肝臟細(xì)胞只存在炎癥，少見變性壞死。

3.4 異甘草酸鎂對(duì)外周血淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響

對(duì)d42小鼠全血中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行分群。與對(duì)照組小鼠相比，異甘草酸鎂組小鼠全血中的CD4+淋巴細(xì)胞比例無顯著差異（圖4-A），而CD8+淋巴細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05）（圖 4-B），CD4+／CD8+比例顯著升高（P＜0.05）（圖 4-C）。此外，使用流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)（CBA）考察了d27和d41天采集血清樣本中的白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素 6（IL-6）、白細(xì)胞介素 10（IL-10）、白細(xì)胞介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ）的濃度變化。結(jié)果顯示異甘草酸鎂能夠顯著降低外周血中IL-6（圖4-D）和TNFα（圖4-E）的表達(dá)水平（P＜0.05），而其他細(xì)胞因子由于多數(shù)樣本中的濃度低于檢測(cè)限，因此不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 3 HE staining of liver tissue from HBV transgenicmouseA-B：Control group（d42，n=8）；C-D：MgIG group（d42，n=8）.Scale bar=50μmol／L

Figure4 Effects ofmagnesium isoglycyrrhizinate on lymphocytes and cytokines in peripheral bloodA：Percentage of CD4+T cell in total peripheral blood lymphocytes（d42，n=8）；B：Percentage of CD8+T cell in total peripheral blood lymphocytes（d42，n=8），*P＜0.05 vs control group；C：Ratio of CD4+／CD8+（d42，n=8）；D：Expression of IL-6 in peripheral blood（±s，n=8）；E：Expression of TNF-αin peripheral blood（±s，n=8）*P＜0.05 vs control group

4 討 論

適用于研究抗炎保肝藥物藥理機(jī)制的動(dòng)物模型需要滿足兩個(gè)基本條件：一是具有持續(xù)高水平的HBV復(fù)制，二是具有持續(xù)性的HBV感染和病理變化特征［13］。本研究表明，C57BL／6J-Tg（Alb1HBV）44Bri小鼠體內(nèi)HBV基因持續(xù)高水平復(fù)制，且隨日齡增加，血清轉(zhuǎn)氨酶濃度發(fā)生明顯波動(dòng)，至215日齡，可見明顯的肝臟細(xì)胞變性、壞死，肝細(xì)胞胞漿中糖原沉積，肝小葉內(nèi)局灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。因此，該模型適用于異甘草酸鎂的藥效學(xué)研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示異甘草酸鎂可以降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶水平，說明小鼠肝臟細(xì)胞損傷得到減輕。從血清HBsAg和肝臟組織HBsAgmRNA檢測(cè)結(jié)果可以看出，異甘草酸鎂并不影響HBV相關(guān)抗原基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而通過對(duì)肝臟的組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，異甘草酸鎂減少了肝臟細(xì)胞的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和變性壞死，具有抗炎保肝的藥效。進(jìn)一步研究表明，異甘草酸鎂能夠升高血液中CD4+／CD8+淋巴細(xì)胞比例，并且降低了血液中炎性細(xì)胞因子的水平。而根據(jù)研究報(bào)道，細(xì)胞毒性T細(xì)胞是引起肝細(xì)胞損傷的主要因素，CD4+／CD8+淋巴細(xì)胞比例降低則是導(dǎo)致淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)肝臟的主要原因［14］。本研究結(jié)果表明了異甘草酸鎂可以通過調(diào)節(jié)體液免疫、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子分泌發(fā)揮抗炎保肝藥效。