孫 巖，高向東，陳 松

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京211198）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，也是最為常見的癡呆形式之一，其主要的發(fā)病特征為認(rèn)知記憶能力障礙，學(xué)習(xí)行為能力下降。目前主要的病理特點(diǎn)為β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）積聚在腦實(shí)質(zhì)和血管系統(tǒng)中并形成老年斑塊，以及異常磷酸化的tau蛋白沉積形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，進(jìn)一步導(dǎo)致了突觸功能變性、神經(jīng)元氧化損傷、線粒體功能障礙等［1-2］。隨著全球老齡化程度的加劇，AD的患病率逐年攀升，其發(fā)病特點(diǎn)呈現(xiàn)多因素且發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，患者的病情進(jìn)展變化較大。因此，對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防措施及治療方案等相關(guān)的研究越來越多受到人們的重視。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞主要參與神經(jīng)元自身代謝及神經(jīng)突觸傳遞的能量供給途徑，其在復(fù)雜的腦能量代謝中占有較為重要的位置。有研究報(bào)道，在大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶的過程中，腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)［3］。Suzuki等［4］發(fā)現(xiàn)在大鼠海馬區(qū)中，長(zhǎng)期記憶的形成對(duì)神經(jīng)元有較高的能量需求，而星形膠質(zhì)細(xì)胞糖原代謝在此過程中為神經(jīng)元提供了主要的能量源。同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能異常則可能在AD發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［5］。近年來AD也被稱3型糖尿病，患者體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗效應(yīng)進(jìn)而對(duì)腦能量代謝和認(rèn)知功能產(chǎn)生影響［6］。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子亞家族成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦能量代謝中可能發(fā)揮一定的潛在作用，但在AD中及其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用尚不明確。

本研究通過對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞建立AD樣損傷模型，重點(diǎn)考察FGF21對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活性及胞內(nèi)活性氧水平的影響，探討其對(duì)MAPKs信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，明確FGF21對(duì)AD中星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材 料

1.1 試 劑

FGF21（本實(shí)驗(yàn)室制備）；Aβ25-35（中國(guó)吉爾生化有限公司）；活性氧 ROS（reactive oxygen species）檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、一抗稀釋液（中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所）；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；胰蛋白酶、MTT、氨芐西林鈉、鏈霉素鈉、牛血清白蛋白（中國(guó) Biosharp公司）；磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、PVDF膜、ECL試劑盒（美國(guó)Millipore公司）；蛋白預(yù)染Marker（美國(guó) Thermo公司）；β-actin抗體（中國(guó) Abclonal公司）；p-MEK1／2抗體、MEK1／2抗體、p-ERK1／2抗體、ERK1／2抗體、p-p38抗體、p38抗體、Goat羊兔抗IgG、Goat羊鼠抗 IgG（美國(guó) Cell Signaling Technology公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（中國(guó)上海申安醫(yī)療器械廠）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton-Dickinson公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；多功能凝膠成像系統(tǒng)（中國(guó)Tanon公司）。

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞

Wistar大鼠，雌性，孕期18 d，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007；星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤C6細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

C6細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，待匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境維持在37℃、5%CO2飽和濕度條件。

2.2 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

預(yù)先在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入適量50μg／mL多聚賴氨酸溶液，過夜包被吸除后晾干，PBS洗滌3次。取新生24 h內(nèi)的Wistar乳鼠，置于75%酒精中全身消毒，超凈臺(tái)內(nèi)冰上取腦半球，充分剪碎組織，轉(zhuǎn)移到含有10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，1 000 r／min離心 5 min，棄上清液，加入0.125%胰酶4 mL于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min，中間吹打1次。待消化完全后，加入含有10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打后1 000 r／min離心5 min，棄上清液，重懸后過200目篩網(wǎng)得到單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液均勻鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后首次換液，以后每隔2天換液1次。待培養(yǎng)至第7天，220 r／min細(xì)胞搖床中4 h進(jìn)行細(xì)胞純化即為原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，傳代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 Aβ25-35寡聚體的制備

Aβ25-35粉末充分溶解在雙蒸水配制為終濃度為1 mg／mL的溶液。0.22μm無菌濾器濾過除菌，分裝后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)4 d，BCA法測(cè)定Aβ25-35寡聚體濃度，-20℃保存。

2.4 Aβ25-35致C6細(xì)胞損傷模型建立

C6細(xì)胞制成密度為每毫升5×104個(gè)的細(xì)胞懸液，充分混勻后以每孔100μL種植在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，6 h后以梯度濃度 1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 2，0.015 6，0.007 8μmol／L的Aβ25-35孵育 C6細(xì)胞24 h／48 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性：每孔加入MTT 10μL，37℃恒溫培養(yǎng)箱放置4 h后吸棄培養(yǎng)基，加入DMSO 150μL并置于搖床以500 r／min振搖10min充分溶解，570 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm參比波長(zhǎng)條件下酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔內(nèi)吸收度。

2.5 FGF21對(duì)Aβ25-35致C6細(xì)胞損傷的干預(yù)作用

培養(yǎng) C6細(xì)胞，選取 0.062 5μmol／L Aβ25-35損傷C6細(xì)胞24 h后，不同濃度FGF21干預(yù)損傷后的C6細(xì)胞 24 h／48 h，濃度分別為：8，4，2，1，0.5，0.25，0.125μmol／L，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性。

2.6 FGF21對(duì)Aβ25-35致原代星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的干預(yù)作用

將培養(yǎng)好的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞制成密度為每毫升5×104個(gè)的細(xì)胞懸液，種植在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積100μL。6 h后使用終濃度為 5μmol／L的 Aβ25-35與細(xì)胞共孵育 24 h，以8μmol／L FGF21進(jìn)行干預(yù)48 h，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性。

2.7 DCFH-DA探針法檢測(cè)Aβ25-35及FGF21對(duì)C6細(xì)胞內(nèi)ROS生成水平的影響

實(shí)驗(yàn)分組為：空白組、FGF21單獨(dú)給藥組、Aβ25-35損傷模型組、FGF21+Aβ25-35損傷后給藥組。收集狀態(tài)良好的C6細(xì)胞，以每毫升5×104個(gè)的密度接種在6孔板內(nèi)，每孔1mL，選擇0.062 5μmol／L Aβ25-35損傷C6細(xì)胞24 h后，以8μmol／L FGF21給藥干預(yù)48 h。采用DCFH-DA探針標(biāo)記法流式檢測(cè)C6細(xì)胞內(nèi)ROS水平。具體步驟：吸棄6孔板內(nèi)培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化2 min，DMEM高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞輕緩吹落并收集在EP管內(nèi)，1 500 r／min離心5 min棄除上清液，按1∶1 000的比例以無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋配制成終濃度為10μmol／L的DCFH-DA溶液，每管加入重懸細(xì)胞1 mL，37℃孵育20 min，離心收集細(xì)胞，無血清DMEM高糖培養(yǎng)基洗滌，重復(fù)3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2.8 Western blot檢測(cè)Aβ25-35及FGF21對(duì)C6細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路的影響

按照“2.7”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)方法，給藥干預(yù)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè) 各 實(shí) 驗(yàn) 組 p-MEK1／2、MEK1／2、p-ERK1／2、ERK1／2、β-actin、p-p38、p38蛋白水平變化。具體步驟：PBS洗滌細(xì)胞3次，加入RIPA細(xì)胞裂解液（按1∶200加入蛋白酶抑制劑，1∶100加入磷酸酶抑制劑）于冰上裂解，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于EP管中，渦旋儀充分振蕩裂解，12 000 r／min離心10 min取上清液即為細(xì)胞總蛋白。 進(jìn) 行 SDSPAGE電泳，半干法恒流轉(zhuǎn)膜6～8 min，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜以3%BSA封閉2 h，TBST洗滌5次，每次5 min，4℃過夜孵育一抗，重復(fù)洗滌后孵育二抗1.5 h，ECL顯色成像，檢測(cè)目標(biāo)蛋白變化。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad 7.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)指標(biāo)以±s表示，以O(shè)ne-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05時(shí)表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 Aβ25-35致C6細(xì)胞損傷模型建立

以不同濃度Aβ25-35損傷C6細(xì)胞24 h／48 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果如圖1所示，Aβ25-35對(duì)C6細(xì)胞活性損傷呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，作用48 h后C6細(xì)胞損傷程度較強(qiáng)于24 h。當(dāng)0.062 5μmol／L Aβ25-35作用C6細(xì)胞24 h時(shí)，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞損傷率約為40%，因此選取Aβ25-35的最終造模濃度為0.062 5μmol／L。

Figure 1 Effects of different concentrations of Aβ25-35 on C6 cell viability for 24 h（A）／48 h（B）were estimated by MTT assay（±s，n=6）***P＜0.001 vs control group

3.2 FGF21對(duì)Aβ25-35致C6細(xì)胞損傷的干預(yù)作用

根據(jù)“3.1”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以 0.062 5μmol／L Aβ25-35損傷 C6細(xì)胞 24 h后，分別與梯度濃度FGF21孵育C6細(xì)胞24 h／48 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果如圖2所示，單獨(dú)給予FGF21組與空白對(duì)照組相比較無明顯差異，Aβ25-35模型組與空白對(duì)照組相比細(xì)胞活性有極顯著差異，F(xiàn)GF21濃度為8μmol／L時(shí)，損傷后給藥組與模型組相比細(xì)胞活性有顯著差異。

Figure 2 Protective effect of FGF21 against Aβ25-35-induced toxicity on C6 cells.C6 cellswere treated with Aβ25-35（0.062 5μmol／L）and different concentrations of FGF21，and cell viabilities for 24 h（A）／48 h（B）were estimated by MTT assay（±s，n=6）＃＃＃P＜0.001 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Aβ25-35 group

3.3 FGF21對(duì)Aβ25-35致原代星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的干預(yù)作用

采用5μmol／L Aβ25-35損傷原代星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，8μmol／L FGF21干預(yù)48 h，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果如圖3所示，與模型組相比，給藥組原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力極顯著升高，說明FGF21對(duì)Aβ25-35導(dǎo)致?lián)p傷的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮了保護(hù)作用。

3.4 Aβ25-35及FGF21對(duì)C6細(xì)胞內(nèi)ROS生成水平的影響

Figure 3 Protective effect of FGF21 against Aβ25-35-induced toxicity on primary astrocytes.Primary astrocytes were treated with Aβ25-35（5μmol／L）and FGF21（8μmol／L），and cell viabilities were estimated by MTT assay（±s，n=6）＃＃＃P＜0.001 vs control group；***P＜0.001 vs Aβ25-35 group

采用0.062 5μmol／L Aβ25-35損傷C6細(xì)胞24 h后，8μmol／L FGF21進(jìn)行干預(yù)48 h，DCFH-DA探針法檢測(cè)C6細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果如圖4所示：與空白對(duì)照組相比，Aβ25-35損傷后C6細(xì)胞內(nèi)ROS極顯著增加，而FGF21給藥組與模型組相比ROS極顯著降低，說明FGF21可緩解Aβ25-35引起的C6細(xì)胞內(nèi)ROS水平異常，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮了一定的相關(guān)保護(hù)作用。

Figure 4 FGF21 prevents Aβ25-35-induced abnormal ROS production.C6 cells were exposed to DCFH-DA analyzing ROS generation（±s，n=6）A：Analysis of ROS levels in C6 cells by flow cytometry；B：Quantification of ROS levels＃＃＃P＜0.001 vs control group；***P＜0.001 vs Aβ25-35 group

3.5 Aβ25-35及 FGF21對(duì) C6細(xì)胞 ERK1／2通路的影響

采用Aβ25-35對(duì)C6細(xì)胞損傷并進(jìn)行FGF21干預(yù)，Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組 MEK1／2、ERK1／2磷酸化程度。結(jié)果如圖5所示：與空白對(duì)照組相比，Aβ25-35損傷后 C6細(xì)胞中 MEK1／2、ERK1／2磷酸化水平異常升高，而 FGF21能緩解模型組MEK1／2、ERK1／2磷酸化水平異常。說明 FGF21可能通過C6細(xì)胞內(nèi)MEK1／2／ERK1／2通路發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

Figure 5 Effects of FGF21／Aβ25-35 on the phosphorylation levels of MEK1／2 and ERK1／2.In C6 cells，the abnormal phosphorylation levels of MEK1／2 and ERK1／2 were induced by Aβ25-35，and were regulated by FGF21-treatment（±s，n=3）A：Detection of phosphorylation levels of MEK1／2 and ERK1／2 by Western blot；B／C：Quantitative anlaysis of phosphorylation levels of MEK1／2 and ERK1／2＃＃＃P＜0.001，＃＃P＜0.01 vs control group；***P＜0.001 vs Aβ25-35 group

3.6 Aβ25-35及 FGF21對(duì) C6細(xì)胞 p-p38和 p38的影響

Aβ25-35對(duì)C6細(xì)胞損傷造模，采用FGF21進(jìn)行干預(yù)，Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組p38磷酸化程度。結(jié)果如圖6所示：與空白對(duì)照組相比，Aβ25-35損傷后C6細(xì)胞中p38磷酸化水平升高，而FGF21能一定程度上緩解模型組p38磷酸化水平異常。說明FGF21能調(diào)控Aβ25-35損傷后C6細(xì)胞內(nèi)p38通路異常。MAPKs通路可能在 FGF21減少 Aβ25-35導(dǎo)致C6細(xì)胞損傷中具有重要作用。

4 討 論

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21是龐大的FGF基因家族的一員，并具有多個(gè)不同于經(jīng)典FGF家族的特點(diǎn)［7］。目前，以FGF21為代表的FGF亞家族成員已成為糖脂代謝研究的熱點(diǎn)［8］。研究表明FGF21可通過簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式透過血腦脊液屏障［9］，同時(shí)FGF21及其相應(yīng)的受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有一定的表達(dá)［10］。有研究報(bào)道FGF21能改善肥胖大鼠認(rèn)知障礙，改構(gòu)后的FGF21可緩解神經(jīng)元的氧化損傷［11-12］。然而，F(xiàn)GF21在AD中具體作用機(jī)制及其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響仍有待進(jìn)一步研究。腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積的發(fā)生先于神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成、神經(jīng)元細(xì)胞的死亡及繼發(fā)的功能衰退［13］。目前，對(duì)AD的研究普遍認(rèn)為Aβ的產(chǎn)生和積累仍是可能導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制之一［14-15］。Aβ聚集后引發(fā)淀粉樣蛋白假說中相關(guān)的分子和細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致突觸功能的改變，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常。本研究采用Aβ25-35模擬細(xì)胞AD相關(guān)的損傷，探索FGF21對(duì)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明FGF21能夠顯著降低Aβ25-35所導(dǎo)致的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及C6細(xì)胞株損傷，提高星形膠質(zhì)細(xì)胞活力。說明FGF21對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮了一定的保護(hù)作用。

Figure 6 Effects of FGF21／Aβ25-35 on the phosphorylation level of p38.The abnormal phosphorylation level of p38 was induced by Aβ25-35，and was regulated by FGF21-treatment in C6 cells（±s，n=3）A：Detection of phosphorylation levels of p38 by Western blot；B：Quantitative analysis of phosphorylation levels of p38＃P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs Aβ25-35 group

氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病早期中扮演著重要的角色，老年癡呆患者產(chǎn)生過量的自由基引發(fā)細(xì)胞進(jìn)入氧化應(yīng)激的病變狀態(tài)，降低細(xì)胞活力。受損的星形膠質(zhì)細(xì)胞首先產(chǎn)生多種促炎因子和神經(jīng)毒性分子，一方面對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生一定毒性，另一方面進(jìn)而影響記憶形成進(jìn)程，因此降低膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平對(duì)于防治AD具有重要意義［16-18］。研究表明Aβ可誘導(dǎo)腦內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，異常激活MAPKs信號(hào)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的存活率［19］。也有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生AD病變后MAPK-ERK通路異常變化，導(dǎo)致海馬功能受損誘發(fā)記憶障礙［20-21］。本研究表明FGF21可改善Aβ25-35導(dǎo)致的C6細(xì)胞內(nèi)ROS水平異常，對(duì)AD相關(guān)的C6細(xì)胞損傷能發(fā)揮一定的保護(hù)作用，同時(shí)FGF21可能是通過緩解Aβ25-35引起的 MEK1／2、ERK1／2、p38異常進(jìn)而減少C6細(xì)胞損傷。說明在AD相關(guān)的細(xì)胞損傷病變中，F(xiàn)GF21可能通過調(diào)節(jié)ROS途徑及MAPKs信號(hào)通路，調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮重要保護(hù)作用。