王紫安，劉 洋，王 鵬，蔣逸飛，吉 民*

（1東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，南京210096；2中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院，南京211198）

腫瘤是人類醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的巨大挑戰(zhàn)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米醫(yī)藥技術(shù)被認(rèn)為在實(shí)現(xiàn)腫瘤的高效和個(gè)性化治療上具有極大的優(yōu)勢(shì)［1-3］。但迄今為止，納米藥物的臨床轉(zhuǎn)化仍然面臨許多挑戰(zhàn)，包括納米顆粒的生物相容性，臨床結(jié)果與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的巨大差異和腫瘤的多藥耐藥性等。即使已經(jīng)進(jìn)入臨床階段的納米藥物也被發(fā)現(xiàn)更多的是降低藥物不良反應(yīng)而非增強(qiáng)治療效果［4］。由于人體生理環(huán)境復(fù)雜，納米藥物的靶向遞送低于預(yù)期設(shè)計(jì)［5］。研究人員指出通過被動(dòng)靶向遞送藥物時(shí)，納米顆粒從血管滲漏的速度很慢，藥物在積累達(dá)到治療水平所需濃度前排泄或代謝［6］。因此，有必要對(duì)納米藥物的體內(nèi)行為進(jìn)行監(jiān)控，以便掌握藥物分布和療效的實(shí)時(shí)信息，從而以受控和合理的方式調(diào)整治療策略，改善治療效果。

近年來，基于不同成像方式與治療方法的組合迅速發(fā)展［7］。將成像劑與治療藥物共載于同一納米平臺(tái)，能夠?qū){米藥物的體內(nèi)遞送、生物分布、代謝過程進(jìn)行原位實(shí)時(shí)監(jiān)控。相較于PET、CT以及MRI等成像方式，熒光成像具有高靈敏度、高時(shí)間分辨率和無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，更重要的是由于熒光成像的操作簡(jiǎn)便及成像設(shè)備的便攜可移動(dòng)，相較于其他成像方式，熒光成像具備輔助臨床手術(shù)中的優(yōu)勢(shì)［8］。近幾年近紅外二區(qū)（NIR-II：1 000～1 700 nm）成像技術(shù)迅速發(fā)展。通過減少光子散射、光吸收和自發(fā)熒光，NIR-II探針提供更高穿透率和分辨率的成像［9］。當(dāng)前，NIR-II熒光成像技術(shù)已應(yīng)用于腦成像、血管成像、腫瘤成像等多個(gè)領(lǐng)域，并顯示出比近紅外一區(qū)更佳的成像效果。

目前，已有多種NIR-II探針見于報(bào)道，包括鑭系元素（Ln）摻雜納米結(jié)構(gòu)（LDNCs）、單壁碳納米管（SWCNT）、紅外量子點(diǎn)（QD）、共聚物及有機(jī)小分子染料等。其中大多數(shù)NIR-II探針屬于無機(jī)納米材料，體內(nèi)代謝緩慢，可能導(dǎo)致長(zhǎng)期毒性［8］。相比之下，基于小分子熒光團(tuán)的造影劑具有良好的排泄藥代動(dòng)力學(xué)和最小的細(xì)胞毒性，這將有助于加速FDA批準(zhǔn)和NIR-II成像的臨床轉(zhuǎn)化［8］。目前臨床上批準(zhǔn)的NIR熒光團(tuán)，吲哚菁綠（ICG）和亞甲藍(lán)（MB）都是小分子染料［10］。

IR-1061是一種水不溶性多甲川NIR-II探針，由于其高度疏水，IR1061無法直接應(yīng)用于人體［11］。阿霉素（DOX）作為一種廣譜抗腫瘤藥物廣泛用于各種惡性腫瘤的化療。同時(shí)DOX具有可以通過激光共聚焦顯微鏡分析的熒光，適合作為藥物模型分析其細(xì)胞攝取。脂質(zhì)體由磷脂雙層和水核組成，具有兩親性，在表面改性，生物相容性和生物降解等多個(gè)方面具有優(yōu)勢(shì)［12］。因此，可以利用脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)IR1061與阿霉素的共載。此外，研究表明與常見于應(yīng)用的帶負(fù)電荷脂質(zhì)體不同，十八胺陽(yáng)離子脂質(zhì)體能夠與腫瘤細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）以強(qiáng)親和力和直接相互作用，表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞攝取，從而增強(qiáng)藥物抗腫瘤作用［13］。

因此，本研究以IR1061作為成像劑，阿霉素作為治療劑，制備DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體，實(shí)現(xiàn)NIR-II成像與乳腺癌治療的雙重目標(biāo)。其中，疏水性的IR1061裝載于脂質(zhì)體磷脂膜，在980 nm激發(fā)下可用于NIR-II成像；水溶性的DOX裝載于脂質(zhì)體水核，用于乳腺癌治療。本研究還利用脂溶性熒光染料香豆素-6標(biāo)記脂質(zhì)體，結(jié)合DOX本身的熒光性能，分析陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取行為，并通過MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其增強(qiáng)體外抑制腫瘤細(xì)胞活性。期望該脂質(zhì)體的構(gòu)建有利于推動(dòng)近紅外二區(qū)成像技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用與發(fā)展。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

大豆磷脂（Lipoid S 100，德國(guó)Lipoid公司）；膽固醇（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；十八胺（90%，麥克林化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸阿霉素（99.92%，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司）；香豆素-6、DAPI、4%多聚甲醛固定液（源葉生物科技有限公司）；其他試劑均國(guó)產(chǎn)分析純。MDA-MB-231（人乳腺腫瘤細(xì)胞）由江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀 器

SHZ-B（III）循環(huán)多用真空泵（南京科博爾儀器設(shè)備有限公司）；醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；UV-3600紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；ZS90納米粒徑電位分析儀（英國(guó)Malvern公司）；THZ-320臺(tái)式恒溫振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；低溫時(shí)間分辨熒光光譜儀（英國(guó)愛丁堡儀器公司）；NIR-II活體成像系統(tǒng)（武漢光映美科技有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

2 方 法

2.1 脂質(zhì)體的制備及物理表征

根據(jù)文獻(xiàn)合成 IR1061后［14］，用薄膜水化-超聲法制備NIR-II成像陽(yáng)離子脂質(zhì)體。精確稱取卵磷脂、吐溫-80、十八胺、膽固醇和IR1061（質(zhì)量比120∶24∶12∶12∶1），用二氯甲烷／乙醇（體積比 8∶1）溶于圓底燒瓶?jī)?nèi)，37℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜后，加入0.9%NaCl溶液10mL，37℃下振蕩水化3 h，水浴超聲 3 min，過 450和 220 nm濾膜各兩次，得IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體。制備載阿霉素NIR-II成像陽(yáng)離子脂質(zhì)體，精確稱取卵磷脂、吐溫-80、十八胺、膽固醇和 IR1061（質(zhì)量比120∶24∶12∶12∶1）按原方案成膜后，根據(jù)硫酸銨梯度載藥法加入3%硫酸銨溶液水化，將所得脂質(zhì)體于0.9%NaCl溶液中透析48 h后，按配方加入阿霉素（PC-DOX，8∶1），在50℃下攪拌30 min。將制得阿霉素脂質(zhì)體置于0.9%NaCl中透析48 h，去除游離阿霉素。制備非十八胺改性的DOX-IR1061脂質(zhì)體（DOX-IR1061-Liposome）作為對(duì)照組，其配方為卵磷脂、吐溫-80、膽固醇和 IR1061（質(zhì)量比120∶24∶12∶1），制備方法同DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體。選擇香豆素-6，一種激光轉(zhuǎn)化效率高，性能較穩(wěn)定的脂溶性染料作為熒光探針用于監(jiān)測(cè)陽(yáng)離子脂質(zhì)體及普通脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取行為。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取行為的觀測(cè)，用等物質(zhì)的量香豆素-6代替IR1061制備DOX-Coumarin-6陽(yáng)離子脂質(zhì)體及DOX-Coumarin-6脂質(zhì)體。同時(shí)，DOX的熒光性質(zhì)使其可作為熒光藥物模型用于藥物攝取分析。

通過馬爾文粒度儀測(cè)量脂質(zhì)體流體動(dòng)力學(xué)尺寸，PDI及Zeta電位。通過透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察載藥脂質(zhì)體形態(tài)。

2.2 脂質(zhì)體包封率測(cè)定

精確稱量DOX，用甲醇溶于5 mL量瓶中，定容，制備10，20，30μg／mL DOX溶液。同樣精確稱取DOX適量，與空白脂質(zhì)體混合后，用甲醇破乳，配制10，20，30μg／mL阿霉素-脂質(zhì)溶液。用紫外分光光度儀對(duì)配得溶液在200～600 nm光區(qū)進(jìn)行掃描，得在495 nm處阿霉素有吸收峰，并且不受磷脂影響。選擇495 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)量10，20，30，40，50μg／mL阿霉素甲醇溶液紫外吸收，計(jì)算其線性回歸方程后，根據(jù)公式計(jì)算DOX包封率。

2.3 脂質(zhì)體穩(wěn)定性

將DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體儲(chǔ)存在4℃環(huán)境下，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性通過測(cè)定其兩周后粒徑和PDI變化評(píng)估。同時(shí)，卵磷脂的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化水解，其氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量超過0.1μg／mg PC時(shí)，可造成溶血，因此有必要將脂質(zhì)體氧化程度作為其穩(wěn)定性的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)之一。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)硫代巴比妥酸法［15］測(cè)定脂質(zhì)體中磷脂氧化程度。

2.4 DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體近紅外二區(qū)成像性能

按一定比例稀釋DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體后用低溫時(shí)間分辨熒光光譜儀測(cè)定其近紅外二區(qū)光譜。將DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體按一定濃度配比（1.6，3.2，4.8，6.4，8 mg PC／mL）置于離心管后，用NIR II生物成像系統(tǒng)（980 nm激發(fā)）收集熒光信號(hào)，并通過（1 000～1 200 nm）帶通濾波器過濾測(cè)定脂質(zhì)體體外成像性能。用毛細(xì)吸管吸取適量脂質(zhì)體溶液后置于一定厚度組織下，用NIR-II生物成像系統(tǒng)觀察。

2.5 激光共聚焦分析細(xì)胞攝取行為

將MDA-MB-231在含蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至適宜密度后用DOXCoumarin-6陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DOX-Coumarin-6脂質(zhì)體，分別處理細(xì)胞1和2 h，并用PBS洗滌3次。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，再次使用PBS洗滌3次。加入5μg／mL DAPI染液染色，避光放置5 min后去除染色劑，加入抗熒光淬滅劑封片。使用激光共聚焦顯微鏡觀察玻片樣品（405 nm：DAPI，488 nm：香豆素-6，555 nm：DOX）。

2.6 體外細(xì)胞毒性研究

用MTT試驗(yàn)評(píng)估DOX-IR1061脂質(zhì)體和DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體的腫瘤細(xì)胞抑制效果。將處于生長(zhǎng)期的MDA-MB-231配成單細(xì)胞懸液后以一定密度接種至96孔板（100μL），在DMEM培養(yǎng)基中于37℃，5%CO2下培養(yǎng)24 h。隨后將細(xì)胞分別與DOX，DOX-IR1061脂質(zhì)體，DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體（0.25，0.5，1，2，4，8，16，32μg DOX／mL，100μL），細(xì)胞復(fù)孔數(shù)5，溫育24 h后向各孔中加入 MTT溶液（5 mg／mL，20μL）并孵育4 h。離心后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液并加入DMSO 100μL。通過使用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm處的吸收度來計(jì)算細(xì)胞活力。

3 結(jié) 果

3.1 DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體表征

通過薄膜水化-超聲法制備脂質(zhì)體，測(cè)得DOXIR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體流體動(dòng)力學(xué)尺寸為（149.9±5.3）nm，多分散系數(shù)為0.175，Zeta電位為+（25.6±0.32）mV，DOX包封率（95.8±2.4）%。在 TEM下觀察如圖1-a所示，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)清晰完整，并由于硫酸銨與阿霉素形成結(jié)晶，觀察到脂質(zhì)體內(nèi)部明顯的內(nèi)核結(jié)構(gòu)。以上數(shù)據(jù)顯示DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有相對(duì)均勻的分布，并成功載入阿霉素。

通過薄膜水化-超聲法制備脂質(zhì)體，測(cè)得DOXIR1061脂質(zhì)體流體動(dòng)力學(xué)尺寸為（138.3±6.1）nm，多分散系數(shù)為0.151，Zeta電位為-（0.538±0.12）mV，略帶負(fù)電荷。通過掃描電子顯微鏡觀察在4℃環(huán)境下放置48 h的DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體和 DOX-IR1061脂質(zhì)體，可以觀察到 DOXIR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)清晰，粒徑分布相對(duì)均勻（圖1-b）；而DOX-IR1061脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)大量聚集的情況（圖1-c）。因此，DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體比DOX-IR1061脂質(zhì)體更加穩(wěn)定。

此外，還對(duì)DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體的穩(wěn)定性做了進(jìn)一步分析，置于4℃環(huán)境下保存2周后，可以觀察到溶液仍保持澄清。利用馬爾文粒度儀測(cè)量脂質(zhì)體粒徑，其流體動(dòng)力學(xué)尺寸為（160.3±3.2）nm，粒徑變化小，PDI為0.215（小于0.3）。

進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行磷脂氧化分析。根據(jù)文獻(xiàn)，丙二醛（MDA）含量超過1μg／mg PC的氧化磷脂可造成溶血。其溶液中質(zhì)量濃度可由535 nm處吸收度與系數(shù)4.15的乘積計(jì)算得到，MDA／PC=0.031 μg／mg PC，遠(yuǎn)小于1μg／mg PC。

因此實(shí)驗(yàn)制得DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體能夠在4℃下穩(wěn)定保存。除了表面電位電荷（+25.6±0.32 mV）的存在降低了脂質(zhì)體聚集的發(fā)生外，這可能與吐溫-80吸附于脂質(zhì)雙層表面，形成“立體屏障”，增加了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有關(guān)［16］。

測(cè)試脂質(zhì)體NIR-II光譜（980 nm激發(fā)），如圖1-d所示，盡管其發(fā)射峰出現(xiàn)略微藍(lán)移，但仍然處于NIR-II范圍內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)近紅外二區(qū)成像。

3.2 NIR-II體外成像

NIR II生物成像系統(tǒng)（980 nm激發(fā)）收集NIRII熒光信號(hào)，可觀察到DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體在體外清晰明顯的熒光，按質(zhì)量濃度梯度稀釋后，可觀察到脂質(zhì)體熒光強(qiáng)度隨著質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)（圖1-e）。使用毛細(xì)吸管吸取脂質(zhì)體溶液置于0.8 cm厚度組織下可觀察到清晰明顯的熒光，如圖1-f所示。

Figure 1 （A）TEM picture of DOX-IR1061-Cationic liposome；（B）SEM picture of DOX-IR1061-Cationic liposome，48 h；（C）SEM picture of DOXIR1061-Liposome，48 h；（D）Emission spectrum of DOX-IR1061-Cationic liposome（excitation：980 nm）；（E）1.6，3.2，4.8，6.4，8 mg PC／mL from left to right，NIR-II imaging（excitation：980 m，filter：1 000-1 200 nm）；（F）Tissue thickness：0.8 cm NIR-II imaging in vitro（excitation：980 nm，filter：1 000 1 200 nm）

3.3 陽(yáng)離子脂質(zhì)體促進(jìn)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取

通過激光共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞的脂質(zhì)體攝取行為，以 DOX-Coumarin-6脂質(zhì)體作為對(duì)照組（control）。如圖2所示，細(xì)胞核用DAPI染成藍(lán)色，綠色熒光來自香豆素-6，紅色熒光來自阿霉素。在孵育1 h后，在DOX-Coumarin-6陽(yáng)離子脂質(zhì)體處理的細(xì)胞中可以觀察到明顯的綠色熒光和紅色熒光，而在對(duì)照組中幾乎無法觀察到來自脂質(zhì)體的熒光。而在孵育2 h后，DOX-Coumarin-6陽(yáng)離子脂質(zhì)體處理的細(xì)胞的熒光也明顯強(qiáng)于對(duì)照組。因此細(xì)胞對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的攝取效率顯著高于普通脂質(zhì)體，相應(yīng)地增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX的攝取，這有助于提高載藥脂質(zhì)體的細(xì)胞殺傷效率。

Figure2 Laser confocal image of（a）DOX-Coumarin-6 liposome treated cells for1 h；（b）DOX-Coumarin-6-Cationic liposome treated cells for1 h；（c）DOX-Coumarin-6 liposome treated cells for 2 h；（d）DOX-Coumarin-6-Cationic liposome treated cells for 2 h

3.4 體外細(xì)胞毒性研究

通過MTT測(cè)定評(píng)估 DOX，DOX-IR1061脂質(zhì)體，DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如圖3所示，非十八胺改性的DOX-IR1061脂質(zhì)體的腫瘤細(xì)胞抑制率顯著低于鹽酸阿霉素。這可能是因?yàn)辂}酸阿霉素本身為水溶性藥物，能夠迅速進(jìn)入細(xì)胞，而阿霉素被普通脂質(zhì)體包裹后，細(xì)胞攝取降低。DOX-IR1061陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有比游離DOX及普通載藥脂質(zhì)體更高的細(xì)胞毒性，并呈劑量依賴性。即十八胺與DOX協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤作用，并隨著脂質(zhì)體質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)。

Figure 3 Viability of MDA-MB-231 cells treated with different drugs（±s，n=3）**P＜0.01，***P＜0.001 vs DOX group

4 總結(jié)與展望

近紅外二區(qū)熒光成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)使其具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，通過納米技術(shù)將這一成像優(yōu)勢(shì)與化療功能結(jié)合有利于推動(dòng)腫瘤的診療發(fā)展。本研究成功構(gòu)建了用于近紅外二區(qū)熒光成像的IR1061脂質(zhì)體，對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行表征并通過體外成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其近紅外二區(qū)成像能力，并通過在脂質(zhì)體水核載入DOX作為治療劑，具備實(shí)現(xiàn)診斷與治療聯(lián)合的潛力。另一方面，通過激光共聚焦實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體引起細(xì)胞對(duì)DOX攝取增強(qiáng)，并進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，十八胺與DOX聯(lián)合起到增強(qiáng)脂質(zhì)體抗腫瘤能力的作用。此外，實(shí)驗(yàn)和理論研究表明，由于陽(yáng)離子納米顆粒對(duì)腫瘤血管壁的靜電吸引，與帶負(fù)電荷或中性納米顆粒相比，具有更強(qiáng)的經(jīng)腫瘤血管壁向腫瘤區(qū)域滲透的能力［3］。相信這一陽(yáng)離子脂質(zhì)體的構(gòu)建有利于近紅外二區(qū)成像應(yīng)用的探討及診療一體化的推進(jìn)。在進(jìn)一步研究中，考慮通過電子相互作用涂覆帶負(fù)電的透明質(zhì)酸殼，避免脂質(zhì)體與正常血管的相互作用。當(dāng)脂質(zhì)體富集于腫瘤，存在于腫瘤微環(huán)境的透明質(zhì)酸酶（HAase）會(huì)降解HA殼并暴露陽(yáng)離子脂質(zhì)體的高正電荷，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝?。?7］，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合近紅外二區(qū)成像與組織分析探討診療一體化的實(shí)現(xiàn)。