柯 珂，蔣雯麗，王 雨，朱景宇，金 堅

（江南大學(xué)藥學(xué)院藥物設(shè)計與分子藥理學(xué)實驗室，無錫214122）

惡性血液腫瘤（hematological malignancies，HMs）是由血液細胞惡性增殖引起的一大類血液疾病，主要包括白血?。╨eukemia）、淋巴瘤（lymphomas）以及多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）。HMs約占所有腫瘤疾病的9%，為第4大惡性腫瘤［1］。HMs的臨床治療目前仍以聯(lián)合化療為主，如免疫調(diào)節(jié)劑lenalidomid以及蛋白酶體抑制劑bortezomib等。這些治療方案雖然取得了一定的效果，但是由于這類藥物特異性缺失，現(xiàn)已出現(xiàn)明顯的多藥耐藥問題以及嚴重的不良反應(yīng)，因此新的治療藥物亟待開發(fā)［2］。研究表明，HMs擴散迅速且經(jīng)常規(guī)避治療，使得該類疾病難以治愈，復(fù)發(fā)率較高，因此防止血液腫瘤細胞的快速增殖成為該疾病治療的一個重要手段。目前，HMs特異性靶點的確定及靶向治療成為新的研究方向。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號通路因其對細胞的增殖、代謝、存活、抗凋亡的關(guān)鍵調(diào)控而備受關(guān)注［3］。大量研究表明，PI3K的過度激活與多種腫瘤（如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、惡性血液腫瘤等）的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，因此PI3K逐漸發(fā)展成為抗腫瘤領(lǐng)域的一個重要靶點［4-9］。PI3K具有絲氨酸／蘇氨酸（Ser／Thr）激酶特性，同時還具有磷脂酰肌醇激酶的活性。根據(jù)結(jié)構(gòu)和底物特異性，PI3K主要分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類，其中Ⅰ類PI3K因其在腫瘤中的重要作用而受到最廣泛的研究［10-11］。Ⅰ類PI3K又分為ⅠA和ⅠB兩個亞類，其中ⅠA類主要由受體酪氨酸激活，基于催化亞基的不同又分為PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ3個亞型；ⅠB類即為PI3Kγ亞型，由G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）激活［12］。激活的 PI3K將 PI（4，5）P2轉(zhuǎn)化為 PI（3，4，5）P3，從而募集 PDK1、Akt等分子并使之磷酸化，將活化信號向下傳遞，從而影響細胞的生長、分裂、增殖和存活［13］。

在多種惡性血液腫瘤中，如T-細胞急性淋巴細胞白血?。═-ALL）、急性髓系白血?。ˋML）、多發(fā)性骨髓瘤（MM）中，PI3K信號通路往往呈現(xiàn)過度表達的紊亂狀態(tài)，因此開發(fā)PI3K抑制劑治療惡性血液腫瘤具有廣闊的應(yīng)用前景［14-16］。第一個成功上市的 PI3K抑制劑為 idelalisib（CAL-101），于2014年被FDA批準(zhǔn)用于治療慢性淋巴細胞白血?。–LL）和小淋巴細胞淋巴瘤（SLL）［17］。隨后，duvelisib（IPI-145）也于2018年成功上市，主要用于治療復(fù)發(fā)性或難治性濾泡性淋巴瘤［18］。因此本研究擬通過對本課題組前期工作得到的82個潛在PI3K抑制劑進行抗惡性血液腫瘤活性研究，并采用計算機模擬的方法在分子水平研究活性化合物JN-65與PI3K的結(jié)合機制。

1 材 料

1.1 試 劑

82個化合物購自美國ChemBridge公司；陽性藥PI-103（美國Selleck Chemicals公司）；MTT粉末（美國 Sigma公司）；Annexin V-凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；SDS-PAGE上樣緩沖液、蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)公司）；ADP-Glo發(fā)光檢測試劑盒（美國 Promega公司，試劑盒含有PI3Kα、β、δ、γ及 PIP2底物蛋白）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國Biosharp公司）；ECL發(fā)光液（上海Tanon公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；抗體Phospho-Akt Ser473、抗體 Total-Akt（上海 Abacm公司）；抗體GAPDH（美國 Proteintech公司）。7-（1-甲基-1H-吡咯并［2，3-b］吡啶-4-基）-1（2H）-異喹啉酮（JN-65，美國ChemBridge公司）。

1.2 細胞株

白血病細胞（HL-60、U937、K562、Jurkat），多發(fā)性骨髓瘤細胞（OCI-My5、KMS11、U266）均購自ATCC細胞庫。

1.3 儀器及計算軟件

T7500高性能計算工作站（美國戴爾公司）；Dsicovery Studio 3.5（美國Biovia公司）；PyMOL（美國DeLano Scientific LLC公司），Prism分析軟件（美國GraphPad Software公司）；凝膠成像儀（上海Tanon公司）；Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀（中國Tecan公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

2 方 法

2.1 細胞篩選模型建立

將白血病細胞（HL-60、U937、K562、Jurkat）和多發(fā)性骨髓瘤細胞（OCI-My5、KMS11、U266）復(fù)蘇后，分別加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和含有10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，將細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞的生長密度達到70%～80%時，收集后于1 000 r／min離心5 min后重懸傳代培養(yǎng)。

2.2 MTT方法測定化合物抑制細胞增殖

取細胞狀態(tài)良好的惡性血液腫瘤細胞U937以密度為每毫升8×104個細胞接種于96孔板，每孔共95μL。將82個化合物溶液用培養(yǎng)基釋至10μmol／L分別以每孔5μL加入含細胞的96孔板中，后放入培養(yǎng)箱中孵育72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5 mg／mLMTT溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h。隨后每孔加入DMSO 100μL，培養(yǎng)箱中孵育過夜。最后在波長為490 nm處，用酶標(biāo)儀檢測吸收度。

2.3 JN-65抑制多種惡性血液腫瘤細胞的增殖

取細胞狀態(tài)良好的多種惡性血液腫瘤細胞，其中包括白血病細胞（HL-60／U937／K562／Jurkat）和多發(fā)性骨髓瘤細胞（OCI-My5／KMS11／U266）。計數(shù)稀釋后，每種細胞以密度為每毫升8×104個細胞接種于96孔板，每孔共95μL。采用倍稀法稀釋JN-65濃度（0～25μmol／L），分別將藥物 5μL加入到細胞孔板中，放入培養(yǎng)箱中，分別孵育24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5 mg／mL MTT溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h。隨后每孔加入DMSO 100μL，培養(yǎng)箱中孵育過夜。最后在波長為490 nm處，用酶標(biāo)儀檢測吸收度。

2.4 體外酶活性實驗檢測JN-65的PI3K抑制活性

使用ADP-Glo試劑盒檢測JN-65的PI3K抑制活性：首先設(shè)置JN-65終濃度為20μmol／L，采用倍稀法稀釋JN-65濃度，設(shè)置10個濃度梯度（0～20μmol／L）。按照ADP-Glo試劑盒說明書分別配制PI3Kα、β、δ、γ酶反應(yīng)溶液，每孔2μL，隨后每孔加入JN-65 0.5μL，最后加入PI3K底物蛋白PIP2 2μL，空白組加入相應(yīng)量的DMSO，所有溶液配制于384孔白板中并設(shè)置3個復(fù)孔；第二步加入ATP溶液0.5μL啟動反應(yīng)，室溫孵育45 min；隨后加入ADP-Glo檢測溶液5μL，室溫孵育40 min后加入激酶檢測緩沖液10μL，23℃孵育50 min；最后，利用酶標(biāo)儀檢測熒光信號強度，使用Prism擬合IC50。

2.5 免疫印跡法檢測JN-65抑制PI3K／Akt信號通路

將白血病細胞Jurkat培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞密度為80%，收集離心處理后，計數(shù)稀釋至密度為每毫升2×106個細胞接種于6孔板，每孔共2 mL。JN-65濃度為：0，2.5，5，10，20μmol／L。共同孵育24 h后，離心收集并用4℃PBS重懸吹洗細胞兩次。棄上清液加入細胞裂解液100μL，放置于冰上超聲破碎，隨后4℃靜置反應(yīng)20min。最后使用4℃離心機，12 000 r／min，離心 20 min。

離心后取上清液，用BCA蛋白濃度測試試劑盒測定蛋白濃度，取總蛋白30μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。上層濃縮選取80 V電泳0.5 h，下層分離膠選取100 V電泳1 h，轉(zhuǎn)膜選取100 V電壓運行1 h，5%脫脂奶粉封閉90 min，一抗孵育（Phospho-AKTSer473，GAPDH），4℃過夜，TBST洗膜4次，每次10 min，二抗孵育60 min，TBST洗膜4次，每次10 min。最后利用ECL發(fā)光顯影液，將NC膜放置于凝膠成像儀中發(fā)光成像。

2.6 細胞流式法檢測JN-65對白血病細胞的促凋亡作用

將白血病細胞Jurkat培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞密度為80%，收集離心處理后，計數(shù)稀釋至密度為每毫升1×105個細胞接種于12孔板，每孔共1 mL。JN-65以濃度梯度：0，2.5，5，10，20μmol／L分別作用24 h。先加入Annexin V Binding Buffer 100μL重懸細胞，再依次加入Annexin V-FITC溶液5μL和PI溶液5μL，避光反應(yīng)10min。打開流式細胞儀，準(zhǔn)備上樣時，每個樣品加入結(jié)合緩沖液200μL終止反應(yīng)并重懸細胞，開始檢測。

2.7 計算機模擬JN-65與Ⅰ類PI3K相互作用

從PDB數(shù)據(jù)庫中選擇分辨率最高的含有抑制劑配體的 PI3K晶體結(jié)構(gòu)：PI3Kα（5XSC）［19］、PI3Kβ（2Y3A）［20］、PI3Kδ（4XEO）［21］、PI3Kγ（4KZC）［22］。使用 DS 3.5繪制 JN-65，并通過 Ligand Preparation模塊基于CHARMm力場對其進行優(yōu)化。使用DS 3.5軟件中的Protein Preparation模塊對4個蛋白進行預(yù)處理，包括：刪除所有存在的結(jié)晶水分子、修正鍵級、添加氫原子、基于CHARMm力場分配局部電荷、分配質(zhì)子化狀態(tài)、優(yōu)化體系的結(jié)構(gòu)并在RMSD達到0.3?時停止優(yōu)化。通過Define and Find Binding Site模塊，以蛋白晶體結(jié)構(gòu)原有小分子抑制劑配體作為參照中心，生成活性口袋格點用于對接。采用CDOCKER模塊將JN-65分別對接到4個亞型中，保留對接結(jié)果最好的復(fù)合物進行分析，其余參數(shù)均為默認值。

3 結(jié) 果

3.1 JN-65對血液腫瘤細胞的毒性作用

為了尋找能夠特異性抑制惡性血液腫瘤的PI3K抑制劑，本研究首先使用U937白血病細胞對前期得到的82個化合物進行細胞水平初篩。初篩藥物濃度為10μmol／L，作用時間為72 h，最后使用MTT法分析細胞的存活率，進而檢測化合物對細胞的抗增殖作用，結(jié)果見圖1。從圖中可見，部分化合物對U937具有一定的抑制活性（對U937細胞抑制率在70%以下）。以抑制率70%為閾值，可以發(fā)現(xiàn)JN-65（結(jié)構(gòu)見圖1）對U937表現(xiàn)出較強的毒性作用，表明JN-65具有較強的抗白血病細胞的增殖作用。

3.2 JN-65有效抑制惡性腫瘤細胞的增殖

為了進一步證實JN-65對血液腫瘤細胞的抑制作用，將JN-65作用于多種血液腫瘤細胞系。采用倍稀法將 JN-65按照一定濃度梯度（0～25μmol／L）作用于多種細胞，包括白血病細胞（HL-60／U937／K562／Jurkat）和多發(fā)性骨髓瘤細胞（OCI-My5／KMS11／U266），同時孵育不同時間（24，48，72 h），結(jié)果如圖 2。圖 2A、2B、2C表明，隨著JN-65作用濃度和作用時間的增加，細胞的增殖均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，對部分細胞表現(xiàn)出了較強的抑制作用，包括HL-60、U937、Jurkat白血病細胞，表明了JN-65可能對白血病細胞具有更強的抑制作用。隨著 JN-65作用濃度的升高（圖 2-D），Jurkat細胞的增殖生長受到極強的抑制，僅在24 h作用后細胞存活率就低于50%：作用24 h的JN-65的 IC50為8.33μmol／L；作用 48 h的 JN-65的 IC50為4.68μmol／L；作用72 h的 JN-65的 IC50為3.12 μmol／L；對 U937作用 72 h的 JN-65的 IC50為10.46μmol／L。因此JN-65能高效抑制惡性血液腫瘤細胞，尤其是白血病細胞的增殖和生長，并且這種抑制呈現(xiàn)一定的劑量與時間依賴關(guān)系。

Figure 1 MTT methods for screening the active inhibitor and the chemical structure of JN-65JN-65：7-（1-Methyl-1H-pyrrolo［2，3-b］pyridin-4-yl）isoquinolin-1（2H）-one

Figure 2 JN-65 effectively inhibits the proliferation ofmalignant tumor cells.Various hematologic malignancies cells were treated with different concentrations of JN-65 for（A）24 h；（B）48 h；（C）72 h；（D）Jurkat cellswere treated with different times and concentrations of JN-65（±s，n=3）

3.3 JN-65抑制PI3K功能并有效抑制PI3K信號通路

以上實驗結(jié)果表明了在細胞水平JN-65對多種惡性血液腫瘤細胞的增殖具有顯著的抑制作用，為了進一步驗證JN-65對PI3K的抑制效果，采用ADP-Glo發(fā)光試劑盒進行體外PI3K激酶檢測。結(jié)果表明，JN-65對PI3K具有一定的抑制活性，IC50分別為：PI3Kα＞20μmol／L；PI3Kβ=（15.24±1.02）μmol／L；PI3Kδ=（18.24±1.43）μmol／L；PI3Kγ=（10.13±0.92）μmol／L。由此可見 JN-65對PI3K具有一定的抑制活性，其中對PI3Kγ的抑制活性較高，表現(xiàn)出一定的PI3K亞型選擇性抑制效果。為了進一步檢測JN-65在蛋白水平對PI3K信號通路的抑制作用，采用Western blot方法檢測在不同濃度的JN-65作用下PI3K信號通路關(guān)鍵蛋白Akt磷酸化（p-AktSer473）水平，分析活性化合物對PI3K／Akt信號通路相關(guān)因子的影響，進一步揭示候選化合物抑制白血病細胞的作用機制。選用Jurkat細胞作為實驗對象，結(jié)果見圖3，結(jié)果表明隨著化合物作用濃度的加大，p-Akt表達受到的抑制作用增強，同時化合物對total-Akt沒有明顯抑制作用。在Jurkat細胞中，JN-65表現(xiàn)出比陽性化合物更強的抑制效果，且這種抑制效果也呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。證明了在蛋白水平JN-65確實能夠有效地抑制PI3K的表達。

Figure 3 JN-65 inhibits the expression of PI3K／Akt signaling pathway

3.4 JN-65有效促進惡性血液腫瘤細胞的凋亡

上述實驗證明了JN-65對PI3K具有明顯的抑制作用，為了進一步觀察化合物對腫瘤細胞的促凋亡作用，運用流式細胞術(shù)來檢測化合物對腫瘤細胞的促凋亡作用。以Jurkat細胞作為實驗對象，將候選化合物作用于Jurkat細胞株孵育24 h后，經(jīng)Annexin V-FITC和碘化乙啶（PI）染色，用流式細胞儀分析Annexin V細胞的陽性率，分析Jurkat細胞的凋亡情況，結(jié)果見圖4?？梢钥闯鲭S著JN-65作用濃度的增大，細胞出現(xiàn)了顯著的凋亡。當(dāng)JN-65作用濃度為10μmol／L時，有超過一半的Jurkat腫瘤細胞發(fā)生凋亡，并在20μmol／L發(fā)生凋亡的細胞已高達74.1%。這表明JN-65能有效促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。

Figure 4 JN-65 induces the apoptosis of malignant hematological tumor cells

3.5 JN-65與PI3K活性口袋相互作用分析

上述生物學(xué)活性實驗已經(jīng)表明JN-65能通過抑制PI3K／Akt信號通路進而誘導(dǎo)惡性血液腫瘤細胞發(fā)生凋亡從而抑制腫瘤細胞的增殖，為了在分子水平深入研究JN-65與Ⅰ類PI3K的相互作用關(guān)系，通過分子對接技術(shù)將JN-65分別對接到4個PI3K亞型蛋白中，對接得分結(jié)果分別為PI3Kα=-5.60 kcal／mol、PI3Kβ=-10.23 kcal／mol、PI3Kδ=-6.18 kcal／mol、PI3Kγ=-11.40 kcal／mol。對接結(jié)果表明，JN-65與PI3Kγ的結(jié)合作用最強，顯著高于對PI3Kα及PI3Kδ的結(jié)合強度，該模擬結(jié)果也符合上述體外酶活性結(jié)果。對接結(jié)果如圖5所示，圖5A顯示PI3Kα活性口袋內(nèi)有一個殘基Lys656與JN-65的吡咯環(huán)形成π-H鍵，對比PI3Kα活性結(jié)合口袋，JN-65的吡咯環(huán)也與 PI3Kδ的殘基Met752形成了π-H鍵（圖5C）。除此之外，JN-65異喹啉酮上的酮基與PI3Kδ的殘基Val828形成了氫鍵，這增強了JN-65與PI3Kδ的相互作用。觀察圖5B，在PI3Kβ活性結(jié)合口袋內(nèi)，JN-65周圍有大量氨基酸，并且JN-65的吡啶環(huán)與Val847形成了π-H鍵，除此之外與殘基Val848通過氫鍵形成較強的相互作用。此外，JN-65異喹啉酮上的吡啶N與PI3Kβ的氨基酸Asp807形成氫鍵，酮基和氨基酸Tyr833形成氫鍵相互作用，這些氫鍵作用幫助JN-65穩(wěn)定在PI3Kβ的活性口袋內(nèi)，極大地改善了JN-65與PI3Kβ的結(jié)合親和力。分析PI3Kγ活性口袋（圖5D），發(fā)現(xiàn)JN-65圍繞著更多的非極性氨基酸，如 Phe961、Ile831、Trp812和 Lys833，這些氨基酸將 JN-65緊緊包圍在 PI3Kγ活性口袋內(nèi)。PI3Kγ的殘基Ala885和Ile879均和JN-65形成了π-H相互作用，尤其是氨基酸Val882與異喹啉酮上的吡啶N和酮基均形成了氫鍵相互作用。有趣的是，這些關(guān)鍵性氨基酸都是非極性氨基酸，因此非極性作用是JN-65與PI3K結(jié)合的關(guān)鍵作用。通過對比4個亞型在吡咯并吡啶環(huán)上和異喹啉酮上的吡啶環(huán)上與JN-65形成的π-H相互作用，研究發(fā)現(xiàn)在異喹啉酮的吡啶環(huán)上形成的π-H相互作用對JN-65結(jié)合PI3K活性口袋具有重要影響，這意味著異喹啉酮的吡啶環(huán)對JN-65與PI3K的親和力起到關(guān)鍵作用，為后期化合物結(jié)構(gòu)改造提供了一定的理論基礎(chǔ)。

Figure5 Presentation of JN-65 interacting with four isoforms of PI3Ks by 2D（left）and 3D（right）A：PI3Kα；B：PI3Kβ；C：PI3Kδ；D：PI3Kγ

4 討 論

在對82個化合物細胞篩選實驗中，化合物JN-65的抗腫瘤活性效果突出。隨后對包括白血病細胞和多發(fā)性骨髓瘤細胞在內(nèi)的多種惡性血液腫瘤細胞的增殖抑制作用檢測結(jié)果表明，JN-65能有效抑制惡性血液腫瘤細胞的生長和增殖，尤其是對白血病細胞抑制效果更強，其IC50最高可達3.125 μmol／L，并且其抑制作用呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。通過體外酶實驗發(fā)現(xiàn)JN-65對PI3K具有顯著的抑制作用，且對PI3Kγ表現(xiàn)出一定的選擇性抑制作用。大量研究表明了PI3Kγ主要表達于白血球中，對PI3Kγ的選擇性抑制往往有助于惡性血液腫瘤的治療［1］，上述細胞實驗表明JN-65對白血病細胞具有特異性抗增殖作用，因此推測這種特異性作用來源于JN-65對PI3Kγ的選擇性抑制。免疫印跡實驗結(jié)果證明，JN-65在蛋白水平能有效地抑制PI3K，進而阻滯p-Akt表達，最后通過這種抑制作用顯著地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。上述生物學(xué)實驗表明，JN-65可能成為一種潛在的PI3K抑制劑，用于治療惡性血液腫瘤。隨后，通過分子對接方法深入研究了JN-65與PI3K 4種亞型的結(jié)合機制，分子對接得分與上述酶實驗結(jié)果較為吻合，JN-65與PI3Kγ表現(xiàn)出較強的結(jié)合能力。通過構(gòu)象關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)非極性作用是JN-65與PI3K結(jié)合的關(guān)鍵作用，且異喹啉酮的吡啶環(huán)作為JN-65的結(jié)構(gòu)特征，對保持JN-65與PI3K的高親和性具有重要作用，為后期化合物設(shè)計及改造提供了一定的理論基礎(chǔ)。