韓俊 王建軍 龍光強 沈雪梅 余珊

摘要 [目的]應用正交試驗設計方法，篩選通關(guān)藤增殖培養(yǎng)基。[方法]以通關(guān)藤的誘導苗為試驗材料，采用L9（34）正交試驗設計方案研究培養(yǎng)基、6-BA（細胞分裂素）、NAA（萘乙酸）及不同接種部位4個試驗因子對通關(guān)藤增殖苗生長狀況和增殖率的影響。[結(jié)果]篩選出通關(guān)藤最佳增殖培養(yǎng)基方案為MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+莖尖。[結(jié)論]該研究為通關(guān)藤規(guī)模化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 通關(guān)藤;增殖培養(yǎng)基;組織培養(yǎng);激素;正交試驗

中圖分類號 S567文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0163-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.050

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]The orthogonal experiment design method was used to screen the proliferation medium of Marsdenia tenocissima.[Method]The induced seedlings of Marsdenia tenocissima were used as experimental materials， and the effects of four test factors of 6-BA （cytokinin）， NAA （naphthaleneacetic acid） and different inoculation sites on the growth status and proliferation rate of proliferation seedlings of Marsdenia tenocissima were studied by L9（34） orthogonal design.[Result]The optimal proliferation medium of Marsdenia tenocissima was MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+25 g/L sucrose+7 g/L agar+stem tip.[Conclusion]This research provides certain technical support for for scale production of Marsdenia tenocissima.

Key words Marsdenia tenocissima;Proliferation medium;Tissue culture;Hormone;Orthogonal text

基金項目 國家自然科學基金項目（81660636）;云南省科技計劃項目（2016RA009）。

作者簡介 韓?。?972—），女，云南硯山人，講師，碩士，從事中藥功效及藥用植物生理生化研究。*通信作者，副教授，碩士，碩士生導師，從事藥用植物生理生化研究。

收稿日期 2019-02-22;修回日期 2019-03-11

通關(guān)藤（Marsdenia tenocissima （Roxb）Wight et Arm）為蘿藦科牛奶藤屬多年生攀援木質(zhì)藤木植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)的云南、廣東、福建、臺灣、貴州等地，又名烏骨藤、奶漿藤、通光散等，為傣族、壯族、苗族常用藥物[1]。通關(guān)藤始載于《滇南本草》， 其味苦，性微甘，具有消炎止痛、清熱解毒、止咳平喘等作用[2]。通關(guān)藤中含有機酸、多糖、生物堿、樹脂、色素及甾體苷等化學成分，其中C21甾體類是其主要的化學成分，被現(xiàn)代醫(yī)學認為是具有抗腫瘤作用的最為主要的活性物[3-4]?，F(xiàn)代研究表明，通關(guān)藤還具有清熱、消炎、止咳、降壓、保肝、抗癌等功效[5]。

臨床采用通關(guān)藤總苷片及通光素，通關(guān)藤苷元甲治療慢性氣管炎[6]。目前通關(guān)藤在食管癌、宮頸癌、急性白血病等多種癌癥的治療方面也具有獨特優(yōu)勢[7]。

通關(guān)藤市場需求量大，生產(chǎn)上的原材料僅來自于野生資源和自然繁育，加上通關(guān)藤自身花多果少的生物特性導致的較低自然繁殖力，致使通關(guān)藤資源的日漸枯竭?，F(xiàn)多采用萌發(fā)通關(guān)藤種子與扦插的方法緩解該困境。但通關(guān)藤種子外圍有一層堅硬的種皮，萌發(fā)前需要浸種處理，但浸種時間過長可能會使種子的細胞壁過分吸水，使得種子內(nèi)水分過多而引起一些活力較差的種子因為缺氧而腐爛，進而導致發(fā)芽率和發(fā)芽勢都明顯下降[8]，而且通過種子繁育得到的實生苗品種易退化，并存在生長周期長、結(jié)實率低的弊端。其次在扦插繁育方面，采用河沙+泥炭+珍珠巖（3∶4∶3）的基質(zhì)的辦法來解決扦插時通關(guān)藤對保水性[9]、透氣性和保溫性的要求很不便捷，雖然有成活率較高的優(yōu)點，但后期感病嚴重，因此難以滿足市場需要。因此尋求一種便捷、適宜規(guī)?；a(chǎn)的通關(guān)藤繁育方法具有很強的現(xiàn)實性和長遠意義。組織培養(yǎng)技術(shù)是一種快速而又易于操作的人工繁育手段，為解決當前的通關(guān)藤野生資源枯竭提供了一條解決途徑。該試驗通過正交試驗設計方案，通過基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位外植體對通關(guān)藤增殖苗生長狀況及增殖率影響的研究，篩選出通關(guān)藤的最佳配方，以期為大規(guī)模的工廠生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通關(guān)藤試驗材料取于云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院組培室培育的健壯誘導苗。

1.2 試驗方法

采用正交試驗方法設計基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位外植體4個試驗因子，每個因子3個水平共9個處理。以B5、 MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，以2.5%（25 g/L）蔗糖為碳源，以7%（7 g/L）瓊脂固化，加熱至沸騰后加入6-BA與NAA，定容至1 L后調(diào)試pH為5.8;分裝完畢后在溫度121 ℃、壓強103.4 kPa下消毒30 min，30 min后轉(zhuǎn)入無菌接種室，靜置3～5 d備用。接種前4 h打開接種室紫外燈消毒，接種前穿戴口罩、實驗服、拖鞋并進行全身消毒;操作前對操作臺及試驗器皿進行消毒處理，選取健壯無菌通關(guān)藤誘導苗莖段為接種材料，自基部將誘導苗莖段按梢部、中部、基部剪為帶一個芽的莖段;分別將接種材料垂直插入培養(yǎng)基中;每個處理重復5瓶，每瓶接種3個。在溫度（25±2）℃、12 h/d光周期、12 h/d暗周期、2 000～2 500 lx光照強度下培養(yǎng)，培養(yǎng)50 d觀察并記錄莖粗、莖高及芽的生長狀況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 運用SPSS正交設計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，運用SSR法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

通關(guān)藤增殖苗不定芽培養(yǎng)7～10 d均開始萌發(fā)，長出嫩黃綠色的小葉，以后隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸轉(zhuǎn)為綠色。隨著莖不斷地長長、長粗，形成新的枝條。在培養(yǎng)過程中每5 d對增殖苗的長勢及葉子顏色變化進行描述記錄。到50 d時測量莖粗、莖高，計算增殖率，并進行綜合評定，結(jié)果見表1～2和圖1。

從表2可以看出，第4個處理（A2B1C2D1）無論是平均芽粗、平均芽高和增殖率都是相對最高的，芽葉的顏色也是最為嫩綠的，整個芽生長狀況的綜合評價都是優(yōu)。其次是第5個處理（A2B2C3D2）和第3個處理（A1B3C3D3），無論是平均芽粗、平均芽高和增殖率都較好，其余綜合評價較差。

2.1 方差分析 經(jīng)方差分析，培養(yǎng)基（A）、6-BA（B）、NAA （C）、外植體（D）對增殖苗的芽粗、芽高和芽的增殖率均存在極顯著的相關(guān)性，A、C、D對芽粗和增殖率生長影響均比較大，B的影響最小;A、B、D 對芽高生長影響較大，C的影響最小。A、B、C、D 4個因子的主效應差異均達到極顯著水平，即每個因子的各個水平間對平均芽粗、平均芽高、增殖率都是存在極顯著差異。其中4個因子對通關(guān)藤芽生長狀況的平均芽粗和增殖率影響大小依次是A>D>C>B;對通關(guān)藤的生長狀況芽高影響大小依次是 A>D>B>C。

2.2 主效應的多重比較 結(jié)果表明，A2即基本培養(yǎng)基（MS）對平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于A1和A3;B2即1.0 mg/L 6-BA對平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于B1和B3;C3即0.5 mg/L NAA對平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于C1和C2;D2即莖段中部對芽粗、芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于D1和D3。

2.3 各處理間的多重比較 方差分析結(jié)果顯示9個處理間效應差異極顯著，各個處理間對芽粗、芽高和增殖率影響的多重比較具有統(tǒng)計學意義，可從各處理間找出最優(yōu)組合。從9個處理間效應的多重比較（表2）可以看出，第4個處理A2B1C2D1（MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂）無論在芽粗、芽高和增殖率都是最高，并且綜合評價為優(yōu);這與各因子主效應的多重比較結(jié)果一致。第5個處理A2B2C3D2（MS+1.0? mg/L 6-BA+0.5? mg/L NAA+莖中+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂）無論在芽粗、芽高和增殖率都僅次于處理4，優(yōu)于其他處理，綜合評價也為優(yōu)。

3 討論與結(jié)論

試驗結(jié)果表明最佳培養(yǎng)配方為第4個處理A2B1C2D1（MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA + 莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂），其次是第5個處理A2B2C3D2（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+莖中+25 g/L蔗+7 g/L瓊脂），2個處理不管是在芽粗、芽高、增殖率和綜合評價都是相對較高的。

其中綜合評價為優(yōu)的第5個處理在配方中外植體選用的部位是莖稍的中部，這一結(jié)果與許多的植物組培[10-14]不一致，可能的原因之一是通關(guān)藤的根、莖、葉中均含有豐富的乳汁，會造成褐變;其次的原因是通關(guān)藤葉表面密生灰白色的柔毛，在轉(zhuǎn)接

的過程中容易黏附空氣中沒有殺滅的細菌和病毒而造成污染，這些問題都需要進一步的研究。其次配方中培養(yǎng)基選用MS為基本培養(yǎng)基，MS最適宜通關(guān)藤的頂芽與側(cè)芽生長，無論在芽粗、芽高、增殖率及芽生長狀況影響都是最大，1/2MS培養(yǎng)基對通關(guān)藤頂芽和側(cè)芽的芽粗、芽高和芽的增殖率影響次之，B5培養(yǎng)基對通關(guān)藤頂芽和側(cè)芽的芽粗、芽高及芽的增殖率影響最小。再次配方中6-BA的濃度在0.5～1.0 mg/L對通關(guān)藤生長不管在芽粗、芽高及芽的增殖率方面的影響都是隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，之后又逐漸降低，在1.0 mg/L時增殖效果最好。配方中NAA對通關(guān)藤的增殖率和生長狀況影響作用也是隨著質(zhì)量濃度的增加而增加的，可見NAA在較低質(zhì)量濃度時對通關(guān)藤所表現(xiàn)出來的激素效應就很明顯。這一結(jié)果與前一階段進行的通關(guān)藤誘導培養(yǎng)相一致[15]。NAA是否一直是隨著濃度的增加而對通關(guān)藤的生長呈正相關(guān)值得進一步研究。

正交試驗設計分析統(tǒng)計方法作為一種廣泛應用的科學研究方法，在復雜繁瑣的農(nóng)學類研究中具有無可比擬的優(yōu)勢。此次試驗所選用的9個處理在實際生產(chǎn)中具有較高的代表性，但是基于試驗時間倉促，所篩選出的配比方案在實際生產(chǎn)中可以將植物激素的種類和濃度水平的范圍進行適當?shù)恼{(diào)整，進而選出最優(yōu)最好的培養(yǎng)配方。此外，通關(guān)藤作為一種廣泛分布于熱帶、亞熱帶的植物，除了此次試驗中探究的4個試驗設計因子外，光周期和晝夜溫差也對通關(guān)藤的生長具有重要影響，值得進一步的研究。

該試驗以云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院組培室培育出的誘導無菌苗為轉(zhuǎn)接材料，以L9（34）正交試驗設計4個試驗因子，即基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位轉(zhuǎn)接材料對增殖苗的芽粗、芽高和增殖率影響的研究，試驗設計組培苗培養(yǎng)到50 d時測量其苗的芽粗、芽高和增殖率并進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)4個試驗設計因子對增殖苗的生長狀況及增殖率均具有極顯著的影響，最終篩選出通關(guān)藤增殖培養(yǎng)的最優(yōu)配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂。

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