韓俊 王建軍 龍光強 沈雪梅 余珊

摘要 [目的]應用正交試驗設計方法，篩選通關藤增殖培養(yǎng)基。[方法]以通關藤的誘導苗為試驗材料，采用L9（34）正交試驗設計方案研究培養(yǎng)基、6-BA（細胞分裂素）、NAA（萘乙酸）及不同接種部位4個試驗因子對通關藤增殖苗生長狀況和增殖率的影響。[結果]篩選出通關藤最佳增殖培養(yǎng)基方案為MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+莖尖。[結論]該研究為通關藤規(guī)?；a(chǎn)提供一定的技術支持。

關鍵詞 通關藤;增殖培養(yǎng)基;組織培養(yǎng);激素;正交試驗

中圖分類號 S567文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0163-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.050

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]The orthogonal experiment design method was used to screen the proliferation medium of Marsdenia tenocissima.[Method]The induced seedlings of Marsdenia tenocissima were used as experimental materials， and the effects of four test factors of 6-BA （cytokinin）， NAA （naphthaleneacetic acid） and different inoculation sites on the growth status and proliferation rate of proliferation seedlings of Marsdenia tenocissima were studied by L9（34） orthogonal design.[Result]The optimal proliferation medium of Marsdenia tenocissima was MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+25 g/L sucrose+7 g/L agar+stem tip.[Conclusion]This research provides certain technical support for for scale production of Marsdenia tenocissima.

Key words Marsdenia tenocissima;Proliferation medium;Tissue culture;Hormone;Orthogonal text

基金項目 國家自然科學基金項目（81660636）;云南省科技計劃項目（2016RA009）。

作者簡介 韓?。?972—），女，云南硯山人，講師，碩士，從事中藥功效及藥用植物生理生化研究。*通信作者，副教授，碩士，碩士生導師，從事藥用植物生理生化研究。

收稿日期 2019-02-22;修回日期 2019-03-11

通關藤（Marsdenia tenocissima （Roxb）Wight et Arm）為蘿藦科牛奶藤屬多年生攀援木質藤木植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)的云南、廣東、福建、臺灣、貴州等地，又名烏骨藤、奶漿藤、通光散等，為傣族、壯族、苗族常用藥物[1]。通關藤始載于《滇南本草》， 其味苦，性微甘，具有消炎止痛、清熱解毒、止咳平喘等作用[2]。通關藤中含有機酸、多糖、生物堿、樹脂、色素及甾體苷等化學成分，其中C21甾體類是其主要的化學成分，被現(xiàn)代醫(yī)學認為是具有抗腫瘤作用的最為主要的活性物[3-4]。現(xiàn)代研究表明，通關藤還具有清熱、消炎、止咳、降壓、保肝、抗癌等功效[5]。

臨床采用通關藤總苷片及通光素，通關藤苷元甲治療慢性氣管炎[6]。目前通關藤在食管癌、宮頸癌、急性白血病等多種癌癥的治療方面也具有獨特優(yōu)勢[7]。

通關藤市場需求量大，生產(chǎn)上的原材料僅來自于野生資源和自然繁育，加上通關藤自身花多果少的生物特性導致的較低自然繁殖力，致使通關藤資源的日漸枯竭?，F(xiàn)多采用萌發(fā)通關藤種子與扦插的方法緩解該困境。但通關藤種子外圍有一層堅硬的種皮，萌發(fā)前需要浸種處理，但浸種時間過長可能會使種子的細胞壁過分吸水，使得種子內水分過多而引起一些活力較差的種子因為缺氧而腐爛，進而導致發(fā)芽率和發(fā)芽勢都明顯下降[8]，而且通過種子繁育得到的實生苗品種易退化，并存在生長周期長、結實率低的弊端。其次在扦插繁育方面，采用河沙+泥炭+珍珠巖（3∶4∶3）的基質的辦法來解決扦插時通關藤對保水性[9]、透氣性和保溫性的要求很不便捷，雖然有成活率較高的優(yōu)點，但后期感病嚴重，因此難以滿足市場需要。因此尋求一種便捷、適宜規(guī)?；a(chǎn)的通關藤繁育方法具有很強的現(xiàn)實性和長遠意義。組織培養(yǎng)技術是一種快速而又易于操作的人工繁育手段，為解決當前的通關藤野生資源枯竭提供了一條解決途徑。該試驗通過正交試驗設計方案，通過基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位外植體對通關藤增殖苗生長狀況及增殖率影響的研究，篩選出通關藤的最佳配方，以期為大規(guī)模的工廠生產(chǎn)提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通關藤試驗材料取于云南農業(yè)大學農學與生物技術學院組培室培育的健壯誘導苗。

1.2 試驗方法

采用正交試驗方法設計基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位外植體4個試驗因子，每個因子3個水平共9個處理。以B5、 MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，以2.5%（25 g/L）蔗糖為碳源，以7%（7 g/L）瓊脂固化，加熱至沸騰后加入6-BA與NAA，定容至1 L后調試pH為5.8;分裝完畢后在溫度121 ℃、壓強103.4 kPa下消毒30 min，30 min后轉入無菌接種室，靜置3～5 d備用。接種前4 h打開接種室紫外燈消毒，接種前穿戴口罩、實驗服、拖鞋并進行全身消毒;操作前對操作臺及試驗器皿進行消毒處理，選取健壯無菌通關藤誘導苗莖段為接種材料，自基部將誘導苗莖段按梢部、中部、基部剪為帶一個芽的莖段;分別將接種材料垂直插入培養(yǎng)基中;每個處理重復5瓶，每瓶接種3個。在溫度（25±2）℃、12 h/d光周期、12 h/d暗周期、2 000～2 500 lx光照強度下培養(yǎng)，培養(yǎng)50 d觀察并記錄莖粗、莖高及芽的生長狀況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 運用SPSS正交設計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，運用SSR法進行多重比較。

2 結果與分析

通關藤增殖苗不定芽培養(yǎng)7～10 d均開始萌發(fā)，長出嫩黃綠色的小葉，以后隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸轉為綠色。隨著莖不斷地長長、長粗，形成新的枝條。在培養(yǎng)過程中每5 d對增殖苗的長勢及葉子顏色變化進行描述記錄。到50 d時測量莖粗、莖高，計算增殖率，并進行綜合評定，結果見表1～2和圖1。

從表2可以看出，第4個處理（A2B1C2D1）無論是平均芽粗、平均芽高和增殖率都是相對最高的，芽葉的顏色也是最為嫩綠的，整個芽生長狀況的綜合評價都是優(yōu)。其次是第5個處理（A2B2C3D2）和第3個處理（A1B3C3D3），無論是平均芽粗、平均芽高和增殖率都較好，其余綜合評價較差。

2.1 方差分析 經(jīng)方差分析，培養(yǎng)基（A）、6-BA（B）、NAA （C）、外植體（D）對增殖苗的芽粗、芽高和芽的增殖率均存在極顯著的相關性，A、C、D對芽粗和增殖率生長影響均比較大，B的影響最小;A、B、D 對芽高生長影響較大，C的影響最小。A、B、C、D 4個因子的主效應差異均達到極顯著水平，即每個因子的各個水平間對平均芽粗、平均芽高、增殖率都是存在極顯著差異。其中4個因子對通關藤芽生長狀況的平均芽粗和增殖率影響大小依次是A>D>C>B;對通關藤的生長狀況芽高影響大小依次是 A>D>B>C。

2.2 主效應的多重比較 結果表明，A2即基本培養(yǎng)基（MS）對平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于A1和A3;B2即1.0 mg/L 6-BA對平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于B1和B3;C3即0.5 mg/L NAA對平均芽粗、平均芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于C1和C2;D2即莖段中部對芽粗、芽高和增殖率有極顯著差異，優(yōu)于D1和D3。

2.3 各處理間的多重比較 方差分析結果顯示9個處理間效應差異極顯著，各個處理間對芽粗、芽高和增殖率影響的多重比較具有統(tǒng)計學意義，可從各處理間找出最優(yōu)組合。從9個處理間效應的多重比較（表2）可以看出，第4個處理A2B1C2D1（MS+0.5? mg/L 6-BA+0.3? mg/L NAA+莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂）無論在芽粗、芽高和增殖率都是最高，并且綜合評價為優(yōu);這與各因子主效應的多重比較結果一致。第5個處理A2B2C3D2（MS+1.0? mg/L 6-BA+0.5? mg/L NAA+莖中+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂）無論在芽粗、芽高和增殖率都僅次于處理4，優(yōu)于其他處理，綜合評價也為優(yōu)。

3 討論與結論

試驗結果表明最佳培養(yǎng)配方為第4個處理A2B1C2D1（MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA + 莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂），其次是第5個處理A2B2C3D2（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+莖中+25 g/L蔗+7 g/L瓊脂），2個處理不管是在芽粗、芽高、增殖率和綜合評價都是相對較高的。

其中綜合評價為優(yōu)的第5個處理在配方中外植體選用的部位是莖稍的中部，這一結果與許多的植物組培[10-14]不一致，可能的原因之一是通關藤的根、莖、葉中均含有豐富的乳汁，會造成褐變;其次的原因是通關藤葉表面密生灰白色的柔毛，在轉接

的過程中容易黏附空氣中沒有殺滅的細菌和病毒而造成污染，這些問題都需要進一步的研究。其次配方中培養(yǎng)基選用MS為基本培養(yǎng)基，MS最適宜通關藤的頂芽與側芽生長，無論在芽粗、芽高、增殖率及芽生長狀況影響都是最大，1/2MS培養(yǎng)基對通關藤頂芽和側芽的芽粗、芽高和芽的增殖率影響次之，B5培養(yǎng)基對通關藤頂芽和側芽的芽粗、芽高及芽的增殖率影響最小。再次配方中6-BA的濃度在0.5～1.0 mg/L對通關藤生長不管在芽粗、芽高及芽的增殖率方面的影響都是隨著質量濃度的增加而增加，之后又逐漸降低，在1.0 mg/L時增殖效果最好。配方中NAA對通關藤的增殖率和生長狀況影響作用也是隨著質量濃度的增加而增加的，可見NAA在較低質量濃度時對通關藤所表現(xiàn)出來的激素效應就很明顯。這一結果與前一階段進行的通關藤誘導培養(yǎng)相一致[15]。NAA是否一直是隨著濃度的增加而對通關藤的生長呈正相關值得進一步研究。

正交試驗設計分析統(tǒng)計方法作為一種廣泛應用的科學研究方法，在復雜繁瑣的農學類研究中具有無可比擬的優(yōu)勢。此次試驗所選用的9個處理在實際生產(chǎn)中具有較高的代表性，但是基于試驗時間倉促，所篩選出的配比方案在實際生產(chǎn)中可以將植物激素的種類和濃度水平的范圍進行適當?shù)恼{整，進而選出最優(yōu)最好的培養(yǎng)配方。此外，通關藤作為一種廣泛分布于熱帶、亞熱帶的植物，除了此次試驗中探究的4個試驗設計因子外，光周期和晝夜溫差也對通關藤的生長具有重要影響，值得進一步的研究。

該試驗以云南農業(yè)大學農學與生物技術學院組培室培育出的誘導無菌苗為轉接材料，以L9（34）正交試驗設計4個試驗因子，即基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA及不同部位轉接材料對增殖苗的芽粗、芽高和增殖率影響的研究，試驗設計組培苗培養(yǎng)到50 d時測量其苗的芽粗、芽高和增殖率并進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)4個試驗設計因子對增殖苗的生長狀況及增殖率均具有極顯著的影響，最終篩選出通關藤增殖培養(yǎng)的最優(yōu)配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+莖尖+25 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂。

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