王軍 李迎賓 楊許召 鄒文苑 王萍 惠蒙蒙

關(guān)鍵詞：

咪唑基離子液體;表面活性劑;牛血清蛋白;相互作用

摘要：以N-甲基咪唑、溴代十四烷和雙氰胺銀為原料，采用兩步法合成了1-十四烷基-3-甲基咪唑雙氰胺鹽（[C14mim][DCA]），并對(duì)其與牛血清蛋白（BSA）混合體系的相互作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明：1）混合體系的cmc值和Amin值均隨BSA濃度的增加而變大;2）混合體系中[C14mim][DCA]與BSA間的相互作用對(duì)BSA上氨基酸殘基微環(huán)境有影響，且主要影響B(tài)SA上的色氨酸（Trp）殘基;3）混合體系中[C14mim][DCA]與BSA間的相互作用會(huì)影響體系的水力學(xué)半徑，且隨著[C14mim][DCA]濃度的增加，[C14mim][DCA]/BSA體系的水力學(xué)半徑變大，并對(duì)BSA的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響——使BSA展開(kāi).

0 引言

蛋白質(zhì)和表面活性劑的相互作用一直是業(yè)界近幾年來(lái)的研究熱點(diǎn).其中，牛血清蛋白與表面活性劑相互作用機(jī)理的研究對(duì)蛋白質(zhì)的變性、再折疊、浮選和分離等技術(shù)具有指導(dǎo)意義[1-2].同時(shí)，蛋白質(zhì)又是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，是一類(lèi)帶有疏水基的兩性聚電解質(zhì)，存在等電點(diǎn)，因此其與表面活性劑之間的相互作用和表面活性劑的種類(lèi)有很大關(guān)系.陰離子表面活性劑與蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生很強(qiáng)的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，且已經(jīng)被廣泛研究[3-5].對(duì)于陽(yáng)離子表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用的研究也有相關(guān)報(bào)道[6-7]，但相比于陰離子表面活性劑與蛋白質(zhì)的研究而言稍顯缺乏.

離子液體表面活性劑作為一種功能化離子液體，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型表面活性劑，一般由疏水側(cè)鏈和親水頭基兩部分組成，具有親水、親油兩親特性，且其極性、親水性、親油性可以通過(guò)選擇合適的陰離子、陽(yáng)離子來(lái)進(jìn)行調(diào)整[8-9]，兼有離子液體和表面活性劑的性質(zhì)，具有更廣的應(yīng)用前景，特別是在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域.T.Singh等[10]研究了不同鏈長(zhǎng)與明膠的相互作用，于麗等[11-12]以表面張力和熒光光譜法研究了咪唑類(lèi)離子液體與牛血清蛋白的相互作用行為.然而，對(duì)于離子液體與牛血清蛋白（BSA）相互作用機(jī)理的研究之信息有限.本文擬以N-甲基咪唑、溴代十四烷和雙氰胺銀為原料，采用兩步法合成一種咪唑基離子液體表面活性劑——1-十四烷基-3-甲基咪唑雙氰胺鹽（[C14mim][DCA]），并研究其與牛血清蛋白混合體系的相互作用，探討其相互作用機(jī)理，以期為此類(lèi)表面活性劑在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：N-甲基咪唑、溴代十四烷（工業(yè)級(jí)），江蘇鹽城市龍升精細(xì)化工廠產(chǎn);雙氰胺銀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%），鄭州輕工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室制;硫氰酸鉀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%），天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司產(chǎn);甲醇（AR），天津永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn);乙腈（AR），科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn);丙酮（AR），洛陽(yáng)化學(xué)試劑廠產(chǎn);乙酸乙酯（AR），天津富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn);牛血清蛋白（BSA，分子量68 000），Solarbio公司產(chǎn).

主要儀器：SZCL-2型智能磁力攪拌電熱套，上海司樂(lè)儀器有限公司產(chǎn);RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;10-ND型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;Avance300型核磁共振儀，德國(guó)Bruker公司產(chǎn);K100 自動(dòng)界面張力儀，德國(guó)Kruss公司產(chǎn);ALV-3動(dòng)靜態(tài)同步激光光散射儀，德國(guó)ALV公司產(chǎn);Hitachi U-3900H型紫外可見(jiàn)光譜儀、Hitachi 7000型熒光分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司產(chǎn).

1.2 離子液體表面活性劑的制備

1.2.1 [C14mim][Br]的制備 分別稱取16.42 g （0.2 mol）N-甲基咪唑和55.46 g（0.2 mol）溴代十四烷，將其放入250 mL的三口燒瓶中，加入50 mL異丙醇，升溫至80 ℃，攪拌反應(yīng)48 h，冷卻后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出溶劑，用乙酸乙酯洗滌3次，冷凍結(jié)晶得白色晶體，即為產(chǎn)物[C14mim][Br]，收率88.7%.

1.2.2 目標(biāo)產(chǎn)物的制備 稱取35.39 g （0.1 mol）的[C14mim][Br]放入 250 mL 單口燒瓶中，加入去離子水?dāng)嚢枋蛊涑浞秩芙?，再緩慢滴加用去離子水混合均勻的20.87 g （0.12 mol）的AgN（CN）2，快速攪拌，40 ℃下避光反應(yīng)6 h，靜置，取上層清液減圧蒸餾除去溶劑后加入過(guò)量甲醇充分?jǐn)嚢枞芙猓? ℃ 下靜置2 h后，過(guò)濾除去不溶物，重復(fù)操作直至無(wú)沉淀析出，減壓蒸餾出甲醇，繼續(xù)依次用乙腈、丙酮反復(fù)洗滌.洗滌至無(wú)不溶物后減壓蒸餾除去溶劑，冷凍真空干燥48 h，即得目標(biāo)產(chǎn)物，收率89.7%.

1.3 表征與測(cè)定方法

1.3.1 目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征 采用核磁共振波譜儀對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，溶劑為氘代二甲基亞砜.

1.3.2 混合體系表面活性參數(shù)的測(cè)定 采用表面張力法，向已配制好的溶度分別為2×10-6 mol/L，1×10-5 mol/L和 5×10-5 mol/L的BSA溶液中滴加離子液體表面活性劑，在自動(dòng)表面張力儀上測(cè)定混合體系的表面活性參數(shù)，

1.3.5 混合體系水力學(xué)半徑分布測(cè)量 固定BSA濃度為5×10-5 mol/L，配制含有不同離子液體表面活性劑濃度的混合體系溶液.采用動(dòng)靜態(tài)同步激光光散射儀對(duì)混合體系進(jìn)行水力學(xué)半徑分布測(cè)量，每次測(cè)量前將所有樣品經(jīng) 0.45 μm的濾膜過(guò)濾，以除去灰塵.

以上實(shí)驗(yàn)溫度均為（25±1） ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

目標(biāo)產(chǎn)物的1H NMR和13C NMR表征結(jié)果如下：

2.2 [C14mim][DCA]/BSA體系的表面活性分析? [C14mim][DCA]/BSA體系的表面活性參數(shù)見(jiàn)表1.由表1可知，當(dāng)BSA濃度為0 mol/L時(shí)，[C14mim][DCA]具有很好的表面活性.隨著B(niǎo)SA濃度的增加，臨界膠束濃度（cmc）值逐漸增大，這是因?yàn)樵赱C14mim][DCA]中加入BSA后，隨著濃度的逐漸增大（小于1.0×10-5 mol/L），由于靜電吸引，大部分的[C14mim][DCA]與BSA發(fā)生相互作用，體系中游離的[C14mim][DCA]減少;當(dāng)[C14mim][DCA]濃度大于1.0×10-5 mol/L時(shí)，離子液體表面活性劑在BSA上的靜電吸附達(dá)到飽和，體系表面張力急劇下降，cmc值增大.[C14mim][DCA]與BSA相互作用使BSA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，BSA鏈的展開(kāi)使[C14mim][DCA]的Гmax減小，Amin增大.

2.3 [C14mim][DCA]/BSA體系的紫外可見(jiàn)光譜分析? [C14mim][DCA]/BSA體系的紫外可見(jiàn)光譜如圖1所示.由圖1可知，BSA溶液在紫外區(qū)278 nm左右處有明顯的吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)[13]可知，芳香性氨基酸上的芳雜環(huán)n-π*躍遷可以在250 ～300 nm范圍內(nèi)產(chǎn)生紫外吸收，其吸收性質(zhì)由芳香族氨基酸的含量所決定.[C14mim][DCA]在此紫外區(qū)間內(nèi)沒(méi)有吸收峰，但當(dāng)BSA中加入[C14mim][DCA] 后，BSA的吸收峰強(qiáng)度發(fā)生了變化，這說(shuō)明[C14mim][DCA]與BSA發(fā)生了相互作用，對(duì)BSA上氨基酸殘基的微環(huán)境產(chǎn)生了影響.隨著[C14mim][DCA]濃度的增大，體系的吸收峰強(qiáng)度逐漸增大，而在278 nm處的峰位置并未發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移，說(shuō)明[C14mim][DCA]對(duì)BSA蛋白質(zhì)肽鏈上的芳香性氨基酸殘基的周?chē)h(huán)境影響較小.

2.4 [C14mim][DCA]/BSA體系的熒光光譜分析2.4.1 穩(wěn)態(tài)熒光光譜分析 [C14mim][DCA]/BSA體系的穩(wěn)態(tài)熒光光譜圖如圖2所示.由圖2可以看出，BSA在338 nm左右有強(qiáng)吸收峰，而[C14mim][DCA]在300～450 nm范圍內(nèi)沒(méi)有明顯吸收峰.隨著[C14mim][DCA]濃度的增大，體系的吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，同時(shí)伴隨著藍(lán)移， 最大發(fā)射波長(zhǎng)從338 nm減小到332 nm.這種轉(zhuǎn)變表明，[C14mim][DCA]/BSA復(fù)合物的形成，導(dǎo)致BSA的氨基酸殘基暴露在

更加疏水的微環(huán)境中[14];當(dāng)[C14mim][DCA]濃度大于3.0×10-3 mol/L時(shí)，體系的最大發(fā)射峰變化較小.因此，較低濃度（<3.0×10-3 mol/L）的[C14mim][DCA]對(duì)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定作用，而高于一定濃度（>3.0×10-3 mol/L）時(shí)有破壞作用，二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞使BSA展開(kāi)并變性，故[C14mim][DCA]在保護(hù)和破壞BSA結(jié)構(gòu)上具有更大的優(yōu)勢(shì).

2.5 [C14mim][DCA]/BSA體系的水力學(xué)半徑分布與分析? [C14mim][DCA]/BSA體系的水力學(xué)半徑（Rh）分布結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，體系的水力學(xué)半徑在4.6 nm和100 nm左右有兩個(gè)峰.當(dāng)[C14mim][DCA]濃度小于2.0×10-4 mol/L時(shí)，體系的水力學(xué)半徑?jīng)]有明顯變化，但當(dāng)其濃度為5.0×10-4 mol/L時(shí)，原來(lái)兩個(gè)峰的強(qiáng)度減弱，在648 nm處出現(xiàn)一個(gè)新峰，這是由于[C14mim][DCA]的加入導(dǎo)致部分BSA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使BSA鏈展開(kāi)，隨著其濃度的增大，648 nm的峰向更大半徑分布方向移動(dòng);當(dāng)其濃度為1.2×10-3 mol/L時(shí)，半徑分布為898 nm左右，并且相關(guān)強(qiáng)度也隨之增大;當(dāng)濃度為5.0×10-3 mol/L時(shí)，半徑分布為1150 nm左右，再增大濃度，半徑分布變化較小，推測(cè)此時(shí)BSA已經(jīng)完全展開(kāi)，除4.6 nm處和1150 nm處之外，在1～10 nm 之間還有一個(gè)半徑分布，這可能是由[C14mim][DCA]與BSA的復(fù)合物達(dá)到飽和后在水溶液中形成的自由膠束產(chǎn)生的.

3 結(jié)論

本文以N-甲基咪唑、溴代十四烷和雙氰胺銀為原料，采用兩步法合成了咪唑基離子液體表面活性劑，經(jīng)核磁共振確認(rèn)該產(chǎn)物為[C14mim][DCA]，運(yùn)用表面張力法、紫外可見(jiàn)光譜法、熒光光譜法和動(dòng)態(tài)光散射法研究了[C14mim][DCA]與BSA在其混合體系中的相互作用，得到如下結(jié)論：

1） 混合體系的cmc值和Amin值均隨BSA濃度的增加而變大;

2） 混合體系中[C14mim][DCA]與BSA間的相互作用對(duì)BSA上氨基酸殘基微環(huán)境有影響;混合體系中[C14mim][DCA]濃度較低時(shí)，對(duì)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定作用，而高于一定濃度時(shí)有破壞作用，二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞使BSA展開(kāi)并變性，且主要影響B(tài)SA上的Trp殘基;

3） 混合體系中[C14mim][DCA]與BSA的相互作用會(huì)影響體系的Rh，且隨著[C14mim][DCA]濃度的增加，[C14mim] [DCA]/BSA體系的Rh變大，當(dāng)其濃度為5.0×10-3 mol/L時(shí)， BSA已經(jīng)完全展開(kāi).

該研究將為理解離子液體表面活性劑與蛋白質(zhì)的相互作用，并為拓展離子液體表面活性劑在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用提供重要的理論依據(jù).

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