韓曉梅，吳小禾，李文亞，孫一丹，桑亞新，孫紀錄，*

（1.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.中山火炬職業(yè)技術學院生物醫(yī)學系，廣東 中山 528436）

隨著人工養(yǎng)殖的發(fā)展，我國蝦產量逐年遞增，在加工或食用過程中產生大量的蝦殼。長期以來，蝦殼除少量被低值化利用之外，多是作為垃圾扔掉，既浪費資源，又污染環(huán)境。甲殼素（chitin）又稱幾丁質，廣泛存在于甲殼類動物中[1]，如，蝦殼中甲殼素含量高達20%～25%[2]。甲殼素是一種高分子的糖化合物，吸濕性強，能夠吸附重金屬離子，無毒無味，可以作為填充劑、穩(wěn)定劑、脫色劑等，已在醫(yī)藥、農業(yè)、輕紡、環(huán)保等領域廣泛應用[3-5]。

目前，甲殼素的提取及其衍生物的制備廣受關注[6-9]。在工業(yè)上，從蝦殼中提取甲殼素，主要過程為在機械攪拌下用鹽酸脫鈣，用堿脫蛋白質[10]。然而，在脫鈣的同時，鹽酸會破壞甲殼素分子結構[11]，并且酸堿用量大，洗滌用水多，大量酸堿液排放造成嚴重的環(huán)境污染[12]。電解水通過電解稀鹽（通常是NaCl）溶液產生[13-14]。從陰極得到的堿性部分被稱為堿性電解水（basic electrolyzed water，BEW），其 pH 值可達 11 左右。同時從陽極獲得的酸性部分被稱為酸性電解水（acidic electrolyzed water，AEW），其 pH 值可達 2.6 左右[15]。關于電解水的應用，已有諸多研究報道[16-18]。目前，AEW 主要作為一種殺菌劑[19-20]。電解水對人體健康和環(huán)境無害，安全性好，可現(xiàn)場生產，操作簡便，價格低廉[21]。AEW 和BEW 與傳統(tǒng)工藝中使用的鹽酸和氫氧化鈉在酸堿性方面具有極高的相似性，有潛力部分取代甚至完全取代它們。本文擬采用AEW 和BEW 處理蝦殼進行脫礦物質和脫蛋白的系統(tǒng)研究，以期開發(fā)一種新型的綠色環(huán)保的提取甲殼素工藝方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦殼：東方對蝦蝦殼，購自河北省黃驊市，清洗，50 ℃電熱鼓風干燥器中干燥12 h，粉碎，分級過篩（40、60、80、120 目）。

氯化鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）、硝酸（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；過氧化氫（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；鉛單元素標準溶液、砷單元素標準溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 儀器與設備

電解水發(fā)生器：河北農業(yè)大學食品科技學院食品微生物學實驗室自制；XL-100 型馬弗爐：河南市鶴壁億欣儀器儀表有限公司；JJ-1 型電動攪拌器：常州國宇儀器制造有限公司；SU8010 型掃描電子顯微鏡：Hitachi；FW100 型高速萬能粉碎機、WGL-125B 型電熱鼓風干燥器：天津市泰斯特儀器有限公司；6200 型熱重-卡量計雙重分析儀：東莞市好邁電子科技有限公司；Spectrum65 型傅里葉紅外光譜儀：上海航歐機電設備有限公司；7700x 型電感耦合等離子體質譜儀：蘇州工業(yè)園區(qū)三源芯輝電子科技有限公司；TANK 型微波消解儀：濟南海能儀器股份有限公司；ZEEnit 700P 型火焰原子吸收器：德國耶拿分析儀器股份公司；AS-1型Pb 原子吸收空心陰極燈：北京有色金屬研究總院。

1.3 方法

1.3.1 酸性電解水批次處理蝦殼脫礦物質研究

用1%NaCl 溶液制備電解水，電壓為20 V，從酸性電解槽中獲得酸性電解水，用于批次處理蝦殼粉。按0.1 g/mL 的比例，在蝦殼粉中加入酸性電解水，在30 ℃、180 r/min 搖床上進行反應，直至無氣泡產生；測定反應后溶液的pH 值；然后，將殘渣洗滌至中性，5 000 r/min 離心10 min。將殘渣于60 ℃干燥8 h，測定殘渣的重量和灰分含量。

1.3.2 酸性電解水連續(xù)處理蝦殼脫礦物質研究

向電解水發(fā)生器的酸性、堿性電解槽中分別加入1 L 的 1%（或 0.1%）NaCl 溶液，稱取 20 g120 目的蝦殼粉放入到酸性電解槽中，攪拌10 min，測定起始pH值。然后進行電解，電壓為20 V，不斷攪拌，處理6 h。抽濾，除去電解液，然后將殘渣洗滌至中性，5 000 r/min離心10 min，于60 ℃干燥8 h，測定殘渣的質量和灰分含量。

1.3.3 酸性電解水處理蝦殼節(jié)約鹽酸使用量的效果評價

取120 目蝦殼粉20 g 于燒杯，邊攪拌邊緩慢加入1 mol/L 鹽酸，當pH 值下降至1 左右時，脫礦物質結束，記錄鹽酸使用量。將殘渣洗滌至中性，5 000 r/min離心10 min，于60 ℃下干燥8 h，測定殘渣的質量及其灰分含量。稱取相同質量的蝦殼粉，使用1%（或0.1 %）的NaCl 溶液制備的AEW 連續(xù)處理，處理結束后，抽濾除去電解液，將蝦殼粉殘渣洗滌至中性，5 000 r/min 離心10 min，收集殘渣。向得到的殘渣中加入1 mol/L 鹽酸，繼續(xù)處理。當pH 值下降至1 左右時，脫礦物質結束，記錄鹽酸使用量。比較以上兩種處理方式的鹽酸使用量，即可評價酸性電解水處理蝦殼節(jié)約鹽酸用量的效果。

1.3.4 堿性電解水在蝦殼脫蛋白質中的應用研究

向電解水發(fā)生器的酸性、堿性電解槽中分別加入1 L 的 1%（或 0.1%）NaCl 溶液，稱取 20 g120 目的蝦殼粉放入到堿性電解槽中，攪拌10 min，測定起始pH值。然后進行電解，電壓為20 V，不斷攪拌，反應6 h。反應結束后，過濾電解液，將蝦殼粉殘渣洗滌至中性，5 000r/min 離心10min。將所得殘渣于60 ℃下干燥8 h，測定殘渣的質量，蛋白質含量，并計算蛋白質脫除率。

1.3.5 傳統(tǒng)無機酸堿法制備甲殼素

取120 目蝦殼粉20 g 于燒杯，邊攪拌邊緩慢加入1 mol/L 鹽酸，當pH 值下降至1 左右時，脫礦物質結束。然后，過濾洗滌。向濾渣中加入一定量的2 mol/L NaOH 溶液，于70 ℃下反應4 h，以除去所有蛋白質。過濾，將殘渣洗滌至中性，5 000 r/min 離心10 min，再于60 ℃下干燥8 h，即得甲殼素。

1.3.6 酸性電解水和堿性電解水聯(lián)合處理蝦殼提取甲殼素研究

1）先酸性電解水后堿性電解水聯(lián)合處理從蝦殼中提取甲殼素：向電解水發(fā)生器的酸性、堿性電解槽中分別加入1 L 的1%NaCl 溶液，稱取20 g 120 目的蝦殼粉放入到酸性電解槽中，進行電解，反應6 h，反應結束后，過濾電解液，將殘渣洗滌至中性，5 000 r/min 離心10 min。然后，將殘渣置于堿性電解槽中，反應6 h，反應結束后，過濾并洗滌至中性，5 000 r/min 離心10 min，再于60 ℃下干燥8 h，從而制得甲殼素，測定甲殼素的收率以及灰分含量和蛋白質含量。

2）先堿性電解水后酸性電解水聯(lián)合處理從蝦殼中提取甲殼素：為了進一步考察AEW 與BEW 處理順序對提取甲殼素的影響，交換1.3.6 章節(jié)1）中AEW 和BEW 對蝦殼的處理順序，其他條件不變，制得甲殼素，并測定甲殼素的收率以及灰分含量和蛋白質含量。

1.3.7 甲殼素的理化性質檢測

1）灰分含量的測定：參照國標GB5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》。

2）蛋白質含量及脫除率的測定：參照韓曉梅等的方法[22]。

3）水分的測定：采用直接干燥法，參照國標：GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》。

4）砷含量的測定：檢測模式，氦模式；流速，5.0 mL/min；標準品配制，將砷元素標準品溶液用5%硝酸溶液稀釋到 2、4、8、12、16、20 μg/L；樣品處理，稱取約50 mg 樣品于微波消解管中，加入5 mL 硝酸，同時做樣品空白，運行微波消解程序，消解結束，100 ℃，100 min 趕酸，放至室溫，用稀釋液定容到50 mL，上機檢測，繪制砷元素標準曲線，如圖1所示。

5）鉛含量的測定：吸取鉛標準儲備液5.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用 1 mol/LHNO3定容至100 mL，制備50 μg/mL 鉛標準使用液。吸取鉛標準使用液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL，分別置于 100 mL 容量瓶中，用1 mol/L HNO3定容，配制成標準工作液系列，其中鉛濃度分別為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μg/mL。稱取1.000 g 試樣于消解罐中，加6.0 mL 硝酸、2.0 mL 過氧化氫（30%），混合均勻，于微波消化儀中消化，消解完成后，自然冷卻至室溫，開蓋趕酸，將消化液洗入10 mL容量瓶中，用水少量多次洗滌罐，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混勻備用，同時做試劑空白試驗。將制備好的鉛標準工作液、空白溶液和試樣溶液分別導入空氣-乙炔火焰原子吸收分光光度計中，以鉛元素空心陰極燈為光源，在波長283.3 nm 處調整儀器于最佳工作狀態(tài)，分別測定各自的吸光度。以標準工作液中鉛濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖2所示。

圖1 砷元素含量標準曲線Fig.1 The standard curve of arsenic content

圖2 鉛元素含量標準曲線Fig.2 The standard curve of lead content

6）掃描電鏡分析：取分散好的甲殼素樣品微量，置于銅片上，干燥，將載有樣品的銅片粘在導電膠帶上，置于蒸金室中，進行蒸鍍導電層處理。制作好試樣后，用導電膠固定試樣在載物臺上，抽真空，調整試樣的距離和最佳倍數，選擇不同的倍數，觀察。

7）熱重分析及差熱分析：采用非等溫動態(tài)熱重法，設定升溫范圍為30 ℃～650 ℃，升溫速率為10 ℃/min，測定質量隨溫度的變化情況。差熱分析試驗設定的升溫范圍為 30 ℃～650 ℃，升溫速率為 10 ℃/min，記錄樣品和參比物間的溫度差隨著溫度變化的情況。

8）傅里葉紅外光譜分析：光譜分辨率為4 cm-1，掃描次數為 4 次，掃描范圍為 4 000 cm-1～400 cm-1，試樣為KBr 壓片。

2 結果與分析

2.1 酸性電解水對蝦殼的脫礦物質的作用

2.1.1 酸性電解水批次處理對蝦殼的脫礦物質作用

將不同目數的蝦殼粉按0.1 g/mL 的比例加入到AEW 中進行處理。測定AEW 的起始pH 值和反應之后的pH 值，并測定樣品雜質脫除率及其灰分含量，結果見表1。

表1 AEW 批次處理蝦殼的脫礦物質效果Table 1 The efficacy of demineralization of shrimp shell by AEW batch treatment

由表1可見，不同粒徑大小的蝦殼粉經過AEW批次處理后，溶液的pH 值均由最初的2.34 上升到8.20 左右，樣品的灰分含量保持在55%左右，表明AEW 批次處理時所能提供的H+非常有限，不能有效實現(xiàn)脫除礦物質作用。

2.1.2 酸性電解水連續(xù)處理對蝦殼的脫礦物質作用

分別用0.1%和1%的NaCl 溶液制備電解水，在酸性電解槽中加入一定量的蝦殼粉，連續(xù)電解，保持H+的不斷產生。6 h 處理結束后，測定殘渣的質量及其灰分含量。結果表2所示。

表2 AEW 連續(xù)處理蝦殼的脫礦物質效果Table 2 The efficacy of demineralization of shrimp shell by AEW continuous treatment

如表2所示，用1%NaCl 制備的AEW 對蝦殼處理后灰分含量為1.14%，較蝦殼樣品減少了97.80%，雜質脫除率為57.00%，相比之下，用0.1%NaCl 制備的AEW 對蝦殼脫礦物質效果較差。與鹽酸對蝦殼處理后灰分含量0.97%相比，酸性電解水脫礦物質效果良好，鹽酸進一步處理即可徹底脫除礦物質。

2.1.3 酸性電解水連續(xù)處理蝦殼粉脫礦物質方法的節(jié)約鹽酸效果評價

使用AEW 作為預處理與鹽酸結合對蝦殼粉處理，與單獨使用鹽酸處理進行比較，鹽酸的節(jié)約效果如表3所示。

表3 AEW 連續(xù)處理蝦殼脫礦物質方法的鹽酸節(jié)約效果Table 3 The efficacy of hydrochloric acid saving for demineralization of shrimp shell by AEW continuous treatment

由表3可知，處理相同的蝦殼粉20 g，單純使用鹽酸處理，需要消耗1 mol/L HCl 為182 mL。用1%NaCl制備的AEW 連續(xù)處理后，再將殘渣繼續(xù)用1 mol/L HCl 處理，消耗鹽酸量為6.40 mL，與單純用鹽酸處理相比，可以節(jié)省鹽酸使用量96.48%。而經過0.1%NaCl 制備的AEW 連續(xù)處理后，再用鹽酸處理，節(jié)省鹽酸用量60.99%。由此可見，使用AEW 連續(xù)處理蝦殼粉，既可達到單純使用鹽酸脫礦物質的程度，又在很大程度上減少了鹽酸的用量。

2.2 堿性電解水連續(xù)處理對蝦殼的脫蛋白質作用

分別用0.1%和1%的NaCl 溶液制備電解水，在堿性電解槽中加入一定量的蝦殼粉，連續(xù)電解。6 h 處理結束后，測定殘渣的重量和蛋白質含量及其脫除率，結果如表4所示。

表4 BEW 連續(xù)處理蝦殼的脫蛋白效果Table 4 The efficacy of deproteinization of shrimp shell by BEW continuous treatment

由表4可知，經過1%NaCl 制備的BEW 處理后，殘渣的蛋白質含量減少為17.79%，蛋白質脫除率達到66.75%，經1%NaCl 制備的BEW 的脫蛋白效果要高于0.1%NaCl 制備的BEW。同時，雖然用高濃度電解質制備的BEW 脫蛋白效果更好，但是蛋白質并沒有完全脫除，這可能是由于存在于角質層中的礦物質會影響脫蛋白效率。通常在節(jié)肢動物角質層，甲殼素分子被蛋白質包裹形成納米纖維，聚集形成甲殼素蛋白纖維，并聯(lián)形成平面陣列組織，而礦物質則是維持剛性結構，所以，在沒有經過脫礦物質處理時，礦物質的存在可能會影響蛋白質的脫除。

2.3 酸性、堿性電解水聯(lián)合處理蝦殼提取甲殼素研究

2.3.1 酸性、堿性電解水聯(lián)合處理蝦殼提取甲殼素工藝研究

在AEW、BEW 聯(lián)合處理蝦殼提取甲殼素工藝中，研究了AEW 與BEW 的處理順序對提取甲殼素的影響，并與傳統(tǒng)無機酸堿法提取的甲殼素進行了比較，對所獲得的甲殼素的常規(guī)指標進行檢測，結果如表5所示。

表5 AEW 和BEW 聯(lián)合處理蝦殼提取甲殼素的常規(guī)指標Table 5 Standard test results of chitin extracted from shrimp shell by AEW and BEW combining treatment

由表5可知，先用AEW 脫礦物質、后用BEW 脫蛋白連續(xù)工藝處理蝦殼提取甲殼素，其蛋白質脫除率能達到97.99%，灰分含量為0.97%，水分含量為4.82%，接近傳統(tǒng)無機酸堿法提取的甲殼素，符合國家標準GB 29941-2013《食品安全國家標準食品添加劑脫乙酰甲殼素（殼聚糖）》，此時提取率為19.46%。交換AEW 和BEW 的處理順序后，提取的甲殼素粗品的脫礦物質和脫蛋白程度均有所下降。

2.3.2 甲殼素產品的質量評價

對AEW→BEW 連續(xù)處理蝦殼提取的甲殼素進行質量檢測，結果如表6所示。

表6 先AEW 后BEW 連續(xù)處理蝦殼提取的甲殼素的質量評價Table 6 Quality evaluation of chitin extracted from shrimp shell by AEW and BEW combining treatment

由表6可知，先用AEW 后用BEW 連續(xù)處理獲得的甲殼素為白色、粉末狀固體，水分含量與灰分含量均達到食品級甲殼素的國家標準，鉛、砷元素含量符合國家標準。

2.3.3 甲殼素產品的掃描電鏡分析

通過掃描電鏡分別對經過電解水處理和傳統(tǒng)無機酸堿法從蝦殼中提取的甲殼素進行觀察，其表面形態(tài)如圖3所示。

圖3 甲殼素樣品的掃描電鏡圖像（2000×）Fig.3 SEM images（2000×）of chitin

由圖3可見，通過3 種方法提取的甲殼素都呈現(xiàn)疏松多孔的結構。相比于先用BEW 脫蛋白后用AEW脫礦物質提取的甲殼素（圖C），AEW→BEW 處理順序提取的甲殼素疏松程度更大（圖B）。這表明在利用電解水提取甲殼素時，首先進行脫礦物質是必要的。在脫礦物質過程中，AEW 能夠快速溶解蝦殼內部的礦物質，而經過脫礦物質處理后的多孔結構更利于BEW深入到蝦殼內部進行脫蛋白。

2.3.4 甲殼素產品的熱重分析及差熱分析

分別對不同方法提取的甲殼素進行熱重分析和差熱分析，并且與傳統(tǒng)方法提取的甲殼素進行比較，其熱重曲線與差熱曲線如圖4所示。

圖4 甲殼素的熱重分析及差熱分析圖Fig.4 TG and DTA analysis of chitin

如圖4所示，對比A 圖與B 圖，分析TG 曲線可知，通過兩種方法提取的甲殼素從室溫到200 ℃升溫過程中，首先去除物理結合水，當溫度上升到250 ℃左右，甲殼素均出現(xiàn)α-松弛（即玻璃化轉變），高聚物無定形部分從凍結狀態(tài)變?yōu)榻鈨鰻顟B(tài)。隨著溫度的上升，DTA 曲線出現(xiàn)凹型曲線，表明甲殼素發(fā)生吸熱反應，同時產生揮發(fā)性的水和CO2等低分子量的降解產物，因此樣品的質量發(fā)生明顯的下降。由此可見，傳統(tǒng)方法與電解水處理提取的甲殼素隨著溫度的升高，理化性質發(fā)生了相同的變化。

2.3.5 甲殼素產品的傅里葉紅外光譜分析

使用紅外光譜對用電解水處理提取的甲殼素進行分析，并與傳統(tǒng)無機酸堿法提取的甲殼素進行比較，結果如圖5所示。

圖5 甲殼素的紅外光譜圖像Fig.5 IR images of chitin

比較圖5中的兩個紅外圖像，二者都表現(xiàn)出了甲殼素的特征峰。甲殼素的紅外光譜由一系列窄的吸收峰組成，具有典型的結晶多糖譜帶。在3 480 cm-1附近的吸收峰屬于O-H 伸縮振動，3 264 cm-1左右吸收峰是由于 N-H 的伸縮振動造成，2 960 cm-1～2 840 cm-1的吸收峰是屬于C-H 伸縮振動。并且，圖中還表現(xiàn)出三個顯著的酰胺譜帶，1 650 cm-1左右的吸收峰為酰胺Ⅰ譜帶（C=O），1 555 cm-1左右的吸收峰為酰胺Ⅱ譜帶（N-H），而1 310 cm-1左右的吸收峰為酰胺Ⅲ譜帶（CN），1 020 cm-1～1 160 cm-1屬于 C-O 伸縮振動所造成的吸收峰，898 cm-1左右是甲殼素環(huán)伸縮振動的吸收峰。紅外光譜還可以用來區(qū)分甲殼素的不同晶型[23]，α-甲殼素的酰胺Ⅰ譜帶被分裂成為兩個吸收峰，分別位于1 656 cm-1和1 621 cm-1處，而β-甲殼素的酰胺Ⅰ譜帶則是單峰，出現(xiàn)在1 626 cm-1。在酰胺Ⅱ譜帶上，α-甲殼素的吸收峰出現(xiàn)于1 556 cm-1，而β-甲殼素的吸收峰出現(xiàn)于1 560 cm-1。圖5中蝦殼分別經過傳統(tǒng)無機酸堿法和電解水連續(xù)處理提取的甲殼素的紅外光譜圖像均表現(xiàn)出α-甲殼素的特征吸收峰，表明通過兩種方法提取出來的甲殼素均為α-甲殼素，同時也證明電解水法與傳統(tǒng)酸堿法提取的甲殼素在結構上具有一致性。

3 討論

本研究表明，先用AEW 脫礦物質后用BEW 脫蛋白的連續(xù)處理工藝從蝦殼中提取甲殼素，提取率為19.46%，與舒曉紅等采用酸堿交替法提取的甲殼素提取率18.56%比較相近[24]。Mukku Ghorbel-Bel-laaj Olfa等通過響應面法優(yōu)化了綠膿桿菌A2 發(fā)酵條件后，蝦殼的蛋白質與礦物質的脫除率分別是89%和96%[25]。利用鼠李糖乳桿菌與枯草芽孢桿菌兩種菌發(fā)酵從蝦殼中提取甲殼素，蛋白質和礦物質分別脫去85.45%和98.98%[26]。對比本研究結果，電解水處理能夠有效的脫除蝦殼中的蛋白質和礦物質，并且節(jié)約了大量的酸堿用量，同時避免了發(fā)酵法周期長的缺點。熱重分析顯示兩種方法提取的甲殼素均在250 ℃左右出現(xiàn)α-松弛，質量迅速下降，這與Kim SS 等的研究結果相似，Kim SS 表明重量損失意味著α-松弛是由于模量的降低而產生，并且是由熱分解引起[27]。本研究中兩種方法提取的甲殼素的紅外光譜圖像都表現(xiàn)出了甲殼素的特征峰，與Pearson[28]和Tatsuya Setoguchi[29]等所研究的甲殼素紅外光譜基本相似，并且顯示提取物均為α-甲殼素。綜上所述，電解水在利用蝦殼制備甲殼素中具有極大的應用潛力。