閆妍，王瑞，康宏偉，楊穎晗，熊鳳嬌，馬儷珍

（天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

在肉制品加工過程中，通常會(huì)加入一種食品添加劑亞硝酸鹽，亞硝酸鹽的添加可以不僅改善肉制品色澤，增進(jìn)肉制品的風(fēng)味，同時(shí)可以起到一定的抑菌的作用，可以有效抑制肉制品中肉毒梭狀芽孢桿菌的生長，防止肉制品腐敗變質(zhì)從而達(dá)到延長食品保藏期的效果。亞硝酸鹽本身無致癌性，但是亞硝酸鹽可以和胺類物質(zhì)，特別是二級(jí)胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成致癌物N-亞硝胺[1-4]，因此控制食品中的亞硝酸鹽及N-亞硝胺類化合物很有必要。亞硝酸鹽作為食品添加劑，尤其在肉制品加工中起著重要作用，研究者目前還沒有找到能夠完全替代它的食品添加劑，但尋找有效的亞硝酸鹽清除劑以及亞硝化抑制劑早已成為眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)[5-6]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者利用含有黃酮化合物、茶多酚、花色苷、VC等活性成份的天然產(chǎn)物來清除亞硝酸鹽或阻斷亞硝胺的合成，效果明顯[7-15]。本研究選用6種天然產(chǎn)物，葡萄、黃檸檬、青檸檬、石榴、菠蘿、木瓜。研究表明，葡萄中含花青素、原花青素等多種酚類物質(zhì)[16]，檸檬中含多種多酚、黃酮類物質(zhì)、檸檬苦素等多種活性物質(zhì)[17]，石榴中含有豐富的VC等營養(yǎng)成分[18]，菠蘿中含豐富的多糖有較強(qiáng)的抗氧化效果[19]，木瓜中含黃酮等多種活性成分[20]。本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究天然果汁清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的效果，優(yōu)選出效果最佳的復(fù)配比例，并最終確定天然果汁用量及復(fù)配方式，為尋求有效的亞硝酸鹽的清除劑和亞硝胺合成的阻斷劑提供理論依據(jù)。目前，有關(guān)這方面的研究，國內(nèi)尚未有報(bào)道。由于肉制品安全問題被越來越多的國家所重視，本研究對(duì)于控制食品中N-亞硝胺類化合物及提高食品安全性方面有著實(shí)際意義[21-24]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

葡萄、黃檸檬、青檸檬、石榴、菠蘿、木瓜：市購。

1.1.2 試劑

檸檬酸鈉、濃鹽酸、亞硝酸鈉、二甲胺鹽酸鹽、碳酸鈉、1-萘胺、無水對(duì)氨基苯磺酸（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6-1650E紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋：上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Z36HK高速冷凍離心機(jī)：賀默（上海）儀器科技有限公司；A11艾卡分析用研磨機(jī)：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；NuAire NU-543二級(jí)A2型生物安全柜（II級(jí)A2）：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新鮮果汁的制備

參考宋爽等[25]的研究結(jié)果，用直接榨汁法提取的果蔬汁液對(duì)亞硝酸根的清除效果優(yōu)于超聲法和水浴法。因此選用直接榨汁法制取新鮮果汁：新鮮水果挑選→去除果皮和籽→切成小塊→清洗→榨汁機(jī)榨汁→離心→取上清液作為提取液→4℃冷藏備用。

1.3.2 天然產(chǎn)物提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除作用[26]

1.3.2.1 亞硝酸鹽清除率的測定原理

當(dāng)加入提取液時(shí)，提取液與亞硝酸鈉作用將部分亞硝酸鈉消耗掉，剩余亞硝酸根在酸性條件下，可以是對(duì)氨基苯磺酸重氮化，再使其與1-萘胺偶合生成紅色化合物，用分光光度計(jì)測出該化合物的吸光度值可計(jì)算上述反應(yīng)液中亞硝胺含量。

1.3.2.2 操作步驟

取10 mL離心管，加入0.1 mL提取液，5 mL，0.5 mol/L的pH值為3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液，再加入0.5 mL，1 mmol/L的亞硝酸鈉，將反應(yīng)體系用緩沖液定容到10 mL，在37℃條件下保溫反應(yīng)30 min，取1 mL于5 mL試管中加入1%對(duì)氨基苯磺酸和0.1%的1-萘胺各1.5 mL，定容至5 mL，放置15 min顯色后在波長525 nm比色測定其吸光度。

1.3.2.3 單因素亞硝酸鹽清除率的測定

用已得到的葡萄、黃檸檬、青檸檬、石榴、菠蘿、木瓜6種天然產(chǎn)物提取液進(jìn)行不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取液對(duì)亞硝酸鹽清除率的測定。加入各提取液的添加量分別0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%時(shí)，按上述操作步驟進(jìn)行測定，并計(jì)算各個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下提取液的阻斷率，進(jìn)行分析。

1.3.3 清除亞硝酸鹽正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇黃檸檬、菠蘿、木瓜3種天然產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)配，得到9組不同提取液濃度組合的復(fù)配試驗(yàn)組。具體正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Coded and actual levels of three antioxidants for orthogonal array design

1.3.4 天然產(chǎn)物提取液對(duì)亞硝胺的阻斷作用

1.3.4.1 亞硝胺阻斷率的測定原理

參照郭艷華等[27]的測定原理進(jìn)行測定。

1.3.4.2 操作步驟

參照馬儷珍等的方法略有修改[28]。取10 mL離心管，加入0.5 mol/L，pH3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液5 mL，加入1 mmol/L的二甲胺鹽酸鹽0.5 mL，然后將反應(yīng)體系用緩沖液定容到10 mL，于37℃保溫反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，取1 mL經(jīng)反應(yīng)的溶液置于5 mL的試管中，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的碳酸鈉溶液，于15 W紫外燈照射15 min，紫外燈距離液面45 cm。取出后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的對(duì)氨基苯磺酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的1-萘胺各1.5 mL，加入蒸餾水使溶液體積精確為5 mL。放置15 min顯色后在波長525 nm比色測定其吸光度。

1.3.4.3 單因素亞硝胺阻斷率的測定

在清除亞硝酸鹽試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，用上述試驗(yàn)選出的黃檸檬、菠蘿、木瓜3種天然產(chǎn)物進(jìn)行不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取液對(duì)亞硝胺合成阻斷率的測定。加入各提取液的添加量分別 0、1%、5%、10%、20%、30%時(shí)，按上述操作步驟進(jìn)行測定，并計(jì)算各個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下提取液的阻斷率，進(jìn)行分析。

1.3.4.4 阻斷亞硝胺正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用黃檸檬、菠蘿、木瓜3種天然產(chǎn)物最佳復(fù)配比正交試驗(yàn)，得到9組不同提取液濃度組合的復(fù)配試驗(yàn)組。具體正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Coded and actual levels of three antioxidants for orthogonal array design

1.4 計(jì)算

1.4.1 亞硝酸鹽清除率的計(jì)算方法

式中：A1為蒸餾水代替天然產(chǎn)物提取液的空白對(duì)照組吸光度；A2為加入提取液按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟測得的吸光度。

1.4.2 亞硝胺阻斷率的計(jì)算方法

式中：A0為蒸餾水代替天然產(chǎn)物提取液的空白對(duì)照組吸光度；AX為加入提取液按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟測得的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素亞硝酸鹽清除率的測定

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的各種天然產(chǎn)物提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率如圖1所示。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取液的亞硝酸鹽清除率Fig.1 Different concentrations of the extract for the eliminating of nitrite

由圖1可見，菠蘿提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0%～1%范圍內(nèi)變化時(shí)，對(duì)N-亞硝胺的阻斷率范圍為0%～52.1%，且當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1%時(shí)，阻斷率最高達(dá)到了52.1%。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高時(shí)，阻斷作用有趨于平緩逐漸減小的趨勢。同樣，黃檸檬、木瓜、青檸檬、石榴、葡萄提取液均在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)達(dá)到最佳阻斷效果。同時(shí)由圖1可以看出，菠蘿清除亞硝酸鹽的效果最明顯，其次是黃檸檬和木瓜。這3種天然產(chǎn)物提取液對(duì)亞硝酸鹽清除率始終高于青檸檬、石榴和葡萄，由此根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選出菠蘿、黃檸檬、木瓜這3種清除亞硝酸鹽效果較強(qiáng)的天然提取物，且根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，清除亞硝酸鹽最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

2.2 亞硝酸鹽清除作用最佳復(fù)配比的選擇

按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表1，最佳復(fù)配比正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 最佳復(fù)配比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The design and the results of the orthogonal experiment

續(xù)表3 最佳復(fù)配比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 The design and the results of the orthogonal experiment

從9個(gè)處理中直觀地找出最優(yōu)水平組合為5號(hào)處理，即A2B2C1，試驗(yàn)指標(biāo)值為79.5%；通過正交試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，得出最優(yōu)水平組合為A2B2C1，與選出的5號(hào)處理結(jié)果吻合。經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)檢驗(yàn)得出，最優(yōu)水平組合為A2B2C1，即黃檸檬提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，菠蘿提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，木瓜提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，混合果汁對(duì)亞硝酸鹽清除效果最好，清除率為79.5%，比單因素試驗(yàn)中最高清除率52.1%（菠蘿）明顯提高，天然產(chǎn)物提取液復(fù)配得到的果汁對(duì)亞硝酸鹽清除效果最理想。

2.3 單因素亞硝胺合成阻斷率

各提取液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別0、1%、5%、10%、20%、30%時(shí)對(duì)亞硝胺合成的阻斷率見圖2。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取液的亞硝胺阻斷率Fig.2 Different concentrations of the extract for the Blocking rate of Nitrosamine

由圖2可知，黃檸檬提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～10%范圍內(nèi)變化時(shí)，N-亞硝胺阻斷率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加有上升的趨勢，且當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至10%，N-亞硝胺的阻斷率最高為46.8%。但當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過10%時(shí)，N-亞硝胺的阻斷率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加有緩慢下降的趨勢。且菠蘿、木瓜提取液對(duì)N-亞硝胺的阻斷率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)對(duì)N-亞硝胺的阻斷效果最佳，阻斷率分別為48.1%和30.7%，因此根據(jù)單因素試驗(yàn)可以得出，提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)阻斷N-亞硝胺效果最強(qiáng)。

2.4 亞硝胺阻斷作用最佳復(fù)配比的選擇

按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表2，最佳復(fù)配正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 最佳復(fù)配比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The design and the results of the orthogonal experiment

從9個(gè)處理中直觀地找出最優(yōu)水平組合為4號(hào)處理，即A2B1C2，試驗(yàn)指標(biāo)值為49.1%，通過正交試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，得出最優(yōu)水平組合為A3B1C2，經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)檢驗(yàn)得出，最優(yōu)水平組合為A3B1C2，即黃檸檬提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，菠蘿提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，木瓜提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，對(duì)亞硝胺阻斷效果最好，阻斷率為51.1%，比單因素試驗(yàn)中最高清除率48.1%（菠蘿）略有提高，天然產(chǎn)物提取液復(fù)配得到的混合果汁對(duì)亞硝胺有較為理想的阻斷效果。

3 結(jié)論

通過清除亞硝酸鹽的最佳復(fù)配比正交試驗(yàn)，得到的最優(yōu)復(fù)配組合為1.0%黃檸檬提取液、1.0%菠蘿提取液、0.8%木瓜提取液混合，清除率為79.5%，天然產(chǎn)物提取液復(fù)配得到的果茶汁對(duì)亞硝酸鹽具有理想的清除效果；而通過阻斷亞硝胺合成的正交試驗(yàn)，得到的最優(yōu)復(fù)配組合為12%黃檸檬提取液、8%菠蘿提取液、10%木瓜提取液混合，阻斷率為51.1%，有較好的阻斷亞硝胺合成效果。復(fù)配天然產(chǎn)物應(yīng)用到肉類產(chǎn)品的生產(chǎn)中不僅能起到清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的效果，還能增加產(chǎn)品的營養(yǎng)和風(fēng)味[29]。這為開發(fā)更加安全美味的肉類食品的開發(fā)提供了參考。