孫士健，王麗娟，秦酈，畢付提，王德培，3，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.天津科技大學生物工程學院，天津300457；3.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457）

檸檬酸（citric acid）又名枸櫞酸，學名2-羥基丙烷-1，2，3-三羧酸，白色晶體，含一分子結晶水，無臭，具有令人愉快的強烈的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑[1]。自1945年美國Miles公司借鑒深層發(fā)酵青霉素工廠，采用無菌空氣供給系統(tǒng)和機械攪拌通風發(fā)酵罐的成功經驗基礎上，首先成功開發(fā)了深層發(fā)酵法工業(yè)化生產檸檬酸[2]。檸檬酸已成為全球產量和需求量最大的有機酸品種。世界檸檬酸工業(yè)的集約化程度非常高，除中國外，全球主要的檸檬酸制造商只有5家～6家[3]（美國、奧地利、加拿大、巴西等），而中國的產量為最大，2017年，全球檸檬酸及其鹽產量達到212萬噸，我國產量達到152萬噸，占全球近70%，是檸檬酸主要生產國和出口國。

國內外檸檬酸工業(yè)化生產主要采用液體深層發(fā)酵法、表面發(fā)酵法及固體發(fā)酵法。上世紀90年代至今，我國利用玉米發(fā)酵檸檬酸，將玉米粉調漿，高溫液化加入高溫淀粉酶，快速過濾去除部分玉米渣后進行發(fā)酵，使檸檬酸發(fā)酵過程溶氧好、產酸快、發(fā)酵周期短，單罐產酸提高到16%，發(fā)酵指數在2.4 kg/（m3·h）～2.8 kg/（m3·h）之間。決定檸檬酸產能優(yōu)勢的兩個關鍵技術是高產檸檬酸菌株和發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

自從上世紀初開始用微生物生產檸檬酸以來，人們對生產檸檬酸的菌種進行持續(xù)不斷的誘變研究。我國在檸檬酸生產菌黑曲霉的育種方面積累了豐富的經驗，20世紀50年代末和60年代初，金其榮等進行了檸檬酸發(fā)酵的菌種研究，從土壤中經酸性平板分離獲得的野生黑曲霉628作為出發(fā)菌株，經多次γ射線（Co60）和硫酸二乙脂等復合誘變，獲得了高產檸檬酸菌株Co827，可直接利用薯干粉發(fā)酵，產酸達12%～13%，平均轉化率為95%，發(fā)酵周期54 h～64 h，發(fā)酵指數1.8 kg/（m3·h）～2.0kg/（m3·h）[4]。無錫工業(yè)大學以黑曲霉H-142為出發(fā)菌株，通過γ射線、硫酸二乙脂、高溫單獨或復合誘變處理，通過高溫、高酸及高滲培養(yǎng)條件的定向篩選獲得HQL-601菌種，發(fā)酵溫度為40℃～41℃，周期60 h～64 h，20%薯干粉搖瓶產酸13%，其檸檬酸純度明顯優(yōu)于出發(fā)酵菌[5]。復合誘變的方法比用單一的物理方法或化學方法更為有效[6]。黑曲霉育種較為有效的誘變因子有：γ-射線、x-射線、紫外線、激光、亞硝基胍（nitroso-guanidin，NTG）、亞硝基脲、乙基胺等，此外還有高能電子流、電磁場等[7]。

本文以江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司天津分公司保藏的菌種zs-10為出發(fā)株，經過γ射線（Co60）及亞硝基胍復合誘變，得到一株高產檸檬酸且遺傳穩(wěn)定性高的誘變菌株。通過對該菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化，提高了檸檬酸產量，縮短了發(fā)酵周期。試驗結果在50 L發(fā)酵罐中試試驗中得到驗證。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）zs-10：江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司天津分公司保藏。

1.2 試劑

無水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、大豆蛋白胨：分析純，天津市北方天醫(yī)試劑公司；（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、KCl、FeSO4：分析純，天津市四通化工廠；玉米漿（試劑級）：金豐玉米有限公司；糖化酶（100 000 U/mL）：上海源葉生物科技有限公司；耐高溫的α-淀粉酶（20 000 U/mL）：諾和諾德（中國）生物技術有限公司；玉米蛋白粉、麩皮粉、豆餅粉：鄢陵勝源豆業(yè)有限公司。

1.3 儀器與設備

LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；CX23型光學顯微鏡：OLYMPUS公司；HZQ-QX恒溫振蕩器：中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；FA2004N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；50 L發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯削皮切塊，稱取200 g，加入適量蒸餾水煮沸30 min，4層紗布過濾除渣，取清液加蒸餾水定容至1L，加入2%葡萄糖充分溶解，加入瓊脂粉20 g，121℃，20 min滅菌。制成斜面或平板備用。

篩選培養(yǎng)基（g/L）[8]：馬鈴薯的煮汁 200 mL，K2HPO43.6 g，MgSO4·7H2O1.5 g，葡萄糖60 g，瓊脂20 g，溴甲酚綠0.05 g；121℃滅菌20 min；制成平板備用。

種子液培養(yǎng)基：4.8 g玉米粉，40 mL水，2滴耐高溫的α-淀粉酶加入250 mL三角瓶中，121℃滅菌0.5 h，冷卻后備用。

玉米液化液的制備：玉米粉與水以質量比1∶4的比例混合，攪拌均勻后加熱到70℃，加入耐高溫α-淀粉酶（0.5 kg/t），保溫10 min后加熱到90℃保溫4 h～5 h，趁熱經兩層紗布過濾得糖化清液。過濾清液冷卻后加水調整總糖到要求的濃度[9]。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：18%濃度玉米粉液化液，每250 mL三角瓶裝量35 mL液化液，1.93 g玉米粉末，1滴耐高溫的α-淀粉酶，121℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.5 誘變方法

1.5.1 孢子懸浮液的制備

用10 mL無菌水洗脫新鮮斜面孢子，置于預先滅菌的帶玻璃珠的20 mL無菌水中，于旋轉式搖床上180 r/min振蕩40 min至鏡檢為分散的單孢子，用兩層無菌濾紙加一層滅菌的脫脂棉過濾，得到單孢子懸液，將孢子懸液離心稀釋，用血球計數板對單孢子懸液進行鏡檢計數，調節(jié)孢子濃度約為106個/mL[10-11]。

1.5.2 γ射線（Co60）-亞硝基胍復合誘變

取106孢子/毫升Co60照射（劑量為1 400 Gy）輻照不同時間后的孢子懸浮液與亞硝基胍誘變劑混合不同時間，誘變后均與涂布于篩選平板，35℃恒溫培養(yǎng)60 h后進行初篩。

1.6 篩選方法

1.6.1 誘變菌株的初篩

從經過γ射線（Co60）-亞硝基胍復合誘變高濃度孢子液中取0.1 mL稀釋涂布于初篩平板中，以黑曲霉未經離子注入的存活率為100%，將制好的平板與35℃培養(yǎng)36 h后開始觀察，每6 h觀察1次，至產酸為止，統(tǒng)計致死率、突變率及正負突變率，挑取高產菌落于斜面上傳代培養(yǎng)。

致死率/%=（處理前菌落數-處理后菌落數）/處理前菌落數×100

突變率/%=突變菌落數/處理后菌落數×100

正突變率/%=發(fā)生正突變菌落數/處理后菌落數×100

負突變率/%=發(fā)生負突變菌落數/處理后菌落數×100

式中：突變菌落數為黃色透明圈直徑與對照樣相比出現(xiàn)差異的菌落數；發(fā)生正突變的菌落數為黃色透明圈直徑比對照樣大的菌落數；發(fā)生負突變的菌落數為黃色透明圈直徑比對照樣小的菌落數[12-13]。

1.6.2 誘變菌株的復篩

從初篩得到的斜面菌株上挑取適量的黑曲霉孢子于總糖為18%的玉米發(fā)酵液中，500 mL三角瓶中裝入50 mL培養(yǎng)液，搖床轉速350 r/min，36℃振蕩培養(yǎng)72 h。測定發(fā)酵液總酸。

1.7 檸檬酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.7.1 種子液的培養(yǎng)條件

1.7.1.1 種子培養(yǎng)氮源種類優(yōu)化

氮源分別為玉米蛋白粉、麩皮粉、豆餅粉，分別稱取一定量溶于50 mL水中，2滴液化酶，121℃滅菌30 min，冷卻后接入1環(huán)黑曲霉孢子于250 mL三角瓶中，搖床200 r/min，35℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定種子液中18 h pH值并觀察菌球形態(tài)。

1.7.1.2 種子培養(yǎng)總糖源濃度優(yōu)化

在氮源一定的情況下，將種子液總糖濃度分別調至3%、6%、10%、15%、20%，50mL種子培養(yǎng)液，121℃滅菌30 min，冷卻后接入1環(huán)黑曲霉孢子于250 mL三角瓶中，搖床200 r/min，35℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定種子液中菌球數量。

1.7.2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

1.7.2.1 溫度對黑曲霉發(fā)酵產酸的影響

采用搖瓶培養(yǎng)基，無菌接入一環(huán)孢子，分別在溫度為 26、29、32、35、38 ℃條件下進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉速為350 r/min，發(fā)酵72 h后測定不同溫度條件下的發(fā)酵液中總酸的含量，確定黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的最適溫度。

1.7.2.2 初始pH值對黑曲霉發(fā)酵產酸的影響

調整搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別為2.5、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 后滅菌。無菌環(huán)境下接入一環(huán)黑曲霉孢子，在35℃發(fā)酵72 h后測定不同初始pH值條件下檸檬酸的生成量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適初始pH值。

1.7.2.3 氮源種類對黑曲霉發(fā)酵產酸的影響

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同種類的蛋白質含量為0.6%的氮源后滅菌，氮源分別為蛋白胨、玉米漿、豆餅粉、硫酸銨、尿素、氯化銨、硝酸銨，在35℃發(fā)酵72 h后測定在不同的氮源條件下發(fā)酵液中總酸的含量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適氮源。

1.7.2.4 氮源含量對黑曲霉發(fā)酵產酸的影響

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同含量的最適氮源后滅菌，氮源加量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，35℃發(fā)酵72 h后測定在最適氮源的不同含氮量下發(fā)酵液中檸檬酸的含量，確定檸檬酸發(fā)酵的最適氮源的用量。

1.8 50L發(fā)酵罐中試試驗

將7.84 kg玉米粉與水混合至28 L，加入液化酶進行液化，液化后過濾后取清液21 L，再加入30%濃度玉米液化混液4.5 L作為氮源，采用二級接種，10%接種量，發(fā)酵溫度35℃，罐壓0.08 MPa，通氣量0.12 V/V·M～0.15 V/V·M （V/V·M 表示通風比），轉速350 r/min。

1.9 分析方法

1.9.1 還原糖和總糖的測定

采用菲林法測定。

1.9.2 發(fā)酵液中總酸的測定

取1 mL發(fā)酵過濾液于250 mL錐形瓶中，再加入約100 mL蒸餾水，加入2滴0.1%酚酞指示劑，用0.142 9 mol/L的NaOH溶液滴定至變紅為止，記錄所消耗NaOH溶液的體積V[14]。

式中：V為滴定時消耗NaOH的體積，mL；0.142 9為滴定系數。

1.10 數據處理方法

Excel 2007數據統(tǒng)計處理，SPSS17.0軟件進行單因子方差分析

2 結果與討論

2.1 Co60與亞硝基胍復合誘變黑曲霉

2.1.1 γ 射線（Co60）誘變

由于此前黑曲霉zs-10是經過γ射線（Co60）誘變后篩選得到的菌株，因此采用高劑量γ射線（Co60）進行孢子懸浮液誘變，選用γ射線（Co60）處理的劑量分別為 1000、1200、1400 Gy，其致死率與正突變率見表 1。

表1 不同劑量下Co60誘變黑曲霉的致死率及正突變率Table1 Death rate and positive rate of Co60mutagenesis Aspergillus niger at different doses

由表1可以看出，Co60誘變的致死率和菌種正變率都隨著處理時間的增加而升高，在處理劑量為1 400 Gy時，正變率達到30.6%。所以選取誘變劑量為1 400 Gy。

2.1.2 亞硝基胍誘變黑曲霉

NTG誘變孢子存活率與時間的關系見圖1。

圖1 NTG誘變孢子存活率與時間的關系Fig.1 Relation between the survival rate of NTG mutagenesis spores and time

由圖1可以看出，隨著NTG誘變時間的延長，菌株存活率在下降。當誘變時間為4 min時存活率為25%，致死率在75%左右。因此當用濃度為1 mg/mL的NTG做誘變劑時，誘變時間為4 min。

2.1.3 Co60與亞硝基胍復合誘變

通過Co60和亞硝基胍單獨誘變確定最適的誘變劑量，進行Co60與亞硝基胍復合誘變黑曲霉孢子。通過挑選圏徑比大的菌株進行初篩，初篩后得到30株然后進行第一輪復篩結果見表2，將第一輪復篩產酸高于15.2 g/dL菌株進行第二輪復篩見表3。

表2 誘變黑曲霉孢子復篩結果Table 2 Results of mutagenic Aspergillus niger spore screening

表3 誘變黑曲霉孢子二次復篩結果Table 3 Secondary screening results of mutagenic Aspergillus niger spores

通過表2和表3可以看出，經過二次復篩得到平均產酸為15.5 g/dL的菌株zs-10-5，接下對其遺傳穩(wěn)定性進行考察。黑曲霉zs-10-5的傳代培養(yǎng)情況見表4。

表4 黑曲霉zs-10-5的傳代培養(yǎng)情況Table 4 Subculture of Aspergillus niger zs-10-5

從表4可以看出，經過10次傳代培養(yǎng)后，黑曲霉zs-10-5仍保留了較高產酸能力，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。經過初篩、復篩和傳代培養(yǎng)，獲得產酸有較大提高且遺傳性狀穩(wěn)定的突變株zs-10-5。

2.2 種子液的培養(yǎng)條件

2.2.1 氮源對種子的影響

種子搖瓶中添加不同的氮源對種子發(fā)酵液的pH值，菌球的形成時間及菌球的形態(tài)產生了不同的影響結果見表5。

表5 氮源對種子的影響Table 5 Influence of nitrogen source on seed

由表5可以看出，添加豆餅粉的種子液菌種生長較快，在同樣時間下pH值下降幅度大，因此，在使用豆餅粉的工藝中，可以縮短種子的培養(yǎng)時間3 h～4 h，而且菌球形態(tài)有利于發(fā)酵。

2.2.2 碳源濃度對種子的影響

種子液的初糖濃度的高低直接影響黑曲霉菌體的生長與發(fā)育，影響產酸效率。從黑曲霉發(fā)酵檸檬酸的過程分析，如果種子液初糖濃度過高，會對孢子的生長發(fā)育有抑制作用。同時過高的糖濃度還會使發(fā)酵培養(yǎng)基濃度過高，嚴重影響發(fā)酵液溶氧。由于種子生長初期，孢子發(fā)育耗氧量非常大，所以種子液初期糖濃度過高會嚴重影響菌絲球成型。但是，如果種子液初總糖過低，則菌絲球會長的很大，且形狀不規(guī)則，生長不正常。以下是不同糖濃度下，菌球生長情況。糖濃度與菌球數的關系見圖2。

由圖2可以看出在一定范圍內隨著糖濃度的升高菌球數也隨之增加，當糖濃度為10%時，菌球數達到最大值。糖濃度超過10%時，菌球數隨之下降，說明糖濃度過大會抑制孢子的萌發(fā)和菌球的形成。

圖2 糖濃度與菌球數的關系Fig.2 Relationship between sugar concentration and mycosphere number

2.3 黑曲霉檸檬酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 溫度對黑曲霉發(fā)酵產酸的影響

溫度是影響黑曲霉發(fā)酵過程的一個重要因素。溫度過低，細胞內控制酶合成的關鍵酶的活性受到抑制，合成檸檬酸的生物反應趨向停滯狀態(tài)，溫度偏高，可能會造成微生物細胞中關鍵酶的不可逆失活，是微生物代謝減慢。在不同的溫度下，黑曲霉發(fā)酵72 h后檸檬酸的生成情況見圖3。

圖3 不同溫度對黑曲霉產酸的影響Fig.3 Effects of different temperatures on acid production by Aspergillus niger

從圖3可以看出，黑曲霉進行檸檬酸發(fā)酵時，在26℃～35℃范圍內，隨著溫度的升高，發(fā)酵液中檸檬酸的含量逐漸升高，當溫度大于35℃時，發(fā)酵液中檸檬酸的含量明顯降低，因此黑曲霉發(fā)酵產生檸檬酸的最適溫度為35℃。

2.3.2 初始pH值對黑曲霉發(fā)酵產酸的影響

實驗室內的搖床三角瓶發(fā)酵，調節(jié)合適的發(fā)酵初始pH值十分重要。特別是像檸檬酸發(fā)酵這種以淀粉作為發(fā)酵原料的發(fā)酵，發(fā)酵液初始pH值的高低會直接影響到菌體糖化酶的活力，由于檸檬酸發(fā)酵是以玉米粉為原料的發(fā)酵過程，屬于邊糖化邊生長邊產酸的過程。初始pH值過低，會直接導致糖化酶活性低，淀粉不能完全水解，反之如果發(fā)酵液初始pH值較高，會使發(fā)酵過程中草酸和葡萄糖酸大量積累，使發(fā)酵液中雜酸含量過高。不同發(fā)酵液初始pH值對檸檬酸發(fā)酵產量的影響見圖4。

圖4 不同pH值對黑曲霉的產酸影響Fig.4 Effects of different pH on acid production by Aspergillus niger

如圖4所示，黑曲霉在進行檸檬酸發(fā)酵時，只有發(fā)酵液初始pH值為5～6時，產酸最高。究其原因主要是，糖化酶的活性最高pH值為4.0～4.6，如果起始pH值低于糖化酶的作用最適范圍，會使得發(fā)酵原料得不到充分利用，進而影響最終產酸率。反之如果發(fā)酵液初始pH值過高，則黑曲霉菌絲球會出現(xiàn)老化現(xiàn)象，提前進入衰老期。所以，發(fā)酵液初始最適pH值為5～6。

2.3.3 氮源種類對黑曲霉發(fā)酵產酸的影響

菌體利用發(fā)酵液中的氮源是為了合成自身生長發(fā)育所需要的各種蛋白質、核酸和各種氨基酸。在菌體的生長過程中，不同菌體利用各種有機氮或無機氮的種類是不同的。但是黑曲霉的生長過程比較粗放，可以利用各種有機或無機氮源作為其自身氮源。檸檬酸產酸與氮源種類的關系見圖5。

結果如圖5所示，以豆餅粉為氮源時菌株的產酸能力高于其它氮源。

圖5 檸檬酸產酸與氮源種類的關系Fig.5 Relation between citric acid production and nitrogen source species

2.3.4 氮源含量對黑曲霉發(fā)酵產酸的影響

檸檬酸產酸與氮源含量的關系見圖6。

圖6 檸檬酸產酸與氮源含量的關系Fig.6 Relation between acid production and nitrogen source content

從圖6可以看出，黑曲霉進行檸檬酸發(fā)酵時，當氮源的用量為0.8%時，檸檬酸的產量最高。因此，在以豆餅粉為氮源的條件下，黑曲霉利用進行發(fā)酵產生檸檬酸的最適氮源含量為0.8%。

2.4 50 L發(fā)酵罐中試試驗

50 L中試試驗結果見表6。

表6 50L中試試驗結果Table 6 50L pilot test results

由表6可以看出，通過優(yōu)化檸檬酸發(fā)酵工藝，中試罐發(fā)酵產酸17.94%，周期63 h、發(fā)酵指數2.85 kg/（m3·h）及轉化率99.7%都達到較好的發(fā)酵水平。

3 結論

以菌種zs-10為出發(fā)株，經過γ射線（Co60）及亞硝基胍復合誘變，得到一株高產檸檬酸且遺傳穩(wěn)定性高的誘變菌株zs-10-5。通過對種子培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)種子以豆餅粉為氮源，初總糖濃度10%培養(yǎng)24 h左右形成菌絲球性能最好。發(fā)酵最適溫度35℃，初始發(fā)酵在pH5～6，以豆餅粉為氮源為0.8%，通過50 L發(fā)酵罐進行了驗證，其發(fā)酵結果為周期63 h，產酸17.94 g/100 mL，發(fā)酵指數為2.85 kg/（m3·h），轉化率為99.7%。比出發(fā)菌株發(fā)酵周期縮短3 h，產酸提高10%，轉化率提高5%。