焦媛，車奇濤，薛淑娟，陳隨清

（河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450046）

山茱萸是《中國(guó)藥典》收載的常用中藥，也是藥食兼用的中藥材，為山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉。山茱萸性微溫，味酸、澀，具有補(bǔ)益肝腎，收澀固脫的功效，用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴[1]。山茱萸藥用歷史悠久，是六味地黃丸、十全大補(bǔ)丸等名方的組成之一。近年來，隨著社會(huì)的進(jìn)步和人民生活水平的提高，人們對(duì)健康疾病不再滿足于被動(dòng)治療，而是更加注重主動(dòng)保健預(yù)防[2]，因此以山茱萸為原料的綠色無(wú)污染，無(wú)毒副作用的保健食品，越來越被人們所認(rèn)可和喜愛。

現(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸含有多種山茱萸苷，為山茱萸的主要藥效成分，此外還含熊果酸、馬錢素、β-谷甾醇等，這些成分具有補(bǔ)血健胃，抗菌，提高免疫能力，消除疲勞，延緩衰老，降血壓等藥理作用[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)中藥的藥理作用不僅與化學(xué)成分息息相關(guān)，與藥材中所含的無(wú)機(jī)元素也有著密切的關(guān)系[4]。藥材中的無(wú)機(jī)元素不僅影響植物生理代謝活動(dòng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，而且參與和調(diào)節(jié)體內(nèi)必需的元素，與其藥用有機(jī)成分形成配合物，產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)其療效[5]。目前對(duì)山茱萸的研究多集中在化學(xué)成分、藥理活性研究及藥材的質(zhì)量分析評(píng)價(jià)方面，對(duì)其無(wú)機(jī)元素研究鮮有報(bào)道。本研究采用電感耦合等離子質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS） 對(duì)不同產(chǎn)地山茱萸中22種無(wú)機(jī)元素含量進(jìn)行測(cè)定，比較不同產(chǎn)地山茱萸無(wú)機(jī)元素含量差異，為中藥山茱萸的質(zhì)量評(píng)價(jià)及開發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

iCAP Qc電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；EHD-40趕酸儀和MARS 6微波消解儀：美國(guó)培安公司；BSA124S-CW萬(wàn)分之一天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Milli-Q Academic A10超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司。

1.2 試劑

硝酸（MOS）：山東西亞化學(xué)股份有限公司；過氧化氫（優(yōu)級(jí)純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；Na、Mg、Al、P、K、Ca、Fe混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（GNM-M082201-2013）、Zn（GSB 04-1761-2004）、Pb（GSB 04-1742-2004）、Cd（GSB 04-1721-2004）、Cr（GSB 04-1723-2004）、As（GSB 04-1714-2004）、Cu （GSB 04-1725-2004）、Li（GSB 04-1734-2004）、Ti（GSB 04-1757-2004）、Mn（GSB 04-1736-2004）、Co （GSB 04-1722-2004）、Ni（GSB 04-1740-2004）、Se （GSB 04-1751-2004）、Sr（GSB 04-1754-2004）、Ba （GSB 04-1717-2004）、Hg（GSB 04-1729-2004）、Rh （GSB 04-1746-2004）、Sc（GSB 04-1750-2004）、In （GSB 04-1731-2004）、Ge（GSB 04-1728-2004）、Bi（GSB 04-1719-2004）：國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為100 μg/mL，單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液均為1 000 μg/mL；雙蒸水：由河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室（BM629）自制。

1.3 藥材

本次試驗(yàn)樣品采于河南西峽、欒川、南召、浙江臨安、陜西佛坪5個(gè)不同產(chǎn)地，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。共23批樣品，樣品信息見表1。

表1 山茱萸樣品采集信息Table 1 Sample collection information

續(xù)表1 山茱萸樣品采集信息Continue table 1 Sample collection information

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

第一組標(biāo)準(zhǔn)溶液：Na、Mg、Al、P、K、Ca、Fe、Zn 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置（重量法），取 Na、Mg、Al、P、K、Ca、Fe混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL和單元素Zn標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于100 mL塑料瓶中，用2%硝酸定容至10 g，混勻，即得濃度為10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用2%硝酸依次稀釋為 500、200、100、50、20、10 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列。

第 二 組 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 ：Pb、Cd、Cr、As、Cu、Li、Ti、Mn、Co、Ni、Se、Sr、Ba混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置（重量法），取各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL于100 mL塑料瓶中，用2%硝酸定容至100 g，混勻，即得濃度為100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用 2%硝酸依次稀釋為 100、50、25、10、5、1 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列。

第三組標(biāo)準(zhǔn)溶液：Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置（重量法），取單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液Au 1mL和Hg 5 μL于100 mL容量瓶中，用2%硝酸定容至100 g，混勻，即得濃度為50 μg/L的Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用2%硝酸依次稀釋為2、1、0.5、0.1、0.05 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列。

內(nèi)標(biāo)溶液：Rh、Sc、In、Ge、Bi混合內(nèi)標(biāo)溶液的配置（重量法）：取各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL于100 mL塑料瓶中，用2%硝酸定容至100 g，混勻，即得濃度為20 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用2%硝酸稀釋為10 μg/L。

2.2 樣品前處理

將以上山茱萸藥材粉碎，過40目篩，粉末放入真空干燥箱60℃下干燥24 h，取出后放入干燥器內(nèi)備用。

2.3 樣品的制備

供試品溶液的制備：精密稱取干燥恒重的樣品粉末0.3 g，置聚四氟乙烯消解管底部，加入硝酸6 mL和過氧化氫2 mL，蓋好內(nèi)蓋，旋松外蓋，放置過夜。

預(yù)消解：將旋松外蓋的消解管放入趕酸儀中105℃預(yù)消解15 min，放置冷卻至25℃。

微波消解：旋緊外蓋，將消解管放入電熱套中，放置至微波消解儀內(nèi)，按消解程序進(jìn)行消解。消解完畢，將消解管從電熱套中取出，打開蓋子，待黃色煙霧散盡后，將消解液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。同時(shí)同法制備試劑空白溶液。樣品消解程序見表2。

表2 微波消解儀工作條件Table 2 Working parameters of microwave digestion

2.4 ICP-MS儀器工作條件

在進(jìn)行元素含量測(cè)定之前我們優(yōu)化了儀器的測(cè)定條件，測(cè)試時(shí)采用的試驗(yàn)條件是：射頻等離子體（radio frequency plasma，RF）的功率1 550 W，載氣流速0.80 L/min，霧化器流速1.181 8 L/min，冷卻器流速13.94L/min，霧化室溫度2.6℃，分析時(shí)間0.6s，等離子體冷卻水流速0.55 L/min，等離子體排氣壓力0.38 Pa，采樣深度5 mm，測(cè)定次數(shù)為3次，掃描方式：跳峰。

2.5 樣品測(cè)定

在2.4項(xiàng)下儀器參數(shù)條件下依次對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和樣品溶液分別進(jìn)行測(cè)定，由ICP-MS工作站軟件分析數(shù)據(jù)，儀器自動(dòng)繪制出各個(gè)元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出樣品中各對(duì)應(yīng)元素的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 線性關(guān)系

取適量上述配置的梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.4項(xiàng)下儀器的工作參數(shù)條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算線性回歸方程。待測(cè)元素回歸方程及相關(guān)系數(shù)等見表3，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999，說明線性關(guān)系良好。

表3 待測(cè)元素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 3 Regression equations of the tested elements and correlation coefficient determination results

3.1.2 檢出限

在優(yōu)化ICP-MS的試驗(yàn)條件下，測(cè)定8份空白樣品溶液，計(jì)算得到該方法對(duì)樣品中各元素的檢出限，結(jié)果見表3。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份同一供試品各0.3 g，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)得各元素含量，并分別計(jì)算各元素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值，如表3所示，發(fā)現(xiàn)所得到的RSD值均小于10%，符合有關(guān)規(guī)定，說明本方法重復(fù)性良好。

3.1.4 精密度試驗(yàn)

Na、Mg、Al、P、K、Ca、Fe、Zn、Pb、Cd、Cr、As、Cu、Li、Ti、Mn、Co、Ni、Se、Sr、Ba 標(biāo)液選取 50 μg/L 濃度，Hg 單標(biāo)選取2 μg/L濃度，標(biāo)液分別進(jìn)樣6次，測(cè)得各元素的含量并計(jì)算RSD值，如表3所示，發(fā)現(xiàn)RSD值均小于5%，符合有關(guān)規(guī)定，說明儀器精密度良好。

3.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

稱取6份已測(cè)得含量的同一供試品0.15 g，計(jì)算0.15g樣品中各元素含量值，分別加入相同含量的80%、100%、120%標(biāo)準(zhǔn)溶液，即分為高、中、低3組樣品，每組樣品作3組平行試驗(yàn)，按照2.3項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行處理，計(jì)算得到的各元素的平均回收率均在89.1%～106.7%之間，RSD均小于10%。表明該方法準(zhǔn)確性良好，符合微量元素測(cè)定要求。結(jié)果見表4。

表4 待測(cè)元素的加樣回收率Table 4 Sample recovery rate of the tested element

3.2 測(cè)定結(jié)果

分別取23批樣品粉末，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下儀器工作條件測(cè)定樣品各元素含量。測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 山茱萸樣品中22種無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of 22 inorganic elements in samples

分析表5中測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測(cè)的22種無(wú)機(jī)元素中以元素 K、Ca、Mg、P、Fe、Na、Al含量較高，其中 K 的含量最高，其次依次為Ca、Mg、P的含量較高；產(chǎn)于浙江臨安的山茱萸中K、Ca、Mg、Na的含量比其他幾個(gè)產(chǎn)地山茱萸都要高，K含量高達(dá)39 311.87 mg/kg，Ca、Mg、Na 含量分別為 8 490.49、2 578.90、143.81 mg/kg。Sr、Ti、Ba、Mn、Ni、Li、Co、Se、Cr的含量較低，且它們之間也具有明顯的差別，例如山茱萸中Se、Co的平均含量為 0.027 4、0.050 7 mg/kg，而 Sr、Ti的平均含量為10.273 6、7.417 5 mg/kg，比 Se、Co 的含量高出 2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，或許這些元素之間的差異性使得元素之間組成特定比例，與藥材自身含有的物質(zhì)基礎(chǔ)形成協(xié)同作用，促進(jìn)藥材藥效的發(fā)揮。另外，對(duì)重金屬元素Pb、Cd、As、Hg、Cu進(jìn)行分析顯示，這23批山茱萸樣品中5種重金屬含量均符合WM/T2-2004《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，即 Pb≤5.0 mg/kg，Cd≤0.3 mg/kg，As≤2.0 mg/kg，Hg≤0.2 mg/kg，Cu≤20 mg/kg。

3.3 無(wú)機(jī)元素含量分布曲線

根據(jù)全定量測(cè)定的22種無(wú)機(jī)元素結(jié)果，發(fā)現(xiàn)元素之間含量差異懸殊，按其含量高低分別制作分布曲線，將含量較多的 K、Ca、Mg、P、Fe、Na、Al作為一組，含量較少的 Ba、Sr、Zn、Ti、Mn、Cu、Cr、Pb 作為一組，Li、Co、Ni、Se、As、Cd、Hg 作為一組。為了繪圖方便，取元素 K含量的二分之一。繪制出5個(gè)產(chǎn)地山茱萸樣品無(wú)機(jī)元素含量分布曲線，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地山茱萸各元素分布呈現(xiàn)相似的分布趨勢(shì)，具體結(jié)果如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 元素 K、Ca、Mg、P、Fe、Na、Al的含量分布圖Fig.1 Distribution of the contents of elements K，Ca，Mg，P，F(xiàn)e，Na and Al

圖2 元素 Ba、Sr、Zn、Ti、Mn、Cu、Cr、Pb 的含量分布圖Fig.2 Distribution of the contents of elements Ba，Sr，Zn，Ti，Mn，Cu，Cr and Pb

圖3 元素 Li、Co、Ni、Se、As、Cd、Hg 的含量分布圖Fig.3 Distribution of the contents of elements Li，Co，Ni，Se，As，Cd，Hg

由圖1可以直觀地看出產(chǎn)于浙江臨安的山茱萸中K、Ca、P、Mg的含量均比其他幾個(gè)產(chǎn)地高，其中K元素尤為顯著。圖2中浙江臨安的山茱萸含Ba元素明顯較高，其余不同產(chǎn)地的各元素含量差異不大。圖3中明顯可以看出產(chǎn)于陜西佛坪和浙江臨安的樣品Ni元素含量高于河南地區(qū)Ni元素的含量，其余不同產(chǎn)地各元素的含量差異不大。

3.4 樣品無(wú)機(jī)元素間方差分析

采用SPSS20.0對(duì)23批山茱萸樣品中22種無(wú)機(jī)元素的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并運(yùn)用字母標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，分析結(jié)果見表6。

由表6可以看出，浙江臨安的樣品中K元素與河南西峽、欒川和陜西佛坪的樣品具有顯著性差異，與河南南召的山茱萸樣品具有極顯著性差異。浙江臨安的山茱萸樣品中的元素Cu、Ba含量與其他幾個(gè)產(chǎn)地樣品均具有極顯著性差異，而這兩個(gè)元素在其他幾個(gè)產(chǎn)地樣品之間均無(wú)顯著性差異，因此元素K、Cu、Ba是浙江臨安的山茱萸與其他幾個(gè)產(chǎn)地山茱萸區(qū)別的特征性元素。另外河南西峽、欒川與南召的山茱萸樣品中元素 K、Al、Na、Zn、Ba、Ti、Cu、Ni均無(wú)顯著性差異。陜西佛坪的山茱萸樣品與浙江臨安樣品中元素K、Ca、Mg、Na、Zn、Sr具有顯著性差異，元素 Ba、Cu 具有極顯著性差異，其中產(chǎn)于陜西佛坪山茱萸中的Sr元素與產(chǎn)于河南西峽、南召的樣品也具有顯著性差異，因此元素Sr是陜西佛坪的山茱萸與浙江臨安、河南西峽、南召區(qū)別的特征性元素。另外由上表可以看出西峽、欒川、南召、佛坪和臨安5個(gè)產(chǎn)地的山茱萸樣品在測(cè)定過的22種無(wú)機(jī)元素中有7種元素不具有顯著性差異，分別是元素 Li、Cr、Fe、Co、As、Se、Hg，其中元素 Fe 的含量較高，且樣品之間沒有顯著性差異。

表6 方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance results

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)建立了ICP-MS法同時(shí)分析河南西峽、欒川、南召、陜西佛坪、浙江臨安5個(gè)產(chǎn)地山茱萸樣品中22種無(wú)機(jī)元素含量的方法，對(duì)不同產(chǎn)地樣品的無(wú)機(jī)元素含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明不同產(chǎn)地來源的山茱萸樣品中均含有豐富的 K、Ca、Mg、P、Na、Fe、Al、Zn 等無(wú)機(jī)元素，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且 Cu、As、Cd、Hg、Pb等重金屬含量也均在限定范圍內(nèi)。其中，浙江省臨安縣樣品 Na、Mg、Ca、Zn、Ti、Ba元素含量最高，陜西佛坪K、Al元素含量最高，河南南召Fe元素含量最高，河南西峽Sr元素含量最高。同時(shí)對(duì)含量結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明陜西省佛坪產(chǎn)地山茱萸樣品中K、Ca、Mg、Na、Zn、Ba、Sr、Cu 等元素與浙江臨安產(chǎn)地樣品有顯著性差異，而與河南省各產(chǎn)地樣品中大部分無(wú)機(jī)元素均無(wú)顯著性差異，并且河南省西峽、欒川、南召各產(chǎn)地中無(wú)機(jī)元素基本無(wú)顯著性差異。

山茱萸具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫的作用，這與山茱萸中的無(wú)機(jī)元素有著緊密的關(guān)系。管競(jìng)環(huán)等[6]認(rèn)為無(wú)機(jī)元素作為決定中藥藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)，雖然其含量較低，但是它可以直接作用于有機(jī)體發(fā)揮藥效。K離子作為機(jī)體內(nèi)重要的電解質(zhì)存在于組織及細(xì)胞中，主要維持機(jī)體肌肉正常的韌性，促進(jìn)蛋白質(zhì)及碳水化合物的代謝[7]，Ca參與了神經(jīng)和肌肉的活動(dòng)，維持組織的應(yīng)激性，還可以調(diào)整心律，降低毛細(xì)血管和細(xì)胞膜的通透性[8]，Mg可以促進(jìn)心肌代謝，抗心律失常作用顯著，同時(shí)擴(kuò)張血管，使血壓下降[9]，K、Ca、Mg協(xié)同調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉的興奮，對(duì)保護(hù)神經(jīng)、肌肉及骨骼有一定的促進(jìn)作用，這與山茱萸具有的神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)及抗骨質(zhì)疏松[6]的藥理活性一致；Se既可以延緩人體衰老，抑制敏感細(xì)胞增生，降低機(jī)體對(duì)各種致癌物的敏感性，抑制癌細(xì)胞分裂，同時(shí)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖以促進(jìn)抗體的合成[10]，對(duì)山茱萸抗衰老、抗腫瘤[11]作用具有促進(jìn)作用。Fe是人體造血所必需的主要微量元素，參與氧的運(yùn)輸和造血過程[9]，Zn參與人體代謝，維持人體生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)增強(qiáng)人體免疫健康起著重要的作用[12]，Mn可以促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，改善機(jī)體的造血功能，并且具有保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫系統(tǒng)的正常功能[9]，龔太平等[13]對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)抗衰老中藥的微量元素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)具有補(bǔ)腎作用的補(bǔ)益中藥中均含豐富的與人體衰老相關(guān)的無(wú)機(jī)元素 Ca、Fe、Zn、Cu、Mg 等，且山茱萸作為中醫(yī)臨床常用的名貴傳統(tǒng)抗衰老藥物[14]，其內(nèi)部含有豐富的Ca、Fe、Zn、Cu、Mg等元素，這與山茱萸補(bǔ)益肝腎，澀精固脫的功效一致；申明金等[15]對(duì)通草類中藥微量元素的主成分分析和聚類分析可知，Zn、Fe、Mn能與藥材中的有機(jī)成分形成絡(luò)合物和鹽類，從而起到清熱、抗菌作用，且Zn、Mn被視為“歸腎經(jīng)”的物質(zhì)基礎(chǔ)，它們?cè)谘a(bǔ)腎方面發(fā)揮著重要的作用。

通過結(jié)合上述元素的生理功能與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)微量元素之間的特定比例能產(chǎn)生一定的協(xié)同作用，且與中藥本身具有的藥效存在相關(guān)性[15]。這與山茱萸具有降血糖、抗腫瘤、抗衰老、抗炎鎮(zhèn)痛、提高免疫力、抗骨質(zhì)疏松、肝腎保護(hù)、神經(jīng)及心肌保護(hù)作用等[14]相一致。而且隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，山茱萸已經(jīng)顯示出越來越多的藥用功效，且廣泛應(yīng)用于糖尿病、心臟病、血栓、癌癥、艾滋病等現(xiàn)代臨床疾病中[16]。近年來隨著人們對(duì)養(yǎng)生理念的日益加深，山茱萸保健酒、山茱萸保健食品、山茱萸保健飲料等[17]食用產(chǎn)品層出不窮。本試驗(yàn)通過對(duì)5個(gè)主要產(chǎn)地的山茱萸無(wú)機(jī)元素的綜合對(duì)比研究，為山茱萸種植基地的選擇及質(zhì)效評(píng)價(jià)提供依據(jù)，為以后大規(guī)模食品加工生產(chǎn)提供參考。