江娜，王秀虹

咸寧市中心醫(yī)院湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦科，湖北咸寧437100

宮頸癌是常見(jiàn)的一種婦科惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1-2]。有研究報(bào)道，p16是發(fā)現(xiàn)最早的可以直接參與細(xì)胞周期調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分裂，是與細(xì)胞生長(zhǎng)分化和惡性腫瘤細(xì)胞分裂密切相關(guān)的基因，其在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且負(fù)責(zé)細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控，是細(xì)胞周期中重要的一種抑癌基因[3]。半乳糖凝集素（galectin，Gal）是人體組織細(xì)胞中富含的由1個(gè)或2個(gè)糖結(jié)構(gòu)識(shí)別域組成的凝集素家族中的重要成員[4]，通過(guò)與β-半乳糖苷特異性結(jié)合可以介導(dǎo)細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡和炎性反應(yīng)。相關(guān)研究表明，Gal-1表達(dá)上調(diào)與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5-6]，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于p16、Gal-1的表達(dá)與宮頸癌關(guān)系的研究及報(bào)道仍較少，本研究觀察了宮頸癌組織中p16、Gal-1蛋白的表達(dá)情況，并對(duì)p16、Gal-1蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2018年12月咸寧市中心醫(yī)院湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版中宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)[7]；②病理學(xué)結(jié)果證實(shí)為宮頸癌；③年齡19～65歲；④既往未接受抗腫瘤放化療或免疫性治療；⑤病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②伴有免疫系統(tǒng)疾病或其他類(lèi)型的宮頸疾病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入宮頸癌患者100例，并收集患者的宮頸癌組織標(biāo)本。另外，選取同期于咸寧市中心醫(yī)院湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院接受治療的100例宮頸上皮瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者的CIN組織為對(duì)照。100例宮頸癌患者的年齡為36～65歲，平均（48.9±8.5）歲；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標(biāo)準(zhǔn)：I期22例，Ⅱ期28例，Ⅲ期37例，Ⅳ期13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例；腫瘤分化程度：低分化53例，中分化27例，高分化20例；病理學(xué)類(lèi)型：鱗癌61例，腺癌39例。100例CIN患者的年齡為34～65歲，平均（48.0±11.0）歲；CINI級(jí)27例，CINⅡ級(jí)46例，CIN Ⅲ級(jí)27例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

取宮頸癌組織和CIN組織，行二甲苯透明石蠟切片，浸泡2次；依次用100%、95%、75%、50%的乙醇梯度復(fù)水，各浸泡2 min后自來(lái)水沖洗。檸檬酸高壓1.5 min修復(fù)組織抗原；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次3～5 min；除去PBS，向每張切片中加50 μl 3%過(guò)氧化氫，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS；每張切片加入50 μl第一抗體的切片，室溫條件下孵育60 min；PBS沖洗3次，每次3～5 min；除去PBS，接著用50 μl即用型MaxVision試劑，室溫條件下孵育15 min；PBS沖洗3次，每次3 min；除去PBS，加100 μl新配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，5 min后顯微鏡下觀察；自來(lái)水沖洗后加蘇木素復(fù)染再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后再中性樹(shù)膠封固；鏡下閱片、攝像；病理圖像分析儀計(jì)數(shù)、采圖。

1.3 免疫組織化學(xué)法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化染色的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：Gal-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中呈黃色、橙色、棕色甚至褐色染色；p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中呈黃色、橙色、棕色甚至褐色染色。根據(jù)著色程度評(píng)分：0分，未染色；1分，僅呈淡黃色染色；2分，呈棕黃色染色；3分，呈褐色、黑色染色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≤10%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為11%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為51%～75%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞75%。將染色程度與陽(yáng)性細(xì)胞所占比例得分相乘，乘積＜3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中Gal- 1、 p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

宮頸癌組織中Gal-1、p16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于CIN組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中Gal- 1、 p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中Gal- 1蛋白、 p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度為低分化的宮頸癌患者宮頸癌組織中Gal-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度為中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.417、4.382、6.483，P＜0.05）；腫瘤分化程度為低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤分化程度為中高分化的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.868，P＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中Gal- 1、 p16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況（ n=100）

3 討論

宮頸癌是目前對(duì)女性健康威脅最大的婦科惡性腫瘤，其病死率位于女性婦科惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌。宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制較為復(fù)雜，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控、抑癌基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡等均有關(guān)[8]。

p16是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的新的抗癌基因，定位于人類(lèi)染色體9p21，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，3個(gè)外顯子分別為126、307、11 bp[9-10]。p16定位于細(xì)胞核中，作為細(xì)胞周期中的基本基因和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其可以參與細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)過(guò)程，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。相關(guān)研究表明，與p53基因相比，p16是參與細(xì)胞周期調(diào)控的更重要的一種抑癌基因，其可以參與肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的直接形成[11]。p16基因是細(xì)胞周期中的剎車(chē)裝置，一旦失靈細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)無(wú)限增殖，是惡性腫瘤形成的主要原因。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中p16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于CIN組織（P＜0.01），表明p16基因直接參與宮頸癌的形成過(guò)程。相關(guān)研究顯示，宮頸癌患者的p16表達(dá)水平明顯高于健康女性[12-13]，與本研究結(jié)論一致。本研究結(jié)果還顯示，腫瘤分化程度為低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤分化程度為中高分化的患者（P＜0.01），提示p16表達(dá)上調(diào)與宮頸癌進(jìn)展關(guān)系密切，可作為宮頸癌病情預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)。Gal-1蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的半乳糖凝聚素家族成員，靶向分泌至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中蛋白相互作用，進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)可調(diào)控信使RNA（messenger RNA，mRNA）剪切過(guò)程進(jìn)而影響細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究表明，Gal-1蛋白在膀胱癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)[14]。還有研究報(bào)道，結(jié)腸腺癌的基質(zhì)高表達(dá)Gal-1蛋白且與腫瘤的侵襲能力、惡性程度密切相關(guān)，Gal-1蛋白高表達(dá)提示惡性腫瘤的形成[15]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中Gal-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于CIN組織（P＜0.01），表明Gal-1蛋白可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度為低分化的宮頸癌患者宮頸癌組織中Gal-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度為中高分化的患者（P＜0.05），表明Gal-1蛋白可能作為宮頸癌不良預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。Gal-1蛋白參與宮頸癌侵襲、惡性轉(zhuǎn)移的機(jī)制較為復(fù)雜，其中主要有以下2個(gè)方面：①上調(diào)腫瘤微血管增殖，Gal-1蛋白主要通過(guò)與神經(jīng)纖毛蛋白1（neuropilin-1，NRP1）受體相結(jié)合，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附遷移，同時(shí)還能促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2（vascular endothelial growth factor 2，VEGF2）受體磷酸化，進(jìn)而活化有絲分裂原激活蛋白應(yīng)激活化蛋白激酶1（stress-activated protein kinase 1，SAPK）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑，促進(jìn)腫瘤血管新生[16]。②增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力，Gal-1蛋白可抑制RET、JAK2的表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移。

綜上所述，宮頸癌組織中Gal-1、p16蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并且與宮頸癌的惡性程度密切相關(guān)。Gal-1、p16蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展、組織分化程度等臨床不良預(yù)后方面的評(píng)估價(jià)值，對(duì)宮頸癌的診斷治療具有一定指導(dǎo)意義，可從分子水平推進(jìn)臨床對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。