張丹，李萬軍，李曾#

陜西省西安交通大學附屬三二〇一醫(yī)院1腫瘤內科，2病理科，陜西 漢中723000

乳腺癌是世界范圍內導致女性腫瘤患者死亡的第二大原因，其發(fā)病率和病死率均較高，2012年約有167.1萬女性被確診為乳腺癌[1]。近年來，乳腺癌的發(fā)病機制越來越受到相關學者重視。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA分子，研究顯示，乳腺癌晚期患者lncRNA尿路上皮癌相關1（urothelial cancer associated 1，UCA1）基因的表達水平升高，并且ln-cRNA UCA的表達水平與乳腺癌患者的病死率呈正相關[2]。微小 RNA-203（micro RNA-203，miRNA-203）是一種干性抑制性miRNA，其在膀胱癌、卵巢癌等多種人類腫瘤中異常表達，并且miRNA-203表達上調還與腫瘤患者的抗腫瘤藥物耐受有關[3-4]。相關研究表明，lncRNA可與miRNA相互調控，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAUCA1可以增加膀胱癌的化療耐藥性[6]。本研究對lncRNAUCA1通過抑制miRNA-203a對乳腺癌細胞化療耐藥性的影響進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞

人乳腺癌細胞系MCF7購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC），人乳腺癌耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）細胞系MCF7/5-FU為本實驗室根據5-FU濃度梯度蹄選法，以MCF7細胞系為母本蹄選而成。

1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，細胞裂解液購自美國Thermo Scientific公司，TRIzol購自北京天根生物有限公司，DMEM及opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；酶標儀購自美國Sigma公司，移液器及配套移液槍頭和EP管均購自美國Axygen公司，恒溫培養(yǎng)箱購自日本Panasonic公司，ABI7500 Fast PCR儀購自上海閃晶生物科技公司。轉染試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染

將MCF7、MCF7/5-FU細胞接種于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)基后進行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的MCF7、MCF7/5-FU細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，將MCF7細胞分為兩組：MCF7干擾組，轉染UCA1siRNA；MCF7未干擾組，常規(guī)培養(yǎng)不做轉染處理。將MCF7/5-FU細胞分為兩組：MCF7/5-FU干擾組，轉染UCA1siRNA；MCF7/5-FU未干擾組，常規(guī)培養(yǎng)不做轉染處理。具體轉染方法：采用opti-MEM培養(yǎng)基（不含胎牛血清）對UCA1siRNA儲存液進行稀釋，混勻后于室溫孵育5 min；將稀釋后的UCA1siRNA與Upo2000輕輕混勻，于室溫下解育20 min。隨后將500 μl脂質體-核酸混合液分別加入4組細胞中，更換新鮮的不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后換用完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～96 h，轉染過程嚴格按照操作說明書進行。

1.4 RT-PCR檢測lncRNA UCA 1表達水平

取處于對數(shù)生長期的MCF7、MCF7/5-FU細胞，細胞裂解液處理后，收集細胞總RNA，加入40 μl無RNA酶的水溶解細胞總RNA，置于-80℃冰箱中保存待用[7]。采用實時定量聚合酶鏈反應（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）對逆轉錄所得lncRNAUCA1的cDNA進行稀釋后，取cDNA、上下游引物、預混液和超純水混合成20 μl反應體系，于ABI7500 FAST PCR儀上對lncRNAUCA1的表達情況進行定量分析，最后對熒光信號進行收集分析[8]。實驗重復3次。

1.5 噻唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細胞活力

采用5、10、50、100 μg/ml的奧沙利鉑對MCF7干擾組和MCF7未干擾組MCF7細胞進行處理，觀察奧沙利鉑處理72 h后兩組細胞的存活情況，選擇兩組細胞存活率差別最大的奧沙利鉑濃度（10 μg/ml）對MCF7干擾組、MCF7未干擾組、MCF7/5-FU干擾組、MCF7/5-FU未干擾組細胞的存活情況進行分析。采用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液將上述4組細胞稀釋成單個細胞懸液，并以每孔7500個細胞接種到96孔板中，每孔的體積為200 μl，每個濃度均設置3個復孔；細胞于接種24 h后，棄去原有培養(yǎng)基，更換為由DMEM培養(yǎng)基稀釋好的AC溶液，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；接著每孔加20 μl MTT溶液繼續(xù)孵育2 h；最后進行比色：選擇490 nm波長，在酶標儀上測出各孔吸光度，記錄結果，并以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞的生長曲線或根據吸光度值計算細胞存活率。實驗重復3次。

1.6 RT-PCR檢測miRNA-203 a的表達水平

采用RT-PCR法對MCF7干擾組、MCF7未干擾組、MCF7/5-FU干擾組、MCF7/5-FU未干擾組細胞中miRNA-203a的表達水平進行檢測，具體檢測方法同1.4。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA UCA 1表達水平的比較

MCF7/5-FU細胞中l(wèi)ncRNAUCA1的相對表達量為（0.96±0.13），明顯高于MCF7細胞的（0.17±0.09），差異有統(tǒng)計學意義（t=12.239，P＜0.01）。

2.2 干擾lncRNA UCA 1表達對乳腺癌細胞活力的影響

10、50 μg/ml奧沙利鉑處理后，MCF7干擾組MCF7細胞的存活率均明顯低于MCF7未干擾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；10 μg/ml奧沙利鉑處理后MCF7干擾組與MCF7未干擾組MCF7細胞的存活率相差最大，因此本研究選擇濃度為10 μg/ml的奧沙利鉑進行耐藥性研究（表1）。

表1 不同濃度奧沙利鉑處理后MCF 7未干擾組和MCF 7干擾組MCF 7細胞存活率的比較（%，± s）

表1 不同濃度奧沙利鉑處理后MCF 7未干擾組和MCF 7干擾組MCF 7細胞存活率的比較（%，± s）

注：*與MCF7未干擾組比較，P＜0.01

奧沙利鉑濃度（μg/ml）5 10 50 100 MCF7未干擾組91.23±7.91 92.15±5.73 78.35±7.24 24.14±5.27 MCF7干擾組92.18±6.58 64.36±5.76*54.29±6.69*21.17±6.38

采用10 μg/ml奧沙利鉑處理干擾lncRNA UCA1表達后MCF7、MCF7/5FU細胞的生存情況，結果顯示：與MCF7未干擾組比較，MCF7干擾組MCF7細胞的存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與MCF7/5-FU未干擾組比較，MCF7/5-FU干擾組MCF7/5-FU細胞的存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 干擾lncRNA UCA 1表達后MCF 7、MCF 7/ 5-FU細胞存活率的比較（%，± s）

表2 干擾lncRNA UCA 1表達后MCF 7、MCF 7/ 5-FU細胞存活率的比較（%，± s）

注：a與MCF7未干擾組比較，P＜0.01；b與MCF-7/5-FU未干擾組比較，P＜0.01

細胞存活率57.31±4.78 40.26±3.95a 78.61±3.44 59.52±4.13b組別MCF7未干擾組MCF7干擾組MCF7/5-FU未干擾組MCF7/5-FU干擾組

2.3 干擾lncRNA UCA 1表達對乳腺癌細胞中miRNA-203 a表達的影響

MCF7干擾組MCF7細胞中miRNA-203a的相對表達量明顯高于MCF7未干擾組，MCF7/5-FU干擾組MCF7/5-FU細胞中miRNA-203a的相對表達量明顯高于MCF7/5-FU未干擾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表3）

3 討論

乳腺癌患者化療過程中易出現(xiàn)化療耐藥，而耐藥的原因為腫瘤細胞本身發(fā)生了改變，導致其對化療藥物的敏感性降低，從而影響患者的治療效果[9]。因此，改善乳腺癌化療耐受，提高乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性具有重要意義。目前，腫瘤化療過程中發(fā)生耐藥的機制尚未明確，前期的研究僅顯示腫瘤耐藥與ABC家族等藥泵蛋白的表達及腫瘤細胞抗調亡能力的增強等因素有關[10-11]。本研究通過分析lncRNAUCA1抑制miRNA-203a對乳腺癌細胞化療耐藥性的影響，探討了乳腺癌患者化療過程中出現(xiàn)化療耐藥的機制。UCA1是參與調節(jié)多種腫瘤藥物敏感性的lncRNA[3]。相關研究顯示，UCA1可以通過WNT6依賴性方式激活WNT信號通路，從而影響腫瘤的化療耐藥性[12-13]。lncRNAUCA1可以通過調節(jié)雌激素受體水平參與惡性腫瘤的淋巴結轉移，研究表明，失調的lncRNA可以通過多種機制參與乳腺癌藥物敏感性的調節(jié)[14]。本研究結果顯示，MCF7/5-FU細胞中l(wèi)ncRNAUCA1的相對表達量明顯高于MCF7細胞，提示lncRNAUCA1與乳腺癌細胞的耐藥性有關，lncRNAUCA1的表達上調增強了乳腺癌細胞的化療耐藥性。已有研究表明，miRNA-203已被證明可以抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和骨轉移，促進腫瘤細胞凋亡[15-16]。本研究結果顯示，MCF7干擾組MCF7細胞中miRNA-203a的相對表達量明顯高于MCF7未干擾組，MCF7/5-FU干擾組MCF7/5-FU細胞中miRNA-203a的相對表達量明顯高于MCF7/5-FU未干擾組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明lncRNAUCA1可以通過下調miRNA-203a表達，促進乳腺癌細胞的化療耐藥。綜上所述，lncRNAUCA1通過抑制miRNA-203a表達，增強乳腺癌的化療耐藥性及增加乳腺癌細胞的活力，lncRNAUCA1可能為乳腺癌提供潛在的治療靶點。

表3 干擾lncRNAUCA 1表達后MCF 7、MCF- 7/ 5-FU細胞中miRNA-203 a相對表達量的比較（± s）

表3 干擾lncRNAUCA 1表達后MCF 7、MCF- 7/ 5-FU細胞中miRNA-203 a相對表達量的比較（± s）

注：a與MCF7未干擾組比較，P＜0.01；b與MCF-7/5-FU未干擾組比較，P＜0.01

miRNA-203a相對表達量0.66±0.08 0.79±0.11a 0.54±0.14 4.29±0.12b組別MCF7未干擾組MCF7干擾組MCF-7/5-FU未干擾組MCF-7/5-FU干擾組