沈凱，邵芳，馮同保，戚春建#

南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院1腫瘤研究所，2檢驗科，江蘇 常州213000

乳腺癌是世界范圍內最常見的女性惡性腫瘤，同時也是全世界女性惡性腫瘤死亡的第二大原因[1-2]。由于早期診斷和治療策略的改善，乳腺癌患者的病死率顯著下降。然而，盡管大多數(shù)患者最初的治療效果較好，但是一段時間后部分乳腺癌發(fā)展為更具侵略性的腫瘤形式，同時對放化療也產(chǎn)生了抵抗[3]。因此，探尋用于預防、診斷和治療乳腺癌的分子生物標志物，具有重要的意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼微小RNA，長度約22個核苷酸，miRNA與信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）相結合，導致mRNA降解或轉錄后翻譯抑制，從而調控靶基因的表達。生物信息學研究表明miRNA可能調控超過30%的蛋白質編碼基因[4]。研究表明，miRNA參與調控腫瘤的多因素進展，包括生長和轉移，作為抑癌基因或致癌基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-6]。miRNA表達譜正在成為潛在的診斷和預后標志物，可以促進個性化治療與疾病管理[7]。miRNA-373是miRNA-520/373家族成員之一，該家族由具有相同種子區(qū)域的3種不同miRNA簇組成，miRNA-373已被證明參與癌癥的缺氧反應和DNA損傷修復[8-9]。最近，已有相關研究報道m(xù)iRNA-373參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如乳腺癌[10]、口腔癌[11]、肺癌[12]、前列腺癌[13]等。本研究探討miRNA-373在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達情況和相關作用，進一步揭示其機制，為乳腺癌的治療提供新的靶點，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

1.1.1 細胞株 人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7、ZR-75-1購自中國科學院上海細胞研究所。細胞培養(yǎng)條件：RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（購自美國Gibco公司），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.1.2 試劑Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR?Green Mix均購自南京維諾贊生物科技有限公司；miRNA-373 mimcis購自上海吉瑪公司；LipofectamineTM2000購自美國英杰生命技術有限公司；CCK8試劑盒購自上海碧云天公司；Transwell小室、6孔板、96孔板均購自美國康寧公司；兔抗β-actin抗體、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-PKB，又 稱p-AKT）抗 體（Ser473、Thr308）、p-AKT抗體抑制劑（LY294002）均購自美國CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 定量聚合酶鏈反應（quantitativepolymerase chain reaction ，qPCR）檢測 miRNA-373表達情況 采用Trizol試劑分別提取MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7、ZR-75-1乳腺癌細胞的總RNA，用酶標儀檢測其濃度及質量，進行逆轉錄合成cDNA。在實時熒光qPCR儀中進行反應擴增，以U6為內參，PCR的反應程序為：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，62℃退火10 s，共進行40個循環(huán)。U6上游引物為GTGCTCGCTTCGGCAGCATA，下游引物為GGAACGCTTCACAATTTGCGTGTC；miRNA-373上游引物為TACTCAAAATGGGGGCGCTT，下游引物為GGGACACCCCAAAATCGAAG。

1.2.2 CCK 8實驗檢測細胞增殖情況 用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的MDA-MB-231乳腺癌細胞，制成單細胞懸液，以每孔2×104/ml細胞接種到96孔板中，每孔設置5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行細胞轉染miRNA-373（NC組）和miRNA-373 mimic（smiRNA-373 mimics組），分別在轉染24、48、72 h時終止培養(yǎng)，每孔加入CCK8試劑10 μl后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育2 h，最后在酶標儀上測各孔450 nm波長處的吸光度值。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移情況 取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞，胰酶消化并接種到6孔板中，轉染24 h后，用200 μl槍頭在每孔中間劃線，然后吸盡培養(yǎng)基，用PBS洗滌2遍，每孔加入含1%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，分別在0、24、48 h時放置于顯微鏡下拍照。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲情況 細胞轉染48 h后，進行細胞侵襲實驗；所有試劑及器材均在冰上預冷，將Matrigel基質膠（8～12 mg/ml）稀釋30～40倍至200～300 μg/ml，用黃槍小心注射0.1 ml稀釋好的Matrigel基質膠入Transwell小室，37℃孵育2 h。小心吸掉部分上清，按2×105/ml用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞，制成細胞懸液，上室加入100 μl無血清細胞懸液，同時下室加入10%FBS+RPMI1640培養(yǎng)基800 μl，放入 37℃培養(yǎng)箱孵育 24 h。取出Transwell板，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，加入結晶紫染色30 min，棉球擦掉上表面細胞，顯微鏡下觀察小室。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 細胞轉染48 h后用胰酶消化細胞，每組細胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌離心2次后加入 100 μl的 binding buffer和 5 μl的熒光團標記的抗體[膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、7-ADD-PerCP/Cy5.5]，室溫孵育15 min，PBS洗滌1遍，加入400 μl的binding buffer后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果采用FlowJo 7.6.1軟件分析。

1.2.6 Westernblot法檢測蛋白表達情況 將NC組和miRNA-373 mimics組細胞培養(yǎng)48 h后，收集6孔板上的細胞，PBS洗滌2次，去除上清，每個樣品加 入 100 μl RIPA 裂解液+1μl苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）后放置冰上30 min，每隔10 min搖勻1次，然后在12 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清并用二喹啉甲酸（bicin-choninic acid，BCA）試劑盒檢測其蛋白濃度。每100 μl樣品加入25 μl 5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液，搖勻后100℃變性5～10 min。將蛋白樣品進行PAGE電泳，濕轉至甲醇浸潤過的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用50 g/L脫脂奶粉封閉1.5 h，用含吐溫-20的PBS洗膜3次，每次10 min，加入一抗（1∶1000），4℃搖床過夜；去除一抗液，用PBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶2000），室溫孵育1.5 h，洗滌后采用化學發(fā)光法曝光。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各乳腺癌細胞株中miRNA-373表達情況的比較

采用qPCR分別檢測miRNA-373在MDA-MB-231、MDA-MB-435、ZR-75-1和MCF-7乳腺癌細胞中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231乳腺癌細胞中miRNA-373的表達量相對較低（圖1），而且其侵襲能力較強，具有一定的研究意義，因此選擇MDA-MB-231乳腺癌細胞株進行后續(xù)研究。

圖1 各乳腺癌細胞株中miRNA-373的表達情況

2.2 miRNA-373對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的影響

miRNA-373 mimics組乳腺癌細胞中miRNA-373表達量為（14 411.79±515.53），高于NC組細胞中的（0.065±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（t=39.534，P＜0.05）。CCK8實驗檢測結果顯示，細胞在轉染24、48、72 h時，NC組和miRNA-373 mimics組細胞的吸光度值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2 CCK 8實驗檢測NC組及miRNA-373 mimics組細胞吸光度值

2.3 miRNA-373對MDA-MB-231乳腺癌細胞遷移能力的影響

采用細胞劃痕實驗檢測MDA-MB-231乳腺癌細胞的遷移能力。轉染24、48 h時，NC組細胞遷移距離分別為（40.70±3.51）、（50.11±3.84）μm，分別短 于 miRNA-373 mimics組 的（65.62±2.33）、（75.96±2.54）μm，差異均有統(tǒng)計學意義（t=9.449、10.228，P＜0.05）。（圖3）

圖3 細胞劃痕實驗檢測NC組及miRNA-373 mimics組細胞的遷移能力

2.4 miRNA-373對MDA-MB-231乳腺癌細胞侵襲能力的影響

miRNA-373 mimics組侵襲細胞數(shù)目為（200±8），高于NC組的（80±5），差異有統(tǒng)計學意義（t=21.574，P＜0.05）。（圖4）

圖4 Transwell實驗檢測NC組及miRNA-373 mimics組細胞的侵襲能力（結晶紫染色，×100）

2.5 miRNA-373對MDA-MB-231乳腺癌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測NC組和miRNA-373 mimics組細胞的凋亡情況，兩組細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（圖5）

圖5 流式細胞儀檢測NC組及miRNA-373 mimics組細胞的凋亡能力

2.6 miRNA-373對AKT信號通路的影響

采用Western blot法檢測NC組和miRNA-373 mimics組MDA-MB-231乳腺癌細胞中的AKT磷酸化水平。結果顯示，miRNA-373 mimics組細胞p-AKT表達量為（0.746±0.058），高于 NC組的（0.485±0.015），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.924，P＜0.05）（圖6A）。NC組侵襲細胞數(shù)目為（247±10），多于p-AKT抑制劑組的（84±6），差異有統(tǒng)計學意義（t=26.890，P＜0.05）（圖6B）。miRNA-373 mimics組侵襲細胞數(shù)目為（492±9），多于miRNA-373 mimics+p-AKT抑制劑組的（112±5），差異有統(tǒng)計學意義（t=63.310，P＜0.05）（圖6C）。

圖6 miRNA-373對AKT信號通路的影響信號通路的影響

3 討論

在本研究中，通過qPCR檢測MDA-MB-231乳腺癌細胞中miRNA-373的表達情況，雖然miRNA-373的表達相對較低，但是它在MDA-MB-231細胞中卻起促進腫瘤發(fā)展的作用。此外，結果顯示，miRNA-373對乳腺癌細胞的增殖和凋亡并無太大影響，主要增強了細胞的遷移和侵襲能力。國內已有研究表明，miRNA-373可抑制乳腺癌細胞MCF-7的侵襲能力[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-373在MCF-7細胞中通過下調CD44促進乳腺癌細胞的侵襲能力[15]，這也意味著miRNA-373對乳腺癌細胞有雙重作用，具體何種因素導致的作用不同仍需探索。另外miRNA-373還存在組織特異性，在膠質瘤[16]和胰腺癌[17]中起到抑癌作用，在前列腺癌[18]中起到促癌作用。Yuan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200表達下調可活化p-AKT，該信號轉導通路參與人胃循環(huán)腫瘤細胞的上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、遷移和侵襲。Jia等[20]研究發(fā)現(xiàn)p-AKT高表達可能預示卵巢癌的預后不良。本研究通過Western blot法檢測NC組和miRNA-373 mimics組的p-AKT表達情況，發(fā)現(xiàn)miRNA-373 mimics組p-AKT表達量高于NC組，因此p-AKT可能參與了乳腺癌細胞的遷移和侵襲。通過向轉染后細胞加入p-AKT抑制劑后發(fā)現(xiàn)，該細胞的侵襲能力大大減弱。因此p-AKT可能是一個潛在靶點，繼續(xù)探索p-AKT相關靶基因有望成為乳腺癌新的治療方向。

綜上所述，miRNA-373在乳腺癌細胞MDAMB-231中起著促進腫瘤發(fā)展的作用，其過表達后能增強該腫瘤細胞的侵襲能力，通過抑制AKT信號通路的磷酸化水平可以抑制其侵襲能力，為乳腺癌的治療提供新的方式。此外，仍需進一步研究p-AKT信號通路的相關靶基因，系統(tǒng)化地研究miRNA-373的信號通路。