張璐璐,范 剛,*,何 進,黃 文,任婧楠,潘思軼

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室,湖北武漢 430070; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科技學(xué)院,湖北武漢 430070)

檸檬烯(limonene)作為一種重要的功能性單萜,已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于300多種植物中。單萜類化合物是萜烯中最具代表性的分子,由于其感官特性以及抗菌、抗癌、解痙、抗高血糖、抗過敏、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等的特性使它們廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)等行業(yè)[1]。檸檬烯是柑橘加工產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物,全世界每年的產(chǎn)量預(yù)計超過50 000噸,其價格非常便宜[2]。但檸檬烯的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,香氣值較低,所以其應(yīng)用受到一定的局限性[3]。具有與檸檬烯相同骨架的含氧單萜芳香化合物,比如α-松油醇(α-terpineol)、紫蘇醇(perillyl alcohol)、香芹醇(carveol)等,不僅具有獨特的芳香氣味,是高級香精香料的原料,而且還具有較高的經(jīng)濟價值和藥理作用。

目前對于含氧單萜化合物的制備方法主要有化學(xué)合成、從天然動植物原料中提取以及微生物轉(zhuǎn)化?；瘜W(xué)合成法具有產(chǎn)率高、成本低的特點。但是因為其較低的區(qū)域和立體選擇性而低質(zhì)量,使得最終得到的產(chǎn)品是混合物。此外,化學(xué)合成法獲得的芳香化合物不能被認(rèn)為是天然的,不僅需要較高的成本(高壓力和溫度),還會產(chǎn)生環(huán)境問題(使用大量有機溶劑)。

直接從天然動植物原料中提取以及利用微生物轉(zhuǎn)化法來制備的芳香化合物可以被認(rèn)為是“天然的”,標(biāo)記“天然的”香料產(chǎn)品更受消費者的青睞。然而,直接從動植物原料中提取芳香化合物也存在著不足之處。由于季節(jié)性(產(chǎn)品的可獲得性與一年中的某些時期有關(guān))、低產(chǎn)量以及生態(tài)和社會問題,導(dǎo)致產(chǎn)品的價格居高不下[4]。與之相比,微生物轉(zhuǎn)化法是通過微生物整體細(xì)胞或產(chǎn)生的酶將復(fù)雜的底物進行結(jié)構(gòu)修飾和改造,其本質(zhì)在于利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物(或外源化合物)進行催化反應(yīng),使一種化合物轉(zhuǎn)變成更有經(jīng)濟價值的產(chǎn)物[5]。微生物轉(zhuǎn)化法具有高對映選擇性,可得到光學(xué)純的芳香化合物,提高產(chǎn)品的感官特性;全年連續(xù)生產(chǎn),無季節(jié)干擾;采用較不嚴(yán)格的工藝參數(shù)(從而降低能源成本和使用對環(huán)境有害的試劑);工藝條件可以被控制和優(yōu)化。目前已被廣泛用于有機合成、香料生產(chǎn)、新藥研發(fā)、藥物結(jié)構(gòu)修飾與改造及藥物代謝模型預(yù)測等方面。因此,利用微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香料已經(jīng)成為研究的熱點。

利用微生物轉(zhuǎn)化法對檸檬烯進行結(jié)構(gòu)修飾,已經(jīng)成為獲得含氧單萜的重要途徑。因此,本文對檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物作了簡要概述,重點介紹了近年來檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究,進一步總結(jié)了檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化涉及到的相關(guān)酶,最后概述了微生物轉(zhuǎn)化實現(xiàn)工業(yè)化需要研究的發(fā)展方向,以期為今后單萜生物轉(zhuǎn)化的研究提供參考。

1 檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物

通過生物轉(zhuǎn)化對檸檬烯進行結(jié)構(gòu)修飾來制備單萜芳香產(chǎn)品,是具有重要應(yīng)用前景的新產(chǎn)品開發(fā)方法。如圖1,具有與檸檬烯(1)相同骨架的含氧化合物主要有1,2位的環(huán)氧化產(chǎn)物檸檬烯-1,2-環(huán)氧化合物(limonene-1,2-oxide,9)和其水解產(chǎn)物檸檬烯-1,2-二醇(limonene-1,2-diol,8)[6];C3位羥基化產(chǎn)物異薄荷烯醇(isopiperitenol,13)和異薄荷烯酮(isopiperitenone,14)[7];C6位羥基化產(chǎn)物香芹醇(2)和香芹酮(carvone,3)[8];C7位羥基化產(chǎn)物紫蘇醇(10),進一步氧化產(chǎn)物紫蘇醛(perillic aldehyde,11)和紫蘇酸(perillic acid,12)[9];C8位氧化產(chǎn)物松油醇(19)[10];8、9位環(huán)氧化產(chǎn)物檸檬烯-8,9-環(huán)氧化合物(limonene-8,9-epoxide,6)[11]。目前,檸檬烯的氧化產(chǎn)物主要是檸檬烯發(fā)生烯丙基的羥基化(3,6,7位)得到的醇,醇氧化成羰基而得到的酮,雙鍵氧化(1,2和8,9雙鍵)得到的環(huán)氧化物,在4和10位還沒有的到相應(yīng)的氧化產(chǎn)物。

圖1 檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物Fig.1 Biotransformation products of limonene

檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物是重要的醫(yī)藥中間體,在神經(jīng)和精神疾病、咳嗽、消炎等治療方面均有應(yīng)用。此外,此環(huán)氧化物是有機合成過程中重要的中間體,它的分子結(jié)構(gòu)中存在著十分活潑的環(huán)氧基團,可以通過與多種親核試劑的開環(huán)反應(yīng)獲得一系列重要的有機化合物[12]。檸檬烯-1,2-二醇是一種無色至微黃色的油狀液體,具有清涼的薄荷味。它常被用作布丁、飲料、口香糖、明膠、布丁和硬糖的調(diào)味劑。

異薄荷烯醇具有麝香-薄荷醇特征氣味,可作為香料工業(yè)的基礎(chǔ)原料[13]。其進一步的代謝產(chǎn)物薄荷呋喃(18)和薄荷酮(19)具堅果香、咖啡香,可調(diào)配食用香精。研究表明左旋薄荷酮具有清涼、鎮(zhèn)痛、止癢、抗抑郁的功效[14]。

香芹系列香料是調(diào)配高級食品和化妝品香精的重要原料,其中代表物質(zhì)是香芹醇、香芹酮、二氫香芹酮(4)、二氫香芹醇(5)。由于香芹類化物的各種生物學(xué)活性,還被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、化學(xué)、口腔衛(wèi)生等行業(yè)。研究表明香芹類化合物具有抗癌的作用,香芹醇對乳腺癌有抑制作用[15],香芹酮對肺腺瘤、胃前腫瘤形成、乳腺癌以及結(jié)腸癌都有預(yù)防作用。并且香芹酮還有強烈的止痙攣的作用。最后,香芹酮還可以作為抗菌劑和天然的殺蟲劑[4]。

紫蘇醇是帶有香氣的單萜類天然活性物質(zhì),在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)具有廣闊市場空間。研究表明,紫蘇醇具有較高的抗腫瘤活性,在發(fā)達國家,紫蘇醇已廣泛用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、肺癌、皮膚癌、乳腺癌等的臨床治療[16]。除此之外,紫蘇醇還可以用于腎臟疾病、白血病、肝損傷等的治療。紫蘇醛是紫蘇的獨特芳香氣味成分,不僅可以用于調(diào)制茉莉、水仙、檸檬、留蘭香以及香辛料等香精香料,還可以刺激嗅覺神經(jīng),使胃液分泌、增進食欲。紫蘇醛具有抗菌活性,對皮膚絲狀菌和綠膿桿菌、沙門氏菌有較為明顯的抑菌效果,可以作為天然防腐劑和抗真菌劑。此外,紫蘇醛還具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗癌等的生物活性[17]。紫蘇酸是一種無氣味的固體,對細(xì)菌和真菌具有強烈的抑菌活性,對惡性黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有抑制作用。

α-松油醇有穩(wěn)定的丁香花、鈴蘭花等花香香氣,是我國重要的出口香料品種,其廣泛存在于松節(jié)油、茶樹精油、檸檬油等精油中。不僅可用于調(diào)配檸檬、甜橙、桃子、柑橘等食用香精,還用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、塑料、肥皂、油墨、儀表和電訊工業(yè)中。此外,α-松油醇還可以作為有機合成中間體,用于制備其他更有價值的物質(zhì),如二氫松油醇、乙酸松油酯、香葉醇等。目前研究發(fā)現(xiàn)α-松油醇的藥理活性主要有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎癥以及抗痙攣等的作用[4]。

2 檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化

近年來,隨著國內(nèi)外天然、健康市場消費理念的轉(zhuǎn)變,天然的含氧單萜類化合物的需求快速增長,以生物技術(shù)生產(chǎn)的香精香料被歐美及世界各國的食品法規(guī)界定為“天然的”[18]。因此,通過生物技術(shù)制備單萜芳香產(chǎn)品,是新產(chǎn)品開發(fā)的新的思路和方法。真菌、細(xì)菌、酵母、微藻都可以對檸檬烯進行生物轉(zhuǎn)化,其中真菌最多,細(xì)菌和微藻較少(表1)。

表1 檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化菌株及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 Table 1 The microorganisms used in limonene biotransformation and their biotransformation products

2.1 真菌對檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化

真菌是生物轉(zhuǎn)化檸檬烯常用的轉(zhuǎn)化菌種。真菌種類繁多、營養(yǎng)要求相對較低、易于培養(yǎng),是一種有效的生物轉(zhuǎn)化載體。其中青霉(Penicilliumsp.),黑曲霉(Aspergillussp.),尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是研究比較深入的轉(zhuǎn)化菌,已被廣泛應(yīng)用于檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的研究中。

2.1.1Penicilliumsp.對檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化Penicilliumsp.對檸檬烯的氧化作用主要集中于檸檬烯的C8位。Rottava等[19]分離得到一株沙門柏干酪青霉P.camembertiiATCC 4845能夠?qū)幟氏┺D(zhuǎn)化生成α-松油醇[(24.38±2.78) mg/L]。Badee等[20]利用指狀青霉P.digitatum(NRRL 1202)轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇。Molina等[21]從巴西水果中篩選分離出能夠氧化檸檬烯的Penicilliumsp.,將檸檬烯轉(zhuǎn)化生成α-松油醇。Tai等[10]研究P.digitatumDSM62840對檸檬烯的轉(zhuǎn)化作用,主要產(chǎn)物是α-松油醇,還有少量的香芹酮和香芹醇,并對該轉(zhuǎn)化過程進行優(yōu)化使得α-松油醇的產(chǎn)量達到833.93 mg/L。

2.1.2Aspergillussp.對檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化 Rottava等[19]從400株微生物中篩選分離得到3株黑曲霉能夠?qū)幟氏┺D(zhuǎn)化生成α-松油醇,分別是A.nigerATCC 16404[(15494.34±193.87) mg/L]、A.nigerATCC 9642[(688.13±41.27) mg/L]、A.nigerATCC 1004[(172.07±32.94) mg/L]。Molina等[21]從巴西水果中篩選分離出Aspergillussp.,能夠氧化檸檬烯生成香芹酮。Garcia-Carnelli[22]采用兩種培養(yǎng)基和培養(yǎng)體系研究A.niger對檸檬烯的轉(zhuǎn)化作用,主要產(chǎn)物是順式/反式-香芹醇、香芹酮、二氫香芹酮、紫蘇醇、α-松油醇。

2.1.3Fusariumoxysporum對檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化 Molina[2]等利用Fusariumoxysporum152B對R-(+)-和S-(-)-檸檬烯進行微生物轉(zhuǎn)化,結(jié)果顯示該菌株可以將S-(-)-檸檬烯轉(zhuǎn)化生成3.7 g/L的檸檬烯-1,2-二醇,將R-(+)-檸檬烯轉(zhuǎn)化生成4 g/L的α-松油醇。Bicas等[23]采用Fusariumoxysporum152B中產(chǎn)生堿性脂肪酶的過程與R-(+)-檸檬烯產(chǎn)生α-松油醇過程相結(jié)合的方法,得到2 g/Lα-松油醇。雖然α-松油醇產(chǎn)量有所下降,但同時能夠產(chǎn)生堿性脂肪酶,從工業(yè)應(yīng)用的角度來看,是一種好的方法。

2.1.4 酵母對檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化 除此之外,酵母也被用于檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化。Pinheiro和Marsaioli[24]利用皮狀絲孢酵母TrichosporumcutaneumCCT 1903全細(xì)胞轉(zhuǎn)化檸檬烯,產(chǎn)物為檸檬烯-1,2-二醇。Ferrara等[25]的研究發(fā)現(xiàn),解脂耶氏酵母YarrowialipolyticaATCC 18942對檸檬烯有羥基化作用,能將檸檬烯轉(zhuǎn)化生成紫蘇酸,產(chǎn)量最高達到855 mg/L。

2.1.5 其他真菌對檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化 內(nèi)生真菌指那些在其生活史中的某一定階段或全部階段生活在植物組織內(nèi)部,對宿主沒有造成明顯病害癥狀的真菌。它不僅能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的功能性代謝產(chǎn)物,也可以產(chǎn)生其他新類型的化合物。Bier等[26]從火炬松中分離得到一株內(nèi)生真菌擬莖點霉Phomopsissp.,在不同的培養(yǎng)條件下，能夠?qū)幟氏┺D(zhuǎn)化生成0.536 g/L香芹酮和2.08 g/L檸檬烯-1,2-二醇,還有少量的α-松油醇、香芹醇、薄荷醇。

此外,還有一些其他的真菌也可以用于檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化。Sales等[27]利用荷花炭疽菌Colletotrichumnymphaeae對R-(+)-和S-(-)-檸檬烯進行微生物轉(zhuǎn)化,主要產(chǎn)物是檸檬烯-1,2-二醇,產(chǎn)量可以達到3.34～4.01 g/L,這是目前文獻報道該產(chǎn)物產(chǎn)量最高的一種微生物。Trytek等[28]采用小被孢霉Mortierellaminutissima對檸檬烯進行轉(zhuǎn)化研究,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為紫蘇醇和紫蘇醛。并通過過氧化氫酶分解過氧化氫生成氧的方法,使得紫蘇醇的產(chǎn)量提高了3.6倍。

2.2 細(xì)菌對檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化

細(xì)菌轉(zhuǎn)化檸檬烯研究比較多的是假單胞菌Pseudomonassp.。Bicas等[29]利用熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens氧化檸檬烯生成檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物和α-松油醇。Chatterjee[30]發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌PseudomonasputidaMTCC 1072能夠高效的氧化檸檬烯生成紫蘇醇。Mirata等[31]也發(fā)現(xiàn)PseudomonasputidaDSM 12264能夠氧化檸檬烯的C7位,主要產(chǎn)物是紫蘇酸,并利用原位分離技術(shù)提高紫蘇酸的含量,使得紫蘇酸的含量在7 d之后達到31 g/L。Soares-Castro等[32]在研究假單胞菌Pseudomonassp. strain M1的轉(zhuǎn)化作用時,發(fā)現(xiàn)該菌株不僅可以將β-月桂烯轉(zhuǎn)化生成月桂烯醇,還可以將檸檬烯和α-蒎烯分別轉(zhuǎn)化生成檸檬烯-1,2-二醇和α-松油醇。

海洋微生物也擁有獨特的萜類合成的基因,有豐富的萜類合成酶。藍文健等[33]研究了南海海洋細(xì)菌嗜水性氣單胞菌Aeromonashydrophila和創(chuàng)傷弧菌Vibriovulnificus對檸檬烯的轉(zhuǎn)化作用,結(jié)果表明兩株海洋細(xì)菌都能對檸檬烯進行不同程度的氧化、還原、水解、酯化、開環(huán)等反應(yīng),生成香芹醇、檸檬烯-1,2-二醇、異薄荷烯醇、異薄荷烯酮。李厚金等[34]從南海大亞灣中篩選出3株對檸檬烯有顯著生物催化轉(zhuǎn)化作用的海洋細(xì)菌,分別是霍亂弧菌Vibriocholerae、美人魚李斯道菌Listonelladamsela和溶藻弧菌Vibrioalginolyticus,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要是紫蘇酸、檸檬烯-1,2-二醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇。

此外,鞘脂菌Sphingobiumsp.也被用于檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化。Bicas等[35]以葵花油作為有機相,利用雙相體系提高鞘脂菌Sphingobiumsp.轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇的產(chǎn)量,使得α-松油醇的產(chǎn)量最終達到130 g/L。

2.3 微藻類對檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化

微藻是一類重要的光合微生物,也被用于單萜類化合物的生物轉(zhuǎn)化。光能是微藻生長的唯一能量來源。因此,與其他微生物相比,微藻的大規(guī)模培養(yǎng)更為簡單和廉價。Ghasemi等[36]利用卵囊藻Oocystispusilla對單萜類化合物進行生物轉(zhuǎn)化,該藻類不僅能夠氧化檸檬烯生成反式-香芹醇、香芹酮以及反式-檸檬烯環(huán)氧化物,還原香芹酮的碳碳雙鍵生成順式/反式-二氫香芹酮,還能氧化香芹醇生成香芹酮和二氫香芹酮。

Rasoul-Amini等[37]利用海藻酸鈣固定小球藻Chlorellasp.、卵囊藻Oocystissp.、聚球藻Synechococcussp.和衣藻Chlamydomonassp.,發(fā)現(xiàn)所有的微藻都能轉(zhuǎn)化檸檬烯和香芹酮,其中檸檬烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有順式/反式-香芹醇、香芹酮以及順式/反式-檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物。香芹酮的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有順式/反式-二氫香芹酮、二氫香芹醇。

3 檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)酶

在對檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化進行深入研究的同時,發(fā)現(xiàn)存在一批有豐富的特異性酶的微生物。酶基因的分離、克隆、表達和調(diào)控已經(jīng)成為研究熱點。通過基因工程技術(shù),可望實現(xiàn)含氧單萜芳香化合物的工業(yè)化高效生產(chǎn)。在檸檬烯的轉(zhuǎn)化過程中有多種酶的參與,如:細(xì)胞色素P450酶、羥化酶,脫氫酶、環(huán)氧化酶、水合酶等(表2)。

3.1 細(xì)胞色素P450酶(CYPs)

CYPs是檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化中的常用酶,它是一類含有鐵血紅素的單加氧超家族,在細(xì)菌、真菌和高等生物中廣泛分布,具有轉(zhuǎn)化內(nèi)源性物質(zhì)(如膽固醇、類固醇、脂肪等)和催化外源性物質(zhì)(如藥物、環(huán)境物質(zhì))的功能[38]。

CYP153A6是從分枝桿菌Mycobacteriumsp. strain HXN-1500中分離得到[39],能夠特異性的羥基化檸檬烯的C7位置生成紫蘇醇。通常單萜類化合物都是由前體單元異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和其雙鍵異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)在香葉基焦磷酸合成酶(geranyl diphosphate synthase,GPPS)的作用下形成GPP。IPP和DMAPP是通過甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA)或丙酮酸磷酸甘油醛途徑(methylerythritol 4-phosphate,MEP)合成的。GPP在檸檬烯合成酶(limonene synthase,LS)的作用下可以形成檸檬烯。進一步的研究表明,以大腸桿菌為表達宿主,通過異源表達MVA、GPPS、LS以及CYP153A6,可以實現(xiàn)從簡單碳源到檸檬烯和紫蘇醇的轉(zhuǎn)化[40]。最終1%的葡萄糖可以產(chǎn)生435 mg/L的檸檬烯和105 mg/L紫蘇醇,這也意味著可以利用微生物酶和宿主去實現(xiàn)從簡單糖到價值更高的萜類化合物的生產(chǎn),為今后生物法合成萜類化合物提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。此外,Korman等[41]設(shè)計了一個體系,包括糖酵解途徑、MVA途徑以及單萜類合成酶等在內(nèi)的27個酶,實現(xiàn)從葡萄糖到各種單萜類化合物的轉(zhuǎn)化,并且該體系穩(wěn)定,能夠連續(xù)工作5 d以上。

CYP102A1(P450BM3)是一個可以自給自足的單加氧酶,包含一個血紅素結(jié)構(gòu)域,一個雙黃素還原酶結(jié)構(gòu)域和它們的連接區(qū)域。這個獨特的結(jié)構(gòu)使其具有比其他P450更高的催化及轉(zhuǎn)化效率。P450BM3不僅可以利用NADPH作為電子供體,催化長鏈脂肪酸近末端位置的羥化,還可以將檸檬烯轉(zhuǎn)化生成一系列的氧化產(chǎn)物。Seifert等[42]通過使用半理性的方法,使得檸檬烯C7位羥基化的選擇性高達97%。并且這種方法還可用于其它檸檬烯羥化酶的研究,比如地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis的CYP102A7[43]和白鏈霉菌Streptomycespeucetius的細(xì)胞色素CYP147F1[44]。其中CYP102A7不僅可以轉(zhuǎn)化脂肪酸,還可以轉(zhuǎn)化一些萜類化合物。它可以將檸檬烯轉(zhuǎn)化生成檸檬烯-8,9-環(huán)氧化物、檸檬烯-1,2-環(huán)氧化合物以及香芹醇[43]。

CYP101A1(P450cam)能夠催化單萜D-樟腦的羥基化作用,單孢氧還蛋白還原酶(putidaredoxin reductase,PdR)和假單孢氧還蛋白(iron-sulfur protein putidaredoxin,Pd)是P450cam的輔助蛋白,將完整的P450酶系(P450cam、PdR和Pd)在大腸桿菌中表達,能夠催化檸檬烯的羥基化作用,將檸檬烯催化生成紫蘇醇[45]。此外,P450cam也被報道能夠?qū)幟氏〤1,2位、C3位和C6位進行氧化。P450cam的底物通過氫鍵和疏水作用力同中心的互補氨基酸殘基相連,與血紅素催化中心的催化位點相結(jié)合,從而被P450cam氧化。Bell等[46]通過對P450cam進行定點突變,改變其活性位點的相關(guān)殘基,從而提高其對檸檬烯的催化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所有的突變體都能提高檸檬烯的催化活性,其中檸檬烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要是70%異薄荷烯醇,16%香芹醇和14%檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物。

此外,還有一些涉及在轉(zhuǎn)化過程中的酶尚在研究之中,尤其是對于檸檬烯的C8位氧化。Tan等[47]的研究發(fā)現(xiàn)加入鄰二氮雜菲和降低氧氣濃度后,α-松油醇的產(chǎn)率下降,但氰化物并沒有抑制作用,表明在轉(zhuǎn)化過程中是P450單加氧酶在起作用。Van等[11]用環(huán)己烷分離出一株黃色桿菌Xanthobactersp.C20,該菌株能夠?qū)幟氏┥蓹幟氏?8,9-環(huán)氧化物,認(rèn)為催化環(huán)己烷羥基化的單加氧酶并不能催化檸檬烯上的環(huán)己烯環(huán),而是發(fā)生環(huán)氧化。8,9位C=C環(huán)氧化,然后環(huán)氧化物“還原裂解”。環(huán)氧化反應(yīng)通常由P450依賴加單氧酶催化,檸檬烯-8,9-環(huán)氧化物被認(rèn)為是P.digitatum生物轉(zhuǎn)化檸檬烯為α-松油醇的一個中間物。研究表明P.digitatumNRRL1202、分子孢子菌Cladosporium和唐菖蒲假單胞菌Pseudomonasgladioli都有羥基化酶系的底物誘導(dǎo)效應(yīng)。而指狀青霉的誘導(dǎo)系統(tǒng)可能和其他真菌和酵母的羥基化系統(tǒng)一樣為P450單加氧酶系。Tai等[10]對P.digitatumDSM62840 轉(zhuǎn)化檸檬烯為α-松油醇的微生物轉(zhuǎn)化過程中的酶進行了初步研究,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該生物轉(zhuǎn)化的酶系具有對映體選擇性和可誘導(dǎo)性。并且加入氧化酶抑制劑鄰二氮雜菲和8-羥基喹啉后,該生物反應(yīng)均被抑制,初步認(rèn)為該生物轉(zhuǎn)化酶系可能為細(xì)胞色素P-450單加氧酶。Zhang等[48]利用iTRAQ技術(shù)研究P.digitatumDSM62840對檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的機制,對指狀青霉檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的不同時期(0和12 h)的蛋白進行比較,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450單加氧酶系被涉及在轉(zhuǎn)化過程當(dāng)中。

3.2 脫氫酶

PseudomonasputidaF1能夠通過異丙基苯甲酸途徑降解傘花烴,在異丙基苯單加氧酶(cymene monooxygenase)和兩個脫氫酶(枯醇脫氫酶和枯醛脫氫酶)的作用下能夠?qū)慊N轉(zhuǎn)化生成枯茗酸。而P.putidaGS1與P.putidaF1一樣,不僅可以利用傘花烴作為唯一的碳源和能量生長,并且可以將檸檬烯轉(zhuǎn)化生成紫蘇酸,在檸檬烯轉(zhuǎn)化為紫蘇酸的過程中同樣涉及兩個脫氫酶氧化中間產(chǎn)物紫蘇醇和紫蘇醛[9]。Cadwallader等[49]利用蔗糖梯度離心以及凝膠柱層析從P.gladioli中分離得到一個α-松油醇脫氫酶(α-terpineol dehydratase),結(jié)果表明,在1%的Triton X-100中,該酶以兩種形式存在,分別是分子量為94500 Da的單體和206500 Da的二聚體。Petasch等[50]發(fā)現(xiàn)解芳烴卡斯特蘭尼氏菌Castellanielladefragrans65Phen能夠氧化檸檬烯生成紫蘇類化合物,通過測定其基因組推測檸檬烯在檸檬烯脫氫酶(limonene dehydrogenase)、香葉醇脫氫酶(geraniol dehydrogenase)、香葉醛脫氫酶(geranial dehydrogenase)的作用下生成紫蘇酸。

3.3 羥化酶

腸桿菌Enterobactercowanii6L能夠利用檸檬烯作為唯一碳源和能量進行生長。攜帶E.cowanii6L的染色體片段(CD6-1和CD6-2)的大腸桿菌對檸檬烯有羥基化作用,編碼檸檬烯羥化酶,其中檸檬烯羥化酶CD6-1(limonene hydroxylase CD6-1)氧化檸檬烯生成紫蘇醇和γ-松油醇,檸檬烯羥化酶CD6-2(limonene hydroxylase CD6-2)氧化檸檬烯生成紫蘇醇和α-松油醇[51]。Lupien等[7]從薄荷(Mentha)植物中分離得到檸檬烯-3-羥化酶(limonene-3-hydroxylase)和檸檬烯-6-羥化酶(limonene-6-hydroxylase),分別能夠氧化檸檬烯的C3位和C6位,生成異薄荷烯醇和香芹醇。

3.4 環(huán)氧化物水解酶

Van等[52]從淡水沉積物樣品中分離得到的一株紅平紅球菌RhodococcuserythropolisDCL14,該菌株能夠利用檸檬烯作為唯一碳源和能量生長,并且能夠?qū)幟氏┺D(zhuǎn)化生成檸檬烯-1,2-二醇。利用凝膠柱和離子交換柱對其分離純化之后得到一個檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物酶(limonene-1,2-epoxide hydrolase,Re-LEH)[53]。推測在該菌株中存在檸檬烯C1,2位的代謝途徑,檸檬烯在1,2-單加氧酶(limonene-1,2 monooxygenase)的作用下引發(fā)1,2位C=C的環(huán)氧化得檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物,然后利用LEH轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的二醇[6]。

此外,膠紅酵母RhodotorulaglutinisCIMW 147也已經(jīng)被證明對幾種芳基、脂環(huán)族和脂肪族環(huán)氧化物有環(huán)氧化水解的作用,能夠水解檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物生成相應(yīng)的醇[54]。Johansson等[55]在結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis中發(fā)現(xiàn)一個環(huán)氧化物酶Mt-LEH,與 Re-LEH 結(jié)構(gòu)是相似的。Ferrandi等[56]收集了來自不同國家、不同溫度、不同pH的溫泉樣品,對其測序并進行分析,發(fā)現(xiàn)兩個LEH,分別是從來自托木斯克(Tomsk-LEH)和中國(CH55-LEH)的溫泉樣本中獲得的,Tomsk-LEH在氨基酸水平上與Mt-LEH有30%的相似,與Re-LEH 有25%的相似,CH55-LEH與 Mt-LEH 和 Re-LEH都有31%的相似。將其異源表達之后,都能將檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物生成相應(yīng)的二醇。

3.5 水合酶

嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusBR388能夠利用檸檬烯作為唯一碳源,將其轉(zhuǎn)化為α-松油醇和紫蘇醇。攜帶該菌株9.6 kb染色體片段的大腸桿菌也能以檸檬烯作為唯一碳源生長,并生成相同的產(chǎn)物,研究人員認(rèn)為該片段編碼一個檸檬烯水合酶(limonene hydratase),能夠轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇[57]。Bicas等[35]在研究鞘脂菌Sphingobiumsp.轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇的過程中發(fā)現(xiàn),厭氧條件更有利于α-松油醇的合成。這表明,涉及在轉(zhuǎn)化過程中的酶是一種輔因子獨立的、不可誘導(dǎo)的水合酶,而不是細(xì)胞色素P450依賴的單加氧酶系統(tǒng)。

3.6 其他酶類

此外,還有一些酶也是涉及在檸檬烯的轉(zhuǎn)化過程中。Trytek等[58]利用葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶氧化檸檬烯,主要產(chǎn)物為香芹酮,還有少量的檸檬烯-1,2-環(huán)氧化合物、香芹醇和二氫香芹醇。獲得香芹酮最佳的反應(yīng)條件是pH7.0,1.5%底物,50 ℃,反應(yīng)時間16～24 h(Trytek,2002)。Aguila等[59]發(fā)現(xiàn)海洋真菌Caldariomycesfumago通過氯過氧化物酶氧化檸檬烯生成檸檬烯-1,2-二醇。Groeneveld等[60]在對Pseudomonassp. PWD32的基因組進行分析時發(fā)現(xiàn)一個基因簇,編碼4個加氧酶,該加氧酶與異丙苯加氧酶(cumene dioxygenase)有很強的同源性,將其表達在PseudomonasputidaS12中能夠高效并且高度專一的氧化檸檬烯生成反式-香芹醇。

4 展望

食品的香氣和香味會增加人們的愉快感,引起人們的食欲,促進唾液分泌,增強人體對營養(yǎng)成分的消化和吸收,因而,香精、香料是食品中不可缺少的一部分。單萜類化合物是目前用得最多的香料,含氧單萜不僅具有獨特的芳香氣味,而且還具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等重要的藥理作用。在歷經(jīng)改革開放40年后,中國食品工業(yè)已站到了以安全、健康、環(huán)保為目標(biāo)的新起點上。食品行業(yè)不僅需要創(chuàng)新與提升食品科技水平,還需要考慮營養(yǎng)與健康的多方需求。而通過微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的風(fēng)味萜烯由于其“天然性”和抗菌、抗腫瘤等活性作用完全能適應(yīng)新的市場需求。

微生物轉(zhuǎn)化具有無需提純生物酶,酶液不易失活,反應(yīng)條件易控制等優(yōu)點。但其依然存在著不足。第一,由于高濃度單萜化合物對菌株的生長和代謝有抑制作用,產(chǎn)酶量下降。而這種抑制作用在液體環(huán)境中表現(xiàn)尤為明顯。因此工業(yè)生產(chǎn)中單萜底物的投料量不高,無法擴大生產(chǎn)。為獲得足夠的產(chǎn)物,需要多次分批發(fā)酵,這些都大大增加了人力成本及資源浪費。因此可以采用固體發(fā)酵技術(shù),但影響固體發(fā)酵的因素很多,要獲得穩(wěn)定高效的發(fā)酵工藝,還需要進一步的深入研究。第二,目前發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)菌種種類很少,因此高產(chǎn)菌種的篩選、馴化及其發(fā)酵工藝流程的探究,對于風(fēng)味萜烯的大批量工業(yè)化生產(chǎn)具有重大的意義。第三,通過微生物法獲得的單萜化合物中雜質(zhì)多,種類復(fù)雜,產(chǎn)物純化難,所以分離純化酶制劑將成為解決問題的關(guān)鍵。此外,不僅可以采用基因工程技術(shù)對關(guān)鍵酶進行定點突變,改變酶分子的結(jié)構(gòu),從而提高酶的活力,還可以運用基因重組技術(shù)獲得高表達關(guān)鍵酶的基因工程菌,通過短周期發(fā)酵得到轉(zhuǎn)化酶,對芳香單體進行定向轉(zhuǎn)化。第四,微生物轉(zhuǎn)化底物價格相對較高,增加成本,因此選用豐富而價廉的原材料進行微生物發(fā)酵將更具有應(yīng)用前景。通過合適的酶,以酶促技術(shù)結(jié)合葡萄糖為底物發(fā)酵,降低生產(chǎn)成本,滿足消費者和生產(chǎn)商的需要,是一項切實可行的技術(shù)。