王淑惠,羅旭洸,王 爽,周愛(ài)梅,曹 庸

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心, 廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642)

藍(lán)圓鲹(Decapterusmaruadsi),又稱(chēng)為巴浪魚(yú)、池魚(yú),為鲹科(Carangidae)圓鲹屬(Decapterus),其廣泛分布于中國(guó)南海、東海和臺(tái)灣海域,是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一[1-2],具有形體小、產(chǎn)量大、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[3],其中藍(lán)圓鲹粗蛋白干重含量為80.16%,粗脂肪干重含量為10.38%[4]。但藍(lán)圓鲹的漁獲期在夏季,魚(yú)體顏色深,容易發(fā)生腐敗產(chǎn)生不愉快的氣味,因此常被丟棄或者加工成魚(yú)粉或肥料等低值副產(chǎn)品[5]。越來(lái)越多的研究報(bào)道,將低值海洋魚(yú)類(lèi)加工成高價(jià)值的產(chǎn)品,如魚(yú)糜以及具有生物活性的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物,有利于充分開(kāi)發(fā)海洋資源[6-9]。目前對(duì)藍(lán)圓鲹的開(kāi)發(fā)利用尚不充分,若能將藍(lán)圓鲹的資源進(jìn)行綜合利用,將具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。

低溫連續(xù)相變萃取[10]是在超臨界、亞臨界萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上由本研究團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的一種新型食品加工技術(shù),萃取時(shí)在較低的溫度下進(jìn)行,可以對(duì)物料進(jìn)行連續(xù)的逆流萃取,且不會(huì)對(duì)樣品中的目標(biāo)成分和熱敏性成分造成損害,得到的萃取殘?jiān)軇埩羯?富含蛋白質(zhì)[11]。目前關(guān)于低溫連續(xù)相變萃取魚(yú)油后對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究利用該技術(shù)提取魚(yú)油后得到的脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉作為原料,研究該技術(shù)對(duì)脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是反映蛋白質(zhì)是否發(fā)生變性的重要體現(xiàn)[12],某些物理、化學(xué)因素都會(huì)使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化,從而導(dǎo)致其生物活性的喪失[13]。基于此,本文采用傅里葉紅外光譜、圓二色光譜兩種方法來(lái)表征低溫連續(xù)相變萃取技術(shù)對(duì)脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉中的蛋白質(zhì)微觀(guān)結(jié)構(gòu)變化,并進(jìn)一步以脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉為原料,利用堿性蛋白酶制備抗氧化肽,優(yōu)化其制備工藝,為藍(lán)圓鲹的綜合利用提供有益的參考。因此,對(duì)脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉進(jìn)行加工利用對(duì)南海低值魚(yú)高值化綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藍(lán)圓鲹 廣州市天河區(qū)長(zhǎng)湴市場(chǎng);丁烷(99.99%) 廣州深巖燃?xì)庥邢薰?堿性蛋白酶(1.925×105U/g) 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基) 美國(guó)Simga-Aldrich貿(mào)易有限公司;其余試劑 均為分析純。

LSC-60D型水分測(cè)定儀 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;HYP-308型消化爐、KDN-103F型凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;SRJX-8-13型高溫馬弗爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng);DHG-970型鼓風(fēng)干燥箱 上海齊心科學(xué)儀器有限公司;3L、21L低溫連續(xù)相變萃取裝置 珠海共同機(jī)械有限公司;VERTEX 70型傅立葉紅外光譜儀 德國(guó)BRUKER;AL104型萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;Chirascan型圓二色光譜分析儀 英國(guó)應(yīng)用光物理公司;Enspire2300酶標(biāo)儀 美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的制備 將去除內(nèi)臟部分的新鮮藍(lán)圓鲹在45 ℃烘箱內(nèi)干燥至含水量為10%左右,粉碎后過(guò)120目篩得到藍(lán)圓鲹魚(yú)粉。參照楊小斌等[14]的方法,利用低溫連續(xù)相變技術(shù)提取藍(lán)圓鲹魚(yú)油,得到的萃取殘?jiān)礊槊撝{(lán)圓鲹魚(yú)粉,過(guò)120目篩后用于后續(xù)研究。

1.2.2 基本成分分析 分別對(duì)新鮮藍(lán)圓鲹、藍(lán)圓鲹魚(yú)粉和脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪等基本成分進(jìn)行測(cè)定。其中水分的測(cè)定采用直接干燥法,具體操作按照國(guó)標(biāo)GB 5009.3-2010食品中水分的測(cè)定[15];灰分的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB 5009.4-2010食品中灰分的測(cè)定[16];蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法,具體操作按照國(guó)標(biāo)GB 5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[17];粗脂肪的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB 5009.6-2016食品中粗脂肪的測(cè)定[18]。

1.2.3 傅里葉變換紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法[19],對(duì)脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉和藍(lán)圓鲹魚(yú)粉采用傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外掃描分析。將樣品置于40 ℃烘箱中充分干燥至恒重,取1 mg恒重樣品與100 mg溴化鉀混合研磨進(jìn)行壓片,以100 mg溴化鉀磨碎進(jìn)行壓片作為空白背景,進(jìn)行全波段(4000～400 cm-1)掃描,每次試驗(yàn)對(duì)信號(hào)進(jìn)行32次掃描,分辨率為4 cm-1,扣除背景后得到紅外光譜圖。利用OMNIC數(shù)據(jù)處理軟件校正,限制譜帶范圍為1600～1700 cm-1[20];用Peakfit軟件將譜圖進(jìn)行兩點(diǎn)基線(xiàn)校正,再進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合。根據(jù)各指認(rèn)峰積分面積計(jì)算出各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量。

1.2.4 圓二色譜測(cè)定 對(duì)脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉和藍(lán)圓鲹魚(yú)粉進(jìn)行溶解,配制成濃度為0.2 mg/mL的樣品溶液。設(shè)置圓二色儀器的溫度為24.7 ℃,掃描范圍為190～260 nm,將樣品放置于1 mm的比色皿中,放入圓二色譜儀中進(jìn)行掃描,得到去除背景的圓二色的光譜曲線(xiàn)[21]。

1.2.5 堿性蛋白酶酶解脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉制備抗氧化肽的研究

1.2.5.1 酶解工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 以DPPH自由基清除率為指標(biāo),研究溫度、pH、料液比和加酶量對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響。

固定反應(yīng)條件:料液比為1∶30 (w/v),加酶量為8000 U/g·pro,pH9.0,酶解時(shí)間為6 h,考察不同溫度45、50、55、60、65 ℃對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響。

固定反應(yīng)條件:料液比為1∶30 (w/v),加酶量為8000 U/g·pro,溫度為55 ℃,酶解時(shí)間為6 h,考察不同pH8.5、9.0、9.5、10.0、10.5對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響。

固定反應(yīng)條件:溫度為55 ℃,加酶量為8000 U/g·pro,pH9.5,酶解時(shí)間為6 h,考察不同料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50 (w/v)對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響。

固定反應(yīng)條件:溫度為55 ℃,料液比為1∶30 (w/v),溫度為55 ℃,pH9.5,酶解時(shí)間為6 h,考察不同加酶量2000、4000、6000、8000、10000 U/g·pro對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響。

1.2.5.2 酶解工藝的正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,料液比、酶解溫度、加酶量這三個(gè)因素是影響抗氧化指標(biāo)的主要因素,選擇確定的pH9.5,以DPPH自由基清除率為指標(biāo),設(shè)計(jì)L9(34)正交表,實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental

1.2.6 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參照Sampath等[22]的方法,并適當(dāng)改進(jìn)。吸取100 μL待測(cè)液于96孔板中,加入100 μL DPPH溶液(0.2 mmol/L,溶于95%乙醇),混合均勻后,于室溫下避光放置30 min,隨后在517 nm處測(cè)定其吸光值,記為A1,將100 μL DPPH溶液和100 μL 95%乙醇混合,其它操作同A1,記為A0;將100 μL待測(cè)液和100 μL 95%乙醇混合,其它操作同A1,記為A2;按照下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中:A0表示100 μL 95%乙醇+100 μL DPPH溶液的吸光值;A1表示100 μL待測(cè)液+100 μL DPPH溶液的吸光值;A2表示100 μL待測(cè)液+100 μL 95%乙醇的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示,采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,Origin 8.5軟件作圖,peakfit軟件處理傅里葉紅外數(shù)據(jù),CDNN分析圓二色譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分分析

由表2可以看出,新鮮藍(lán)圓鲹中主要為水分,約占原料中的77.87%,其余主要為蛋白質(zhì)(17.17%)及脂肪(3.53%);而在對(duì)新鮮藍(lán)圓鲹進(jìn)行干燥后,蛋白質(zhì)及脂肪成為原料中主要成分,約占80%～86%;脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的主要成分為蛋白質(zhì)(88.78%),顯著高于新鮮藍(lán)圓鲹(17.17%)及藍(lán)圓鲹魚(yú)粉(73.81%)樣品中的蛋白質(zhì)含量(p<0.05)。脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉中灰分為4.29%,顯著高于新鮮藍(lán)圓鲹中灰分(1.05%)含量(p<0.05),原因可能是藍(lán)圓鲹在提取魚(yú)油后其無(wú)機(jī)物如礦物質(zhì)的含量殘留多。上述結(jié)果說(shuō)明,藍(lán)圓鲹經(jīng)低溫連續(xù)相變技術(shù)提取魚(yú)油后,其脫脂魚(yú)粉富含蛋白質(zhì),可進(jìn)一步綜合利用。

表2 藍(lán)圓鲹脫脂前后基本成分比較Table 2 Comparison of basic components before and after defatting of Decapterus maruadsi

2.2 傅里葉紅外光譜分析

紅外光譜的定量分析依據(jù)是比耳定律,由于不同基團(tuán)振動(dòng)頻率的吸光度系數(shù)差異不同,故而不同基團(tuán)的特征吸收峰就相差很大。因此傅里葉紅外光譜可以用于測(cè)定物質(zhì)特性及其相互作用,分析低溫連續(xù)相變對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響,其傅里葉變換紅外光譜分析如圖1所示。

圖1 藍(lán)圓鲹魚(yú)粉脫脂前后的紅外光譜Fig.1 FT-IR spectrum of before and after defatting Decapterus maruadsi powder注:A:脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉;B:藍(lán)圓鲹魚(yú)粉。

通過(guò)紅外光譜的掃描分析,可以顯示出各物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和具有特征性的化學(xué)鍵。從圖1可以看出,藍(lán)圓鲹魚(yú)粉脫脂前的圖譜與藍(lán)圓鲹魚(yú)粉脫脂后的圖譜基本相似,主要區(qū)別就是特征峰的峰高和峰面積有所不同,它們兩者都在3600～3100 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)大波段吸收峰,說(shuō)明里面都含有大量的具有伸縮振動(dòng)的吸收峰-OH,由于-OH是個(gè)強(qiáng)極性基團(tuán),因此羥基化合物的締合現(xiàn)象非常顯著;1690～630 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰,由于氮原子上未共用電子對(duì)與羰基的鍵進(jìn)行共軛,從而使其在此范圍內(nèi)有振動(dòng);1650～500 cm-1為N-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰;1440～360 cm-1為-COO的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng),強(qiáng)度弱于反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收,并且常是兩個(gè)或三個(gè)較寬的峰。1330～1050 cm-1為C-O-C的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰。1140～1030 cm-1為C-O的酯類(lèi)伸縮振動(dòng)吸收峰;在1250～800 cm-1范圍內(nèi),是C-C的震動(dòng),特征性不強(qiáng)。與脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉相比,藍(lán)圓鲹魚(yú)粉在2929.42與1739.28 cm-1處有峰值的變化,在2975～2845 cm-1范圍內(nèi)是飽和的C-H伸縮振動(dòng),也包括甲基、亞甲基和次甲基的對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng);在1740～1720 cm-1范圍內(nèi),是羰基的伸縮振動(dòng)。除此之外,其余的特征峰沒(méi)有太大不同,只是峰面積不同。由此可以初步斷定,藍(lán)圓鲹魚(yú)粉在經(jīng)過(guò)低溫連續(xù)相變技術(shù)脫脂后,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化。

肽鍵作為一種酰胺鍵,它在紅外光區(qū)有其特征吸收峰。酰胺Ⅰ的吸收峰范圍是1700～1600 cm-1;酰胺Ⅱ的吸收峰范圍是1550～1450 cm-1;酰胺Ⅲ的吸收峰范圍是1300～1200 cm-1[23]。在研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化中,酰胺Ⅰ帶主要包含了C=O的伸縮振動(dòng),這對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化十分敏感,對(duì)于研究蛋白質(zhì)二級(jí)是否發(fā)生變化很有價(jià)值[24]。為了進(jìn)一步研究低溫連續(xù)相變技術(shù)對(duì)藍(lán)圓鲹魚(yú)粉中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,利用去卷積方法對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行擬合,結(jié)果如圖2～圖3所示。

圖2 藍(lán)圓鲹魚(yú)粉酰胺I帶的紅外(上)和高斯曲線(xiàn)擬合圖譜(下)Fig.2 Decapterus maruadsi powder FTIR spectrum of amide I(up)and Gaussian multiple peaking fitting analysis for the peaks(down)

圖3 脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉酰胺I帶的紅外(上)和高斯曲線(xiàn)擬合圖譜(下)Fig.3 Defatted Decapterus maruadsi powder FTIR spectrum of amide I(up)and Gaussian multiple peaking fitting analysis for the peaks(down)

采用高紅艷等[25]的譜帶指認(rèn)進(jìn)行確定指認(rèn)范圍:1610～1640 cm-1為β-折疊;1650～1660 cm-1為α-螺旋;1640～1650 cm-1為無(wú)規(guī)則卷曲;1660～1695 cm-1為β-轉(zhuǎn)角,譜帶指認(rèn)結(jié)果如表3所示。

由圖2～圖3和表3可知,藍(lán)圓鲹魚(yú)粉中的蛋白質(zhì)包含四種結(jié)構(gòu):β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角。α-螺旋和β-折疊屬于相對(duì)規(guī)則的構(gòu)象,多數(shù)存在于蛋白質(zhì)的內(nèi)部,這兩種結(jié)構(gòu)中分布著較多的氫鍵,能與其它基團(tuán)發(fā)生氫鍵鍵合,使得蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于規(guī)則,從而具有一定的剛性,β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲中不存在氫鍵或其它相互作用,使分子表現(xiàn)出較大的柔性[26]。與藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的蛋白相比,脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的蛋白中β-折疊含量減小了0.52%,無(wú)規(guī)則卷曲減少了0.22%,α-螺旋增加了0.55%,β-轉(zhuǎn)角增加了0.09%。有學(xué)者研究,在一般情況下,蛋白質(zhì)會(huì)隨著溫度的改變,α-螺旋的含量會(huì)大幅度變化[27],而在經(jīng)過(guò)低溫連續(xù)相變技術(shù)提取魚(yú)油之后,脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的蛋白中α-螺旋僅增加了0.55%,說(shuō)明在此溫度條件下,蛋白質(zhì)分子之間并沒(méi)有發(fā)生反應(yīng),故而氫鍵作用力并沒(méi)有被破壞[28]。經(jīng)過(guò)低溫連續(xù)相變提取魚(yú)油之后得到的脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉,其蛋白的剛性結(jié)構(gòu)從50.42%增加了50.55%,柔性結(jié)構(gòu)從49.58%減少到49.45%,說(shuō)明低溫連續(xù)相變技術(shù)可以使藍(lán)圓鲹蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于規(guī)則,其剛性增加,穩(wěn)定性也有明顯提高。

2.3 圓二色光譜分析

圓二色譜(CD)是一種電子吸收光譜,也是研究溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種比較快速且簡(jiǎn)單的方法,通過(guò)圖譜可以得到其手性特征,可以根據(jù)在190～260 nm處的吸收值可以得出其內(nèi)部的二級(jí)結(jié)構(gòu),該技術(shù)在食品中已廣泛應(yīng)用。將藍(lán)圓鲹魚(yú)粉溶液及脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉溶液放入圓二色譜儀中進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果如圖4所示,從圖4中可以得出,兩者的CD譜圖相差不大,在經(jīng)過(guò)低溫連續(xù)相變技術(shù)提取魚(yú)油之后,脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的蛋白保持了完整的三級(jí)結(jié)構(gòu),且結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯變化。

經(jīng)過(guò)CDNN軟件分析得知,藍(lán)圓鲹魚(yú)粉及脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的蛋白均含有四種二級(jí)結(jié)構(gòu),其組成如圖5所示。從圖中可以看出,藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含有β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角四種。其中,在β折疊中,由于氫鍵幾乎都垂直于伸展的肽鏈,這些肽鏈分為平行排列(走向由N到C方向),或者是反平行排列。藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的蛋白反平行排列所占比例較高,說(shuō)明藍(lán)圓鲹魚(yú)粉中的蛋白主要是由氫鍵進(jìn)行連接的。從圖5中可以看出,藍(lán)圓鲹魚(yú)粉在提取魚(yú)油后其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中各比例基本處于不變的狀態(tài),說(shuō)明其肽鏈中主鏈原子的局部空間排布沒(méi)有發(fā)生改變,即空間構(gòu)象沒(méi)有變化,因而也從微觀(guān)上驗(yàn)證了藍(lán)圓鲹魚(yú)粉在經(jīng)過(guò)低溫連續(xù)相變技術(shù)提取魚(yú)油后,其蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生改變。

圖5 藍(lán)圓鲹魚(yú)粉脫脂前后的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例Fig.5 Proportion of the secondary structure of before and after defatting Decapterus maruadsi powder注:不同字母表示差異顯著(p<0.05);圖6～圖9同。

2.4 脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 溫度對(duì)酶解液DPPH自由基清除率的影響 由圖6可知,隨著溫度的增加,酶解液中的DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),在溫度為55 ℃下達(dá)到最大值(85.67%),超過(guò)55 ℃時(shí),其清除率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(p<0.05)。這表明在酶促反應(yīng)中,酶分子不斷吸收能量,當(dāng)溫度持續(xù)升高,酶分子的次級(jí)鍵因吸收過(guò)多能量而斷裂,導(dǎo)致酶蛋白結(jié)構(gòu)變性,酶活性喪失,并且藍(lán)圓鲹蛋白自身也發(fā)生變性,使得生成的抗氧化肽減少,DPPH自由基清除率降低[29];同時(shí)溫度從55 ℃上升至70 ℃,導(dǎo)致已生成的具有較好抗氧化活性多肽被降解,抗氧化活性變?nèi)?從而致使DPPH自由基清除率下降[30]。張建賀等[31]在利用堿性蛋白酶酶解苜蓿葉蛋白時(shí)得到同樣的結(jié)果,當(dāng)酶解溫度為55 ℃時(shí),得到的苜蓿葉蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除率最高。因此,選擇酶解溫度為55 ℃。

圖6 溫度對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of temperature on DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate

2.4.2 pH對(duì)酶解液DPPH自由基清除率的影響 堿性蛋白酶的最適pH范圍是8～10,其催化能力與環(huán)境的pH有密切關(guān)系,而pH的變化也會(huì)影響酶反應(yīng)中酶分子和底物之間的解離狀態(tài),從而影響酶解反應(yīng)速率[32-33]。由圖7可知,酶解液的DPPH自由基清除率隨著pH的增加而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),在pH為9.5時(shí)達(dá)到最大值(85.89%),但在pH為9.0～10.0之間的值差異不顯著(p>0.05)。說(shuō)明當(dāng)pH大于9.5時(shí),堿性蛋白酶的活性降低,導(dǎo)致酶的催化效率下降,降低DPPH自由基清除率。因此,選擇pH9.5為最佳酶解pH。

圖7 pH對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of pH on DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate

2.4.3 料液比對(duì)酶解液DPPH自由基清除率的影響 料液比的不同,對(duì)酶反應(yīng)的最佳結(jié)果也不盡相同。由圖8可知,隨著料液比的增加,酶解液中的DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),且在料液比為1∶30 (w/v)達(dá)到最大值(86.87%),與其他料液比條件下的值相比有顯著性差異(p<0.05)。由于初始底物濃度過(guò)高,過(guò)量的底物大量集聚在酶分子表面,降低酶解的效率,DPPH自由基清除率低;當(dāng)料液比為1∶30 (w/v)時(shí),底物濃度適中,酶的催化效率最高,DPPH自由基清除率最高;而當(dāng)液體的量逐漸增加時(shí),底物濃度和酶的濃度都在降低,使酶解效率下降[34],從而導(dǎo)致DPPH自由基清除率又下降。因此,確定酶解的最佳料液比為1∶30 (w/v)。

圖8 料液比對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Effect of ratio of water to material on DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate

2.4.4 加酶量對(duì)酶解液DPPH自由基清除率的影響 一般認(rèn)為,酶反應(yīng)過(guò)程中加酶量的不同,其反應(yīng)速度也呈現(xiàn)相應(yīng)的變化,且成正相關(guān)的變化。由圖9可知,在加酶量為4000～6000 U/g·pro范圍內(nèi),隨著加酶量的增加,DPPH自由基清除率增加差異不明顯(p>0.05),當(dāng)加酶量為8000 U/g·pro時(shí),酶解液中的DPPH自由基清除率達(dá)到最大值(86.67%)。結(jié)果表明,當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r(shí),酶促反應(yīng)速率隨著加酶量的增加而增加。當(dāng)酶濃度增大到一定濃度時(shí),反應(yīng)體系中底物消解達(dá)到飽和,酶解效率將不再上升甚至?xí)档汀Ｍ瑫r(shí),過(guò)多的酶會(huì)酶解生成的多肽,與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)蛋白酶的作用位點(diǎn),進(jìn)而被水解為寡肽或氨基酸,所以當(dāng)加酶量增加到8000 U/g·pro時(shí),酶解液的DPPH自由基清除率開(kāi)始下降,由此可推斷具有較強(qiáng)抗氧化活性的多肽其氨基酸構(gòu)成較多,而非寡肽或氨基酸[34]。因此,選擇最適加酶量為8000 U/g·pro。

圖9 加酶量對(duì)酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.9 Effect of the amount of enzyme on DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,料液比、溫度和加酶量是影響藍(lán)圓鲹抗氧化肽DPPH自由基清除率的主要因素。從圖7中可看出,在pH分別為9.0、9.5和10.0時(shí),DPPH自由基清除率沒(méi)有顯著性差異,但在pH9.5時(shí)自由基清除率最高。故選取確定的pH9.5,選擇料液比、溫度和加酶量三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析

為了得到DPPH自由基清除率最高的脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉的蛋白酶解物,在堿性蛋白酶酶解單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行最適水解條件的優(yōu)化,選擇料液比(A)、酶解溫度(B)、加酶量(C)三個(gè)因素為考察指標(biāo),采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定酶解時(shí)間為6 h,pH為9.5,進(jìn)行抗氧化肽的最佳酶解工藝優(yōu)化,正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 L9(3)4 orthogonal experiment result table

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知,不同因素對(duì)酶解液中抗氧化活性的影響為:A>B>C。以DPPH自由基清除率為指標(biāo),得出最佳的酶解方案為A1B1C2,即在酶解料液比為1∶25 (w/v),酶解溫度為50 ℃,加酶量為8000 U/g·pro時(shí),在此條件下的DPPH自由基清除率最高,達(dá)到89.99%±0.13%,因此選擇此條件進(jìn)行酶解制備脫脂藍(lán)圓鲹抗氧化肽。

3 結(jié)論

本文首次研究了采用低溫連續(xù)相變萃取技術(shù)提取藍(lán)圓鲹魚(yú)油后萃取殘?jiān)幕境煞趾偷鞍踪|(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化,并利用堿性蛋白酶酶解制備藍(lán)圓鲹抗氧化肽。紅外光譜圖結(jié)果顯示,藍(lán)圓鲹魚(yú)粉在脫脂后,其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的剛性結(jié)構(gòu)與柔性結(jié)構(gòu)與未脫脂相比變化不大,且使得蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定的狀態(tài);而圓二色的結(jié)果進(jìn)一步表明,脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉中的蛋白質(zhì)內(nèi)部的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊及無(wú)規(guī)卷曲含量并未發(fā)生明顯變化,因此也驗(yàn)證了該提取技術(shù)對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有影響。采用堿性蛋白酶對(duì)脫脂藍(lán)圓鲹魚(yú)粉進(jìn)行酶解制備抗氧化肽,通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化,得到最佳酶解工藝條件:料液比為1∶25 (w/v),酶解溫度為50 ℃,加酶量為8000 U/g·pro時(shí),在此條件下酶解物的DPPH自由基清除率最高,達(dá)到89.99%±0.13%。由此可知,利用低溫連續(xù)相變技術(shù)提取藍(lán)圓鲹魚(yú)油后,其萃取殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)與活性沒(méi)被破壞,使殘?jiān)玫骄C合利用,提高藍(lán)圓鲹的加工價(jià)值,為進(jìn)一步研究藍(lán)圓鲹蛋白的結(jié)構(gòu)與其生物活性功能奠定了基礎(chǔ)。