王繼鋒，石侃，安瑋，余東亮,4，劉樹文,2,3*，何玲

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌，712100) 2(陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌，712100) 3(陜西省合陽葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 渭南，715300) 4(秦皇島金士國際葡萄酒莊有限公司，河北 昌黎，066600) 5(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌，712100)

葡萄酒主要經(jīng)歷2個(gè)發(fā)酵過程：酒精發(fā)酵(alcohol fermentation, AF)和蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation, MLF)[1]，其中蘋果酸-乳酸發(fā)酵是由酒酒球菌主導(dǎo)進(jìn)行，有降低酸度、改善風(fēng)味、增加生物穩(wěn)定性的作用[2-3]。自然蘋果酸-乳酸發(fā)酵的葡萄酒由于多種微生物共同作用，可能存在生物胺含量過高、揮發(fā)酸含量過高等問題[4-5]。為了避免這些問題，可在生產(chǎn)過程中使用酒酒球菌發(fā)酵劑[6-7]。冷凍干燥是制備酒酒球菌發(fā)酵劑的常用方法，但菌體容易受到損傷而導(dǎo)致活力下降[8-9]，若在冷凍干燥過程中添加冷凍干燥保護(hù)劑則能有效降低菌體損傷，維持活力[10]。目前，我國關(guān)于酒酒球菌發(fā)酵劑及其冷凍干燥保護(hù)劑的研究較少，且過度依賴進(jìn)口發(fā)酵劑，因此研究冷凍干燥保護(hù)劑對酒酒球菌發(fā)酵劑的發(fā)展有重要意義。

許多微生物在生長代謝過程中都能分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)，研究顯示，EPS可以提高微生物在逆境中的抗性[11]。某些微生物自身產(chǎn)生的EPS能顯著提高其對反復(fù)冷凍的抗性[12-14]。KIM等[15]從北極分離得到的細(xì)菌Pseudoalteromonaselyakovii所產(chǎn)的EPS能顯著提高大腸桿菌的冷凍抗性。酒酒球菌產(chǎn)EPS可以增加葡萄酒香氣種類，并能明顯提高細(xì)菌的逆境抗性[16]，具有成為冷凍干燥保護(hù)劑的潛力[17-18]。EPS的形成受到許多因素的影響，包括碳源、氮源、初始pH等[19-20]，不同的碳氮組合顯著影響細(xì)菌EPS的產(chǎn)量[21]，且不同的乳酸菌產(chǎn)EPS所需條件具有菌株依賴性[22]。

本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏的優(yōu)良釀酒菌株中篩選得到1株高產(chǎn)EPS的酒酒球菌，針對該菌株產(chǎn)EPS的培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高EPS的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

酒酒球菌(Oenococcusoeni)28A-1,西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

ATB培養(yǎng)基的制備參照參考文獻(xiàn)[23]。

1.2 方法

1.2.1 酒酒球菌活化

取-80 ℃保藏的菌株接入ATB培養(yǎng)基，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接2次，待用。

1.2.2 EPS提取及產(chǎn)量測定

參照DIMOPOULOU等[24]的方法操作，稍有改動(dòng)。將培養(yǎng)2周的菌液離心(8 000×g，10 min)取上清，加入3倍體積95%的乙醇在4 ℃冰箱中存放過夜，離心(8 000×g，10 min)取沉淀，冷凍干燥獲得酒酒球菌EPS。采用重量法測定EPS產(chǎn)量。

1.2.3 培養(yǎng)基條件對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響

分別改變1.1.2中ATB培養(yǎng)基的pH值(3.8、4.3、4.8、5.3、5.8)，氮源種類(胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨和牛肉膏)及碳源種類(木糖、乳糖、蔗糖、果糖和葡萄糖)，將1.2.1活化后的酒酒球菌以4%接種量接種于不同培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基中，按照1.2.2的方法測定酒酒球菌EPS的產(chǎn)量。選取最優(yōu)氮源和碳源后，研究氮源含量(5、10、15、20、25 g/L)和碳源含量(5、10、15、20、25 g/L)對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響。

培養(yǎng)基中的初始pH值、葡萄糖含量和蛋白胨含量對酒酒球菌生長代謝有重要影響，只有3者達(dá)到最適條件才能使酒酒球菌的活力達(dá)到最佳，EPS的產(chǎn)量達(dá)到最大。因此，以單因素試驗(yàn)中最優(yōu)的初始pH、葡萄糖含量和蛋白胨含量進(jìn)行對EPS產(chǎn)量影響的L9(33)正交試驗(yàn)，按照1.2.2的方法測定酒酒球菌EPS的產(chǎn)量，確定3個(gè)因素的最優(yōu)組合。

1.2.4 冷凍干燥存活率

具體參照ZHAO等[17]的方法操作，稍有改動(dòng)。取10 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液離心(8 000×g，10 min)去上清，用無菌生理鹽水洗滌2次。加入冷凍干燥保護(hù)劑1 mL混勻，于-80 ℃冰箱過夜后放入真空冷凍干燥機(jī)處理24 h，溫度為-55 ℃，真空度<0.06 mbar。真空冷凍干燥前后活菌數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法檢測，如公式(1)。

(1)

式中：Nf,真空冷凍干燥后菌懸液活菌數(shù),CFU/mL;N0,真空冷凍干燥前菌懸液活菌數(shù),CFU/mL。

1.2.5 冷凍干燥保護(hù)劑對酒酒球菌抗冷凍干燥能力的影響

參考張國強(qiáng)[25]的方法操作，確定將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%蔗糖、10%甘露糖、10%海藻糖、10%葡萄糖、10%乳糖、5%酵母浸粉、5%甘露醇、5%EPS、2.5%谷氨酸鈉和1.1.2中的ATB培養(yǎng)基分別作為冷凍干燥保護(hù)劑，加入離心洗滌后的菌泥中，以水作為對照組，按照1.2.4的方法檢測酒酒球菌冷凍干燥存活率。

1.2.6 場發(fā)射掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察

通過場發(fā)射掃面電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察冷凍干燥前后酒酒球菌細(xì)胞表面的變化。冷凍干燥前的樣品需離心(8 000×g，10 min)以收集穩(wěn)定期前期的酒酒球菌，用無菌水洗滌3次，懸浮在體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛中,4 ℃隔夜固定后用2 mL 0.1 mol/L的PBS(pH 6.8)緩沖液浸洗4次，每次10 min。浸洗完成進(jìn)行細(xì)胞脫水，用體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液各浸1次，每次15～20 min，最后用100%的乙醇浸3次，每次30 min。接著干燥細(xì)胞4 h，噴金后使用掃描電子顯微鏡(Nova Nano SEM-450 美國)進(jìn)行觀察。冷凍干燥后的樣品可直接噴金進(jìn)行觀察，無需前處理。

通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察冷凍干燥前后酒酒球菌細(xì)胞內(nèi)部的變化。所有樣品在脫水之前(包括脫水)的操作與TEM一致，脫水后將細(xì)菌懸浮在白膠∶乙醇(1∶1)中過夜后懸浮在白膠中處理2次，分別為3和6 h。在60 ℃條件下固定48 h，進(jìn)行切片，染色，最后使用透射電子顯微鏡(TECNAI G2 SPIRIT BIO美國)進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0 分析軟件(上?？ㄘ愋畔⒓夹g(shù)有限公司)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基條件對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基初始pH值、碳源、氮源對微生物生長及產(chǎn)物代謝均有重要的影響，對其進(jìn)行優(yōu)化可以顯著提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 初始pH

酒酒球菌是一種耐受低酸環(huán)境的細(xì)菌，能夠在葡萄酒酒精發(fā)酵后的低酸環(huán)境中進(jìn)行MLF[15]。因此，將初始pH值控制在3.8～5.8。由圖1可知，酒酒球菌EPS產(chǎn)量隨著初始pH值的升高先升高后降低，且當(dāng)初始pH值為4.3時(shí)，EPS產(chǎn)量最高(96.3 mg/100 mL)。說明優(yōu)化初始pH值能明顯提高酒酒球菌EPS的產(chǎn)量。在其他乳酸菌產(chǎn)EPS的研究中，干酪乳桿菌在初始pH值為6.5時(shí)產(chǎn)生的EPS量比其他試驗(yàn)組有明顯提高[26]，同樣德氏乳桿菌在不同的初始pH值下所產(chǎn)生EPS的量也有明顯差異[27]。

圖1 初始pH值對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響

Fig.1 Effects of initial pH value on EPS production of Oenococcus oeni

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.1.2 氮源種類及氮源含量

氮元素作為構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸的主要元素之一，是微生物生長的必需因素。胰蛋白、大豆蛋白、蛋白胨和牛肉膏作為酒酒球菌生長所需氮源對EPS產(chǎn)量的影響見圖2-a。

當(dāng)ATB培養(yǎng)基中的氮源是蛋白胨時(shí)，酒酒球菌EPS的產(chǎn)量明顯高于其他氮源，可以達(dá)到97 mg/100 mL。培養(yǎng)基的氮源種類不同，酒酒球菌EPS的產(chǎn)量有明顯差異，可能是由于蛋白胨中的氨基酸、短肽或其他因素更適合酒酒球菌，對酒酒球菌生成EPS有明顯的影響，但是蛋白胨的含量是否對酒酒球菌EPS的產(chǎn)量有影響還需要研究。

根據(jù)酒酒球菌常用培養(yǎng)基中的氮源含量，設(shè)定了5～25 g/L的梯度進(jìn)行試驗(yàn)，由圖2-b可知，酒酒球菌EPS產(chǎn)量隨著蛋白胨含量升高先升高后降低，說明蛋白胨含量過高或過低都會(huì)減少酒酒球菌EPS的產(chǎn)量，且當(dāng)?shù)鞍纂撕繛?0 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量最高(109.7 mg/100 mL)。說明ATB培養(yǎng)基中選擇合適的蛋白胨含量能明顯提高酒酒球菌EPS的產(chǎn)量。該結(jié)果與KANMANI等[28]研究乳酸鏈球菌EPS的產(chǎn)量時(shí)最優(yōu)氮源含量的結(jié)果一致。

圖2 氮源種類(a)及氮源含量(b)對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響

Fig.2 Effects of nitrogen source (a) and peptone (b) on EPS production of Oenococcus oeni

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.1.3 碳源種類及碳源含量

碳源作為營養(yǎng)成分的一種，是影響菌體EPS產(chǎn)量的重要因素之一[29]。本研究選取培養(yǎng)基中常用的碳源以相同的含量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果由圖3-a可知，當(dāng)ATB培養(yǎng)基中的碳源是葡萄糖時(shí)，酒酒球菌EPS的產(chǎn)量明顯高于其他碳源，達(dá)到95.6 mg/100 mL。培養(yǎng)基中的碳源種類不同，酒酒球菌EPS的產(chǎn)量有明顯差異，說明碳源種類對酒酒球菌生成EPS有明顯的影響，但是碳源的含量是否對酒酒球菌EPS的產(chǎn)量有影響還需要試驗(yàn)。故選取葡萄糖作為碳源，研究其含量對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響。

圖3 碳源種類(a)及碳源含量(b)對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響

Fig.3 Effects of carbon source (a) and glucose (b) on EPS production of Oenococcus oeni

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

由圖3-b可知，酒酒球菌EPS產(chǎn)量隨著葡萄糖含量升高先升高后降低，說明葡萄糖含量過高或過低都會(huì)減少酒酒球菌EPS的產(chǎn)量，且當(dāng)葡萄糖含量為15 g/L時(shí)EPS產(chǎn)量最高(103.1 mg/ 100 mL)。說明ATB培養(yǎng)基中合適的葡萄糖含量能明顯提高酒酒球菌EPS的產(chǎn)量。

2.1.2 正交試驗(yàn)對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響

選取單因素產(chǎn)量最高的初始pH、蛋白胨含量和葡萄糖含量進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，測定各因素對結(jié)果的影響大小，并選取最優(yōu)培養(yǎng)基條件。由表1可知，酒酒球菌EPS產(chǎn)量影響因素的主次順序?yàn)锽>A>C，即蛋白胨含量>初始pH>葡萄糖含量。由K值可以確定生產(chǎn)條件的最佳組合為A3B2C2，即初始pH值4.8、蛋白胨含量20 g/L、葡萄糖含量15 g/L，此時(shí)酒酒球菌能夠生產(chǎn)119.7 mg/100 mL EPS，高于其他試驗(yàn)組。本試驗(yàn)結(jié)果明顯高于DIMOPOULOU等[24]研究中酒酒球菌在未優(yōu)化培養(yǎng)基中EPS的產(chǎn)量，對其他乳酸菌EPS產(chǎn)量的研究中發(fā)現(xiàn)正交試驗(yàn)?zāi)軌蝻@著提高EPS的產(chǎn)量[30]。說明正交試驗(yàn)優(yōu)化對酒酒球菌EPS的產(chǎn)量有明顯的提升作用。

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見表2，因素A和B在P<0.05的水平上有顯著性差異。

表1 正交試驗(yàn)對酒酒球菌EPS產(chǎn)量的影響

表2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：*差異顯著(P<0.05)。

2.2 EPS抗冷凍干燥

2.2.1 冷凍干燥存活率試驗(yàn)

由圖4可知，對照組(水)冷凍干燥酒酒球菌存活率為5.2%，添加保護(hù)劑試驗(yàn)組的酒酒球菌冷凍干燥存活率顯著高于對照組，且不同保護(hù)劑的保護(hù)效果有明顯差異。保護(hù)效果最好的4種保護(hù)劑是:10%蔗糖、10%海藻糖，、5%EPS、2.5%谷氨酸鈉，存活率分別為49.62%、54.89%、70.97%和68.50%，此結(jié)果與張國強(qiáng)[25]的經(jīng)2.5%谷氨酸鈉、10%海藻糖、10%蔗糖及其他冷凍干燥保護(hù)劑凍干酒酒球菌后的存活率相近。

圖4 不同冷凍干燥保護(hù)劑對酒酒球菌冷凍干燥存活率的影響

Fig.4 Effects of different freeze-drying protectant on survival rate of Oenococcus oeni after freeze drying

為了進(jìn)一步研究4種保護(hù)效果最好的保護(hù)劑添加量對冷凍干燥存活率的影響，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%和25%的蔗糖和海藻糖；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、2.5%、5%、7.5%和10%的EPS和谷氨酸鈉進(jìn)行單一保護(hù)劑添加量的試驗(yàn)。

通過表3可以看出，保護(hù)劑的添加量對酒酒球菌冷凍干燥存活率影響明顯，且各試驗(yàn)組的存活率均隨著保護(hù)劑添加量的增加先升高后下降，當(dāng)蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉和EPS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15%、10%、2.5%和5%時(shí)酒酒球菌存活率最高，分別達(dá)77.46%、56.72%、67.17%和73.31%。其中蔗糖在濃度優(yōu)化后，其保護(hù)效果明顯高于優(yōu)化前，其余各保護(hù)劑的最優(yōu)濃度與單因素試驗(yàn)結(jié)果相近。

表3 冷凍干燥保護(hù)劑添加量對酒酒球菌冷凍干燥存活率能力的影響

2.2.2 SEM和TEM觀察結(jié)果

本試驗(yàn)通過SEM和TEM觀察酒酒球菌不同處理下細(xì)胞內(nèi)部和表面的變化，以期得到EPS冷凍干燥保護(hù)的機(jī)制。選擇同為糖類且冷凍干燥存活率與EPS相當(dāng)?shù)恼崽且约八鳛閷φ?，與EPS進(jìn)行比較。

比較圖5第1列發(fā)現(xiàn)，添加EPS試驗(yàn)組冷凍干燥后樣品(圖5-A1)呈一定厚度的片狀物，表面無細(xì)胞暴露，這與蔗糖試驗(yàn)組(圖5-B1)的結(jié)果相一致；添加水冷凍干燥后的樣品(圖5-C1)也呈片狀但表面有大量暴露在外且被壓縮成薄片的細(xì)胞，還有呈石榴狀的細(xì)胞團(tuán)[35]，可能是這些“石榴”及“薄片”中心的細(xì)胞由于周圍細(xì)胞的保護(hù)得以幸存，而位于“石榴”和“薄片”周圍的細(xì)胞大量死亡，這也解釋了冷凍干燥存活率試驗(yàn)中添加水的試驗(yàn)組存活率低的原因。

比較圖5第2列發(fā)現(xiàn)添加EPS試驗(yàn)組(圖5-A2)中拍攝到EPS的斷裂層，細(xì)胞被EPS包裹如同鑲嵌在EPS中，細(xì)胞表面光滑無褶皺，EPS斷層表面有許多凹洞，每1個(gè)凹洞形狀規(guī)則表面光滑，可能是片狀物斷裂后細(xì)胞掉落形成的。蔗糖實(shí)驗(yàn)組(圖5-B2)與EPS試驗(yàn)組相似，但是有部分細(xì)胞有破裂現(xiàn)象，可能是由于蔗糖在結(jié)晶過程中會(huì)不斷長大[36]導(dǎo)致部分細(xì)胞受到蔗糖晶體的機(jī)械損傷而破裂。在添加水的對照組(圖5-C2)中可以發(fā)現(xiàn)“薄片”中有大量堆積在一起被壓縮的細(xì)胞，圖片中央的“石榴”表面的細(xì)胞有破損，且左下角有不規(guī)則的細(xì)胞，可能是破裂后的細(xì)胞。

比較圖5第3、4列可以發(fā)現(xiàn)添加EPS試驗(yàn)組(圖5-A3、圖5-A4)中的細(xì)胞被EPS包裹，所有的細(xì)胞形態(tài)完整，未發(fā)生細(xì)胞壁破損的現(xiàn)象。蔗糖試驗(yàn)組(圖5-B3、圖5-B4)結(jié)果與EPS類似，但包裹細(xì)胞的保護(hù)層更薄。添加水的對照組(圖5-C3、圖5-C4)中的細(xì)胞有明顯破裂，大量細(xì)胞內(nèi)容物外泄，能看到許多細(xì)胞碎片細(xì)胞外圍有少許物質(zhì)包裹，推測可能是細(xì)胞產(chǎn)生的EPS，但產(chǎn)量過低，不能完全包裹細(xì)胞。

A-添加EPS的試驗(yàn)組；B-添加蔗糖的試驗(yàn)組；C-添加水的對照組；1、2列-SEM圖像；3、4列-TEM圖像

圖5 不同處理下冷凍干燥后SEM和TEM的圖像

Fig.5 The image of SEM and TEM under different processing after freeze-drying

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過酒酒球菌產(chǎn)EPS培養(yǎng)基條件的優(yōu)化的研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的培養(yǎng)基能夠顯著提高酒酒球菌EPS的產(chǎn)量，并且含EPS的冷凍干燥保護(hù)劑對酒酒球菌冷凍干燥存活率有明顯的提升作用，說明該保護(hù)劑能夠作為高效酒酒球菌冷凍干燥保護(hù)劑。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，酒酒球菌EPS生產(chǎn)的最適碳源是葡萄糖，最適氮源是蛋白胨，且酒酒球菌EPS的產(chǎn)量隨著初始pH、蛋白胨含量和葡萄糖含量的增加先升高后降低，在初始pH值為4.3時(shí)EPS產(chǎn)量最高(96.3 mg/100 mL)，葡萄糖含量為15 g/L時(shí)EPS的產(chǎn)量最高(103.1 mg/100 mL)，蛋白胨含量為20 g/L時(shí)EPS產(chǎn)量最高(109.7 mg/100 mL)。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化可得在初始pH值4.8、蛋白胨含量20 g/L、葡萄糖含量15 g/L的條件下，能夠生產(chǎn)119.7 mg/100 mL酒酒球菌EPS。酒酒球菌冷凍干燥存活率的研究結(jié)果表明，保護(hù)效果最好的4種保護(hù)劑是15%蔗糖、10%海藻糖、5%EPS、2.5%谷氨酸鈉，存活率分別為77.46%、56.72%、73.31%和67.17%。SEM和TEM的結(jié)果表明酒酒球菌EPS有冷凍干燥保護(hù)作用，能使細(xì)胞內(nèi)部和外表面的形態(tài)保持完整。后續(xù)研究中，可繼續(xù)深入探究EPS冷凍干燥保護(hù)的機(jī)理，以及EPS的組成和分子結(jié)構(gòu)，幫助研究者了解EPS。