王靜 王思思 馬會 王萍 武欣 劉曉娟 馬春星

河北北方學院附屬第一醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2手術室（河北張家口 075000）；3河北北方學院病理教研室（河北張家口 075000）

卵巢癌是女性最致命的惡性腫瘤，其病死率遠超子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌，惡性度高，預后極差。我國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌的發(fā)病率和病死率均高于歐美，且呈上升趨勢，因而人群負擔情況不容樂觀[1]。卵巢癌早期癥狀隱匿，難于發(fā)現(xiàn)，就診時超過70%的患者已屬晚期，生存率較低，而目前對于卵巢癌的常用檢測如CA125、HE4、超聲等方法對于病變的早期診斷均有一定的局限性[2]，因而從分子生物學角度分析，探究其發(fā)病機制，尋求靈敏度和特異度較高的標記物成為卵巢癌診療新方向。

長的非編碼RNA（lncRNA）一般指大于200個核苷酸，沒有蛋白質(zhì)編碼潛功能，但卻具有復雜的生物學效應。最新研究報道lncRNAs在諸多不同的生物過程中起著關鍵作用，包括選擇性剪接，基因印跡、核內(nèi)運輸，細胞分化和RNA衰變等[3]。此外，lncRNAs的調(diào)節(jié)異常也被證實有助于多種類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。

linc00511是近年來發(fā)現(xiàn)的新的lncRNA成員，目前在乳腺癌、舌鱗狀細胞癌、非小細胞癌、骨肉瘤等[6-8]腫瘤中發(fā)現(xiàn)其呈高表達狀態(tài)，證實其能影響相應細胞株的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，但在卵巢癌組織中的表達水平及其功能在國內(nèi)外尚未有相關文獻報道。因此，本研究通過qRT-PCR法檢測linc00511在卵巢癌組織中的表達水平，分析該基因與病理參數(shù)之間的關系，并積極隨訪，分析其與生存期的相關性，為卵巢癌的早期診斷、預后監(jiān)測提供新的準確的潛在生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年9月至2014年1月河北北方學院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科手術切除的卵巢癌組織80例、相應的癌旁正常組織80例，癌組織取自癌灶中心處，癌旁組織取自殘端切緣經(jīng)病理證實為正常腸組織。全部病例均為原發(fā)性腫瘤，且術前未行新輔助放化療等針對性治療，術后標本均在手術切除組織后1 h獲得，并存于液氮中，以備使用。

1.2 主要試劑與實驗方法

1.2.1 主要試劑RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Takara公司；SYBR Green實時定量PCR試劑盒購自美國伯樂公司；linc00511和GAPDH引物由生工生物（北京）有限公司設計合成。

1.2.2 實時定量PCR（qRT-PCR）提取總RNA：培養(yǎng)皿中生長狀態(tài)良好的細胞用冷PBS洗3遍，加入500 μL TRIzol試劑裂解數(shù)分鐘，收集到1.5 mL無酶EP管，向其中加入100 μL氯仿，室溫靜置3 min，12 000 r/min離心15 min，將200 μL上層液體移入新的1.5 mL EP管中，加入250 μL異丙醇，混勻，靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，以75%乙醇溶液（含DEPC）洗滌沉淀3次（7 500 r/min離心5 min），待RNA沉淀基本透明時，加入ddH2O至充分溶解，測定RNA的質(zhì)量及濃度。

按照takara RR036A試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照qPCR檢測試劑盒通過qRT-PCR測定linc00511的表達水平，使用CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。人GAPDH作為內(nèi)參。試驗獨立重復3次，應用2-ΔΔCt方法進行相對定量，其中，中位數(shù)以上為高表達，以下則考慮低表達。

1.2.3 隨訪定期復查、電話隨訪，末次隨訪時間為2018年12月31日，中位隨訪時間為37個月，22例生存，58例死亡。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，linc00511與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗和Fisher精確概率法分析計算，應用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，通過Cox回歸模型分析卵巢癌患者預后的獨立影響因素，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測linc00511在卵巢癌組織及癌旁細胞中表達情況qRT-PCR分析顯示：與癌旁正常組織相比，linc00511在卵巢癌組織中顯著高表達，差異具有統(tǒng)計學意義[（1.20±0.91）vs.（3.22±1.27），P＜ 0.001，圖1]。

圖1 qRT-RCR檢測linc00511在卵巢癌和癌旁正常組織中的表達Fig.1 The expression of linc00511 in ovarian cancer and adjacent normal tissues was detected by qRT-PCR

2.2 linc00511的表達與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關系linc00511的高表達與卵巢癌患者分化程度、FIGO分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、CA125（+）均呈正相關（均P＜0.05），而與年齡、腫瘤大小、是否絕經(jīng)等無明顯相關性（均P＞0.05）。見表1。

2.3 linc00511表達與卵巢癌患者生存的相關性隨訪發(fā)現(xiàn)，linc00511高表達的54例患者中，12例生存，42例死亡，中位生存時間為25個月，linc00511低表達的26例患者中，10例生存，16例死亡，中位生存時間為33個月。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank單變量分析顯示，linc00511高表達和低表達患者的生存函數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.394，P=0.011），即linc00511表達和患者生存時間相關，linc00511陽性患者預后較差。見圖2。

表1 卵巢癌患者不同臨床病理特征與linc00511表達的關系Tab.1 Relationship between clinicopathological features and linc00511 expression in ovarian cancer例（%）

圖2 生存曲線Fig.2 Suvival cure

2.4 卵巢患者獨立預后因素分析Cox回歸模型分析顯示，linc00511表達水平（95%CI：1.307～ 2.912，P=0.001）、淋巴結轉(zhuǎn)移（95%CI：1.041～ 1.620，P＜ 0.001）、分化程度（95%CI：1.725～ 2.363，P=0.035）、FIGO分期（95%CI：1.056 ～ 6.345，P=0.038）和CA125（+）（95%CI：1.160 ～ 1.741，P＜ 0.001）均是影響卵巢癌患者預后的獨立因素。

3 討論

近年來，lncRNA在腫瘤中的調(diào)控作用越來越引起廣大醫(yī)生的重視，并取得了重大的成果，各類lncRNAs表達的異常與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關。目前研究較成熟的卵巢癌相關lncRNA有H19、HOTAIR、HOST2等，但對于linc00511在卵巢癌中的研究未見相關報道。linc00511長度為a2.265kb，最初發(fā)現(xiàn)其在侵襲性基底樣乳腺癌亞型中呈高表達狀態(tài)，且體外實驗證實linc00511的沉默能顯著乳腺癌細胞的增殖[10]。SUN等[11]應用qRT-PCR法證實linc00511在人非小細胞癌和SKMES-1、H1299、95D等多種細胞株中呈高表達狀態(tài)，且隨訪和繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)，linc00511高表達的患者預后較差，進一步研究其機制發(fā)現(xiàn)linc00511通過結合組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶增強子-EZH2，調(diào)節(jié)組蛋白H3賴氨酸27三甲基化（H3K27me3）的活性，從而抑制p57的表達，誘導非小細胞癌的惡性生物學行為。MOON等[12]應用qRT-PCR法證實linc00511在舍鱗癌組織和相應細胞株中呈高表達狀態(tài)，因而推測其是舍鱗癌潛在的生物學指標，進一步CCK-8實驗檢測發(fā)現(xiàn)linc00511通過競爭性結合miR-765調(diào)節(jié)致癌基因-層黏連蛋白亞基的γ2（LAMC2）的表達，從而調(diào)控腫瘤細胞的分化、增殖和轉(zhuǎn)移，這一點在Nguyen的實驗中亦得到了證實[13]。ZHAO 等[14]應用熒光原位雜交法證實linc00511在胰腺導管腺癌中呈高表達狀態(tài)，且其表達水平與病變的不良病理特征密切相關，其高表達提示預后較差，生存期較短，考慮其機制為linc00511能通過競爭內(nèi)源性RNA對hsa-miR-29b-3p的活性而上調(diào)的VEGF表達，從而促進胰腺導管癌細胞的增殖、侵襲，同時誘導腫瘤血管的生成。劉鑫等[15]應用定量PCR法檢測linc00511結直腸腺癌組織和正常組織中的表達，顯示linc00511在癌組織中呈高表達，明顯高于正常組織，因而證實其可能是促進結直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因之一，并與預后相關。

目前，國內(nèi)外暫無關于linc00511在卵巢癌組織中的相關研究報道。本研究應用qRT-PCR法檢測linc00511在卵巢癌和癌旁正常組織中的表達水平，結果顯示其在癌細胞中的表達量均明顯高于其在正常組織細胞，且linc00511的高表達與病變的分化程度、FIGO分期、淋巴結轉(zhuǎn)移和CA125（+）均呈正相關，生存期隨訪證實linc00511高表達的卵巢癌患者生存期明顯低于低表達的患者，linc00511高表達提示預后不良，Cox回歸模型分析顯示linc00511高表達與病變的轉(zhuǎn)移、分期等病理特征均為卵巢癌患者預后的獨立影響因素。

綜上，linc00511在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其在卵巢癌的早期診斷和預后監(jiān)測中具有潛在的臨床應用價值，對其致癌機制的深入研究，將為卵巢癌的靶向治療提供理論基礎，這亦將是本課題今后進一步的研究方向。