王妍卿 ，裴忠有 ，陳玉春，任麗麗

（1.天津市中農(nóng)大棉花抗性遺傳研究中心，天津 300308；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384；3.天津市種子管理站，天津 300061；4.天津中天大地科技有限公司，天津 300384）

小麥?zhǔn)侵袊匾募Z食作物之一，屬自花授粉作物，但在生產(chǎn)過程中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有異雜株混入情況，嚴(yán)重影響小麥品種的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，為更好地鑒定小麥品種的種子純度，需要一種操作簡單、準(zhǔn)確率高的鑒定小麥品種純度的檢測方法。近年來，SSR（Simple Sequence Repeat）標(biāo)記技術(shù)作為常用的分子檢測技術(shù)，具有多態(tài)性水平高、檢測到的信息量大、操作方便、結(jié)果易于分析統(tǒng)計等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到廣泛重視及應(yīng)用。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小麥、大麥、玉米等農(nóng)作物的雜種純度鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與克隆等研究。

本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒別濟(jì)麥22與其他2種疑似混雜植株小麥?zhǔn)欠駷橥黄贩N。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料選用濟(jì)麥22（CK）及田間疑似混雜品種（S1、S2），由天津市中天大地科技有限公司提供。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，選擇30對從小麥EST中設(shè)計的SSR引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥基因組DNA的提取 濟(jì)麥22及2種疑似混雜株樣品，每個樣品分別選取10個單株小麥葉片，采用CTAB法提取小麥基因組DNA，并通過α-DNA（10 ng·μl-1）對基因組DNA進(jìn)行粗略定量。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 以小麥基因組DNA為模板，用30對SSR引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為 95℃ 預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸15 s，擴(kuò)增 35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃溫度條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物列表

1.2.3 SSR特異性引物的篩選 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步篩選，選擇擴(kuò)增帶型穩(wěn)定、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的引物作為SSR 引物用于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗。

1.2.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 利用上述SSR篩選引物對濟(jì)麥22、混雜株S1、S2進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗，試驗所涉及的藥品試劑及具體方法參見參考文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥基因組DNA的提取和檢測

本試驗采用CTAB法提取小麥基因組DNA，結(jié)果表明DNA條帶清晰，完整性較好（圖1）。雖然沒有使用RNase對基因組DNA中的RNA進(jìn)行消化，但不影響SSR分析。

將DNA樣品使用α-DNA（10 ng·μl-1）進(jìn)行粗定量，將DNA濃度調(diào)整為10 ng·μl-1。

2.2 SSR引物篩選

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行引物初篩。選擇擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物作為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的篩選引物。通過圖2從30對SSR引物中篩選出10對引物（標(biāo)紅泳道）用于SSR變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗。

2.3 SSR變性聚丙烯酰胺檢測

利用17-F/R、18-F/R、19-F/R、20-F/R、23-F/R、24-F/R、26-F/R、27-F/R、29-F/R、30-F/R共10對SSR引物，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對濟(jì)麥22及混雜株進(jìn)行篩選。

圖3顯示，通過不同引物對CK、S1、S2的擴(kuò)增，均能表現(xiàn)出 S2擴(kuò)增帶型與CK結(jié)果一致，而S1出現(xiàn)差異條帶。說明混雜株S2與濟(jì)麥22為同一品種，混雜株S1與濟(jì)麥22不是同一品種。

3 結(jié)論

試驗表明，通過SSR標(biāo)記變性聚丙烯酰胺電泳技術(shù)可以將目標(biāo)品種濟(jì)麥22與兩種疑似田間混雜株進(jìn)行品種鑒別。結(jié)果表明，混雜株S2與濟(jì)麥22是同一品種，在田間表型上S2株高普遍較濟(jì)麥22高2～3 cm，其他表型無差異，推測可能與田間肥水管理、保護(hù)行設(shè)置有關(guān)，而混雜株S1在田間表型上株高較濟(jì)麥22高度4 cm左右，且葉片寬度較大，芒較多，與濟(jì)麥22表型存在較大差異，因此，S1與濟(jì)麥22不是同一品種。