鄭莎莎，胡萍

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

凱里紅酸湯是用西紅柿、新鮮紅辣椒、食鹽等經(jīng)自然發(fā)酵而成的一種調(diào)味品，用其煮制的火鍋口感醇厚、細(xì)膩、柔和、酸味純正、辣味悠厚、咸味適中，并且具有開(kāi)胃、健脾、增強(qiáng)食欲的獨(dú)特作用，其味道鮮美，百食不厭，深受海內(nèi)外消費(fèi)者的青睞[1]。

番茄作為主要原料，因其對(duì)人體健康的有益作用被認(rèn)為是一種重要的功能性食品[2]，而番茄的益生功效與其所含的抗氧化物質(zhì)、有機(jī)酸等密切相關(guān)[3]，如番茄紅素、β-胡蘿卜素、維生素E、維生素C、酚類(lèi)物質(zhì)、乳酸等[4]；其中，番茄紅素、酚類(lèi)和類(lèi)黃酮作為天然的抗氧化物質(zhì)，對(duì)人體的健康有著重要的意義。有研究報(bào)道通過(guò)乳酸菌發(fā)酵紅酸湯，可以使紅酸湯中的番茄紅素、酚類(lèi)物質(zhì)等含量上升[5-8]，并且通過(guò)乳酸菌中糖苷酶的作用轉(zhuǎn)化為抗氧化活性更高以及更易于人體吸收的物質(zhì)，使得其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到極大的提升。

紅酸湯產(chǎn)業(yè)在迅速發(fā)展的同時(shí)，也存在著一些制約企業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)的問(wèn)題：企業(yè)一直采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵工藝，發(fā)酵液中微生物來(lái)源復(fù)雜，紅酸湯中微生物的生長(zhǎng)無(wú)法合理控制，且發(fā)酵出來(lái)的紅酸湯品質(zhì)不均，發(fā)酵周期長(zhǎng)，影響番茄紅酸湯發(fā)酵的品質(zhì)，這樣不利于紅酸湯產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化生產(chǎn)。故本研究采用從自然發(fā)酵紅酸湯中分離出來(lái)的兩株優(yōu)勢(shì)乳桿菌進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，以未接菌組作為對(duì)照，測(cè)定紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中相應(yīng)的理化指標(biāo)并進(jìn)行分析，對(duì)接菌發(fā)酵的方式進(jìn)行評(píng)價(jià)，為今后紅酸湯乳酸菌發(fā)酵劑的制備提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄、糯米粉、食鹽、生姜、辣椒、白酒：均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

主要試劑：氫氧化鈉、酚酞、3，5-二硝基水楊酸、四硼酸鈉、亞鐵氰化鉀、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鹽酸、磷酸二氫銨、無(wú)水乙醇、甲醛(濃度為38%)、葡萄糖標(biāo)品、氯化鈉、MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、甲醇(色譜純)、乳酸、草酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、琥珀酸等：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPX-9082 MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；便攜式pH計(jì) 深圳德圖儀表有限公司；FA2004N電子天平 上海菁海儀器有限公司；TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；LS-B75L-I型立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器) 美國(guó)安捷倫公司；SinoChrom ODS-BP C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm) 大連伊力特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑的制備

干酪乳桿菌H1與鼠李糖乳桿菌H3經(jīng)MRS肉湯培養(yǎng)基活化后，離心得到菌體，用濃度為0.85%的生理鹽水調(diào)整濃度為109CFU/mL備用。

1.3.2 紅酸湯的制作工藝

番茄→挑選→去雜、去柄→洗凈→晾干→切碎→加入糯米、辣椒、姜→粉碎→巴氏殺菌(低溫消毒65 ℃)→混勻→加入鹽、白酒→發(fā)酵→成品。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

pH的測(cè)定：采用PHS-3C pH計(jì)測(cè)定；總酸的測(cè)定：參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》[9]；氨基酸態(tài)氮(AN)的測(cè)定：參照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[10]；還原糖含量的測(cè)定：參照NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的測(cè)定》[11]；亞硝酸鹽含量的測(cè)定：參照GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽的含量測(cè)定》[12]；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定：樣品送至貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析測(cè)定[13]；有機(jī)酸的測(cè)定：參照熊瑛等人[14]的方法；乳酸菌計(jì)數(shù)：參考江志杰等人的研究方法進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)[15]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，使用Oringe 2018 Pro作圖，分析數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)，用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的動(dòng)態(tài)變化

圖1 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌計(jì)數(shù)Fig.1 Lactic acid bacteria count in the fermentation process of red sour soup

乳酸菌是紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中的主要菌群，通過(guò)乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物本身以及通過(guò)相互作用賦予了紅酸湯獨(dú)特的風(fēng)味。紅酸湯開(kāi)始發(fā)酵后，酸湯中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由于滲透壓的作用析出，使得乳酸菌的生長(zhǎng)環(huán)境優(yōu)越，且紅酸湯中加入了生姜、鹽等物質(zhì)，能夠在發(fā)酵前期有效地抑制腐敗菌的生長(zhǎng)；開(kāi)始發(fā)酵后，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速被利用以促進(jìn)其生長(zhǎng)。由圖1可知，接菌組初始的乳酸菌計(jì)數(shù)為107CFU/mL，在發(fā)酵的前3 d，乳酸菌數(shù)量呈快速上升的趨勢(shì)，到第3天時(shí)達(dá)到109CFU/mL；隨著紅酸湯中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡以及代謝產(chǎn)物的影響，乳酸菌數(shù)量也開(kāi)始下降[16]；而未接菌組在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，紅酸湯中的乳酸菌數(shù)量較少，為102CFU/mL，主要是因?yàn)槲唇泳须s菌較多，抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，因此發(fā)酵前期以異型發(fā)酵和酒精發(fā)酵為主[17]，發(fā)酵后期則以正型發(fā)酵為主，此時(shí)乳酸菌數(shù)量急劇升高，第9天乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到最高，為107CFU/mL，之后便開(kāi)始下降。

2.2 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中pH的動(dòng)態(tài)變化

圖2 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化Fig.2 Changes of pH in the fermentation process of red sour soup

由圖2可知，兩組紅酸湯的pH值隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降的趨勢(shì)，發(fā)酵第3天時(shí)，未接菌組的pH值從初始的3.96±0.005下降至3.8±0.005，而接菌組的pH值則從初始的3.96±0.005快速下降至3.31±0.001，達(dá)到未接菌組第13天的pH值，下降速度顯著大于未接菌組，這主要是由于乳酸菌接種到紅酸湯中成為優(yōu)勢(shì)菌群，快速利用發(fā)酵液中的碳水化合物產(chǎn)生乳酸等酸類(lèi)物質(zhì)，從而快速降低了酸湯的pH值[18]，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其他代謝產(chǎn)物的積累以及氨、胺類(lèi)等堿性含氮物質(zhì)的產(chǎn)生，使pH值變化速度減緩。pH值不僅影響微生物的生長(zhǎng)，還對(duì)食品中內(nèi)源酶的活性具有重要意義，是衡量食品風(fēng)味和口感的重要指標(biāo)[19]。

2.3 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的動(dòng)態(tài)變化

由圖3可知，總酸含量在兩組紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中隨時(shí)間的變化不斷地增加，總酸含量的增加是由于酸湯發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生大量的有機(jī)酸。在發(fā)酵第5天時(shí)，未接菌組的總酸含量從初始的(0.442±0.000)%上升至(0.6±0.022)%，而接菌組的總酸含量則從初始的(0.442±0.000)%快速上升至(1.0±0.022)%左右，達(dá)到未接菌組第15天的總酸含量，達(dá)到快速產(chǎn)酸的目的。

圖3 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中總酸的變化Fig.3 Changes of total acid in the fermentation process of red sour soup

2.4 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的動(dòng)態(tài)變化

圖4 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化Fig.4 Changes of reducing sugar content in the fermentation process of red sour soup

成熟的番茄果實(shí)內(nèi)含有果糖和葡萄糖[20]，而果糖與葡萄糖均屬于還原糖，乳酸菌利用還原糖產(chǎn)生乳酸等代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生獨(dú)特芳香及風(fēng)味物質(zhì)[21]。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組紅酸湯還原糖含量都在不斷地降低，在發(fā)酵第1天時(shí)，還原糖含量出現(xiàn)上升趨勢(shì)，是因?yàn)榉阎械碾p糖、三糖和多糖水解成還原性糖溶解到酸湯發(fā)酵液中，而微生物還處于適應(yīng)階段，其溶出速度大于微生物的利用速度；從發(fā)酵的第2天開(kāi)始，還原糖含量迅速下降，說(shuō)明還原糖開(kāi)始被乳酸菌利用，且還原糖利用效率遠(yuǎn)高于還原糖溶出效率，所以還原糖由最初的(25±0.054) mg/mL下降到第5天的(5±0.071) mg/mL左右，隨后仍然在緩慢的下降，直至利用完全。

2.5 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的動(dòng)態(tài)變化

氨基酸作為發(fā)酵食品一個(gè)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，理論上通常采用氨基酸態(tài)氮的含量來(lái)表示。氨基酸種類(lèi)和含量不僅能夠影響發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)，且通過(guò)化合反應(yīng)產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)存在很重要的作用[22]，如食品中主要鮮味氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸，能夠與Na+結(jié)合形成鮮味物質(zhì)，對(duì)紅酸湯的風(fēng)味和品質(zhì)起重要的作用[23]。由圖5可知，在兩組紅酸湯的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，無(wú)論是否接菌發(fā)酵，酸湯總氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)不規(guī)則波動(dòng)的趨勢(shì)，在發(fā)酵后期，接菌組的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于未接菌組。有文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白質(zhì)通過(guò)微生物發(fā)酵后分解成人體更易吸收的氨基酸，提高人體對(duì)蛋白質(zhì)的利用效率[24]。

圖5 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.5 Changes of amino acid nitrogen content in the fermentation process of red sour soup

2.6 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量的動(dòng)態(tài)變化

圖6 紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.6 Changes of nitrite content during the fermentation of red sour soup

發(fā)酵制品中最需要關(guān)心的安全指標(biāo)之一就是亞硝酸鹽含量。眾所周知，亞硝酸鹽會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生多種危害，主要包括引發(fā)高鐵紅蛋白癥和形成致癌物質(zhì)亞硝胺[25]。大量研究證實(shí)，蔬菜腌漬過(guò)程中亞硝酸鹽含量均呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，且都會(huì)出現(xiàn)NO2-高峰即亞硝峰現(xiàn)象[26]。由圖6可知，未接菌組在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，其亞硝酸的波動(dòng)較大，可能是由于各種菌相互作用引起的，而接菌組的亞硝峰則出現(xiàn)在第3天，之后便趨于穩(wěn)定，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，接菌發(fā)酵的亞硝酸鹽的含量比未接菌組要低，從而保證了紅酸湯的安全性。

2.7 紅酸湯發(fā)酵前后有機(jī)酸的變化

圖7 紅酸湯發(fā)酵前后有機(jī)酸的變化

新鮮番茄中的酸味主要?dú)w因于檸檬酸和蘋(píng)果酸，占番茄總有機(jī)酸含量的90%[27,28]；有機(jī)酸不僅是發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，也是紅酸湯中的主要風(fēng)味營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一和天然防腐劑，其含量的高低與紅酸湯的品質(zhì)有密切關(guān)系。生番茄經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵后，生成了口味更加柔和以及對(duì)人體更有益的乳酸[29]；研究證實(shí)乳酸可以提高人體對(duì)鈣、鐵的利用[30]，促進(jìn)鐵和維生素D的吸收。由圖 7可知，通過(guò)發(fā)酵，兩組酸湯中的乳酸含量都顯著增加，但接菌組的乳酸增加量為未接菌組的1倍左右。

2.8 紅酸湯發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)的變化

圖8 紅酸湯發(fā)酵前后風(fēng)味成分的變化Fig.8 Changes of flavor components before and after fermentation of red sour soup

圖9 紅酸湯風(fēng)味成分PCA分析圖Fig.9 PCA analysis chart of flavor components of red sour soup

風(fēng)味物質(zhì)是衡量發(fā)酵食品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，酸湯在發(fā)酵過(guò)程中，各種物質(zhì)在微生物的作用下通過(guò)各種代謝途徑轉(zhuǎn)化為新的代謝物，形成獨(dú)特的風(fēng)味；通過(guò) GC-MS 分析，從接菌發(fā)酵組和未接菌組中共檢測(cè)出75種風(fēng)味物質(zhì)；且兩組紅酸湯中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均為醇類(lèi)、酯類(lèi)、烯烴類(lèi)。由圖 8可知，兩組酸湯通過(guò)發(fā)酵后，醇類(lèi)是紅酸湯中含量最高的風(fēng)味物質(zhì)，而醇類(lèi)物質(zhì)可以和有機(jī)酸在酯酶的作用下生成酯類(lèi)物質(zhì)[31]，醇類(lèi)物質(zhì)還能和甘油酯或乙酰輔酶A 在?；D(zhuǎn)移酶或酯酶的作用下合成酯類(lèi)物質(zhì)[32]，而未接菌組中的醇類(lèi)、酸類(lèi)等物質(zhì)含量較接菌組多，可能是由于未接菌組酸湯中雜菌較多，產(chǎn)生的代謝物質(zhì)比較復(fù)雜且不穩(wěn)定；酸湯中相對(duì)含量增加最多的物質(zhì)是酯類(lèi)，酯類(lèi)物質(zhì)為風(fēng)味成分中重要的成分，具有水果香[33]。由于酯類(lèi)物質(zhì)的風(fēng)味閾值較低，氣味活度值相比其他物質(zhì)較高，所以對(duì)發(fā)酵風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大，由圖 9中PCA分析圖可知，接菌組與未接菌組在PC1(66.8%)的正軸，而未發(fā)酵組位于PC1的負(fù)軸，說(shuō)明發(fā)酵后的番茄酸湯風(fēng)味與未發(fā)酵的番茄風(fēng)味差異顯著，其中，酸類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)和醛酮類(lèi)對(duì)接菌組和未接菌組的風(fēng)味影響較大。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定及分析，并對(duì)其發(fā)酵前后的有機(jī)酸的變化和風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行測(cè)定及分析，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所采用的這兩株乳酸菌能夠很好地適應(yīng)紅酸湯的發(fā)酵環(huán)境并快速產(chǎn)酸，將紅酸湯發(fā)酵周期由15 d縮短至5 d，而相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)及安全指標(biāo)得到提升，如氨基酸態(tài)氮含量與乳酸含量顯著高于未接菌發(fā)酵組，亞硝酸鹽含量顯著低于未接菌發(fā)酵組；且通過(guò)發(fā)酵前后有機(jī)酸以及風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)據(jù)可知，接菌發(fā)酵組的有機(jī)酸中乳酸含量超過(guò)未接菌組的1倍左右，風(fēng)味組成及含量與未接菌組相似；表明本實(shí)驗(yàn)所用的兩株乳酸菌可以作為紅酸湯的發(fā)酵劑，且通過(guò)乳酸菌復(fù)合發(fā)酵可以改善其風(fēng)味，提高其營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值和安全性，可以為紅酸湯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考和理論依據(jù)。