王夏雷， 茍小軍， 陳 龍， 詹美榕， 李云鶴， 賈益群*

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實驗中心， 上海201203； 2. 上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實驗室，上海201999）

土三七又名菊三七, 是菊科菊三七屬植物菊葉三七Gynura segetum （Lour.） Merr 的根或全草, 始載于《滇南本草》, 其味甘、 微苦, 性溫[1], 主要分布于我國華北、 福建、 江浙等地。 《本草綱目》記載, 土三七具有活血化瘀、 行氣攝血、 清熱解毒等功效[2], 民間常用于跌打損傷、 活血化瘀、 止血消炎等, 其化學(xué)成分主要包括生物堿、 香豆素、甾體、 三萜、 皂苷類、 酚酸、 倍半萜、 腦苷脂[3-4]等, 具有止血、 抗腫瘤、 抗凝血、 鎮(zhèn)靜、 安定、 催眠等藥理活性[5-6]。

1980 年, 蔡華聰?shù)萚7]首次發(fā)現(xiàn)2 例因服用土三七導(dǎo)致肝小靜脈閉塞病的病例, 近年來也陸續(xù)有相關(guān)文獻(xiàn)報道, 引起了人們對該藥材致肝毒事件的重視。 高新生等[8]從土三七根部分離出千里光寧、千里光非靈、 全緣千里光堿等多種吡咯烷生物堿成分, 并成功誘導(dǎo)肝小靜脈閉塞病小鼠模型； 李文宇等[9]用含吡咯烷生物堿的土三七成功建立了肝小靜脈閉塞病模型, 證實它可直接導(dǎo)致病情發(fā)生[10],但目前鮮有關(guān)于土三七的機制研究。

本實驗在Qiu 等[11]研究血漿和尿液的基礎(chǔ)上,又增加對肝組織的研究, 通過分析血清、 肝組織差異代謝通路, 從多方面揭示土三七致肝毒性的作用機制。 代謝組學(xué)是針對某一生物或細(xì)胞所有低相對分子質(zhì)量的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性、 定量分析的新興學(xué)科[12], 是通過考察受不同外界環(huán)境刺激或擾動的生物體系代謝組, 研究生物體系代謝通路變化, 來全面解讀疾病過程和機制[13]。 因此, 本實驗采用該方法揭示土三七致大鼠肝毒性作用機制, 為臨床快速診斷和用藥安全提供依據(jù), 也為開發(fā)相關(guān)新藥提供新的思路和方法。

1 材料

1.1 動物 20 只清潔級雄性SD 大鼠, 體質(zhì)量100～120 g, 購于上海斯萊克動物有限公司, 許可證號SCXK （滬） 2017-0005, 飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心, 室溫22 ～25 ℃, 濕度45% ～70%。

1.2 藥材 土三七（2 000 g） 購于安徽省亳州市藥材市場, 經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室崔亞君教授鑒定為菊科植物菊葉三七Gynura segetum （Lour.）Merr 的塊根。

1.3 儀器 UltiMate3000/EasynLC100-LTQ-Orbitrap Elite 液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher 公司）； TARGINTMVX-Ⅱ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）； 1730R 離心機（基因有限公司）； Tissue LyserⅡ勻漿機（德國Qiagen 公司）； SK8200LHC 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）； TBA-40FR 生化分析儀（日本東芝公司）。

1.4 試劑 乙腈為色譜純（美國Honeywell 公司,批號K3021728）； 甲醇（批號K0021008）、 甲酸（批號D1290265） （均為色譜純, 德國CNW 公司）； 2-氯苯丙氨酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 批號D1404053）。

2 方法

2.1 水煎劑制備[14]將藥材洗凈切片后曬干, 取750 g 加水浸泡2 h 后煎煮1.5 h, 濾出第1 次藥液； 再加水煎煮1.5 h, 濾出第2 次藥液, 合并2次藥液, 加熱濃縮至1 000 mL 備用（藥液濃度相當(dāng)于0.75 g 生藥/mL）。

2.2 分組與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后, 按體質(zhì)量隨機分為空白組和給藥組, 每組10 只, 給藥組大鼠每天上午灌胃給予1 次, 劑量1 mL/100 g；空白組大鼠每天上午灌胃給予蒸餾水, 1 mL/只,連續(xù)2 周。 每天灌胃前觀察大鼠異常表現(xiàn), 記錄體質(zhì)量, 給藥2 周后處死, 取全血、 肝臟, 記錄后者質(zhì)量。

2.3 樣品采集和指標(biāo)檢測 第14 天晚上將大鼠放入代謝籠, 禁食不禁水, 收集尿液和糞便, 第2 天腹腔注射7% 水合氯醛, 麻醉后腹主動脈取5 mL血液, 3 500 r/min 離心15 min 取上清液, 保存于-80 ℃冰箱中。 然后, 檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST） 水平, 初步估計肝損程度。 再用4%甲醛固定肝大葉, HE 染色, 光鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)。

2.4 代謝組學(xué)研究

2.4.1 血清樣品制備 血清常溫解凍后取100 μL, 加入甲醇400 μL、 2-氯苯丙氨酸（3 mg/10 mL） 5 μL, 充分振蕩30 s, 4 ℃、 12 000 r/min 下離心10 min, 取200 μL 上清于進(jìn)樣瓶中。 同時,各組取等量樣品混合, 制備質(zhì)控樣品。

2.4.2 肝組織樣品制備 取100 mg 肝組織, 加1 mL純水和1 粒磁珠制成10% 勻漿液, 4 ℃、10 000 r/min離心10 min, 取上清100 μL, 加入甲醇400 μL、 2-氯苯丙氨酸（3 mg/10 mL） 5 μL,充分振蕩30 s, 12 000 r/min、 4 ℃離心10 min, 取上清200 μL 于進(jìn)樣瓶中待測。 同時, 各組取等量樣品進(jìn)行混合, 制備質(zhì)控樣品。

2.4.3 LC-MS 分析

2.4.3.1 色譜條件 Thermo Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm, 1.9 μm）； 流動相A 為純水+0.1%甲酸, B 為乙腈+0.1%甲酸, 梯度洗脫,程序見表1； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫40 ℃；進(jìn)樣量4 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.4.3.2 質(zhì)譜條件 靜電場軌道離子阱, ESI 離子源, 正離子模式為加熱器溫度300 ℃； 鞘氣體積流量45 arb； 輔助氣體積流量15 arb； 尾氣體積流量1 arb； 電噴霧電壓3.0 kV； 毛細(xì)管加熱溫度350 ℃, 而負(fù)離子模式為加熱器溫度300 ℃； 鞘氣體積流量45 arb； 輔助氣體積流量15 arb； 尾氣體積流量1 arb； 電噴霧電壓3.2 kV； 毛細(xì)管加熱溫度350 ℃。 鞘氣和輔助氣均為氮氣, 掃描范圍m/z 50～1 000。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析, 計量資料以s） 表示, 將LC-MS 所得原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discover2.1 軟件（美國Thermo 公司） 進(jìn)行提取和預(yù)處理, 再導(dǎo)入Excel 軟件中進(jìn)行歸一化, 整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式, 通過SIMCA13.0 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA） 和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）, 根據(jù)OPLSDA 模型所得的VIP 值和t 檢驗所得的P 值（P＜0.05） 為標(biāo)準(zhǔn), 找出差異性代謝物。

3 結(jié)果

3.1 土三七對ALT、 AST 水平的影響 表2、 圖1顯示, 與空白組比較, 給藥組ALT、 AST 水平顯著升高（P＜0.01）。

表2 土三七對ALT、 AST 水平的影響 n=10）Tab.2 Effects of G. segetum on ALT and AST levelss， n=10）

表2 土三七對ALT、 AST 水平的影響 n=10）Tab.2 Effects of G. segetum on ALT and AST levelss， n=10）

注：與空白組比較,**P＜0.01

images/BZ_77_236_1035_1194_1085.png空白組 25.4±2.67 150.3±30.97給藥組 50.4±16.59** 221.4±46.98**

圖1 各組ALT （A）、 AST （B） 水平Fig.1 ALT （A） and AST （B） levels in various groups

3.2 肝組織病理變化 圖2 顯示, 空白組大鼠肝細(xì)胞正常, 而給藥組大鼠可見有不同程度的炎細(xì)胞浸潤, 細(xì)胞間隙變大。

圖2 各組大鼠肝組織病理變化（HE， ×200）Fig.2 Pathological changes of rat liver tissues in various groups （HE， ×200）

3.3 TIC 色譜圖

3.3.1 血清代謝物 見圖3～4。

3.3.2 肝組織代謝物 見圖5～6。

3.4 PCA 分析 圖7 ～8 顯示, 空白組、 給藥組、質(zhì)控樣品得到較完全分離, 血清樣品在正、 負(fù)離子模式下Rx2 分別為0.527、 0.579, 肝組織樣品分別為0.912、 0.656, 表明該模型能解釋樣本間代謝差異。 另外, 質(zhì)控樣品聚簇, 表明儀器穩(wěn)定性良好。

圖3 血清代謝物TIC 色譜圖（正離子）Fig.3 TIC chromatograms of serum metabolites （positive ion）

3.5 OPLS-DA 分析 圖9 ～10 顯示, 空白組、 給藥組樣品分離, 血清樣品在正、 負(fù)離子模式下分別為0.963、 0.976, Q2分別為0.799、 0.852,而 肝 組 織 樣 品 分 別 為 0.986、 0.975, 0.946、0.924, 表明該模型擬合度和預(yù)測能力都較理想。

圖4 血清代謝物TIC 色譜圖（負(fù)離子）Fig.4 TIC chromatograms of serum metabolites （negative ion）

圖5 肝組織代謝物TIC 色譜圖（正離子）Fig.5 TIC chromatograms of liver tissue metabolites （positive ion）

3.6 置換檢驗 為了防止模型出現(xiàn)過擬合, 通過置換檢驗進(jìn)行分析, 結(jié)果見圖11～12, 可知該模型可解釋2 組樣品之間的差異。

圖6 肝組織代謝物TIC 色譜圖（負(fù)離子）Fig.6 TIC chromatograms of liver tissue metabolites （negative ion）

圖7 血清樣品PCA 得分圖Fig.7 PCA score plots for serum samples

圖8 肝組織樣品PCA 得分圖Fig.8 PCA score plots for liver tissue samples

3.7 差異性代謝物 通過OPLS-DA 分析, 根據(jù)變量權(quán)重（VIP） ＞1、 P ＜0.05 的標(biāo)準(zhǔn), 經(jīng)HMDB、KEGG 等譜庫檢索篩選, 血清樣品中共有68 個差異變量, 而肝組織樣品中共有26 個, 再以GraphPad Prism 7.00 軟件繪制火山圖, 見圖13 ～14。 血清樣品中篩選出13 種差異性代謝物, 而肝組織樣品中篩選出14 種, 見表3～4。

圖9 血清樣品OPLS-DA 得分圖Fig.9 OPLS-DA score plots for serum samples

圖10 肝組織樣品OPLS-DA 得分圖Fig.10 OPLS-DA score plots for liver tissue samples

圖11 血清樣品OPLS-DA 模型的置換檢驗Fig.11 Permutation tests for OPLS-DA models of serum samples

圖12 肝組織樣品OPLS-DA 模型的置換檢驗Fig.12 Permutation tests for OPLS-DA models of liver tissue samples

圖13 血清樣品火山圖Fig.13 Volcano plot for serum samples

3.8 代謝通路分析 將血清、 肝組織樣品差異代謝物通過Metabo Analyst （http： / /www. metaboan alyst. ca/faces/home. xhtml） 進(jìn)行通路分析, 以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選, 結(jié)果見圖15～16。

圖14 肝組織樣品火山圖Fig.14 Volcano plot for liver tissue samples

表3 血清樣品中差異性代謝物Tab.3 Differential metabolites in serum samples

表4 肝臟組織樣品中差異性代謝物Tab.4 Differential metabolites in liver tissue samples

圖15 血清樣品代謝通路Fig.15 Metabolic pathway of serum samples

圖16 肝組織樣品代謝通路Fig.16 Metabolic pathway of liver tissue samples

4 討論

4.1 甘油磷脂代謝 甘油磷脂是生物體內(nèi)含有量最豐富、 種類最復(fù)雜的磷脂之一, 其代謝通路也是肝癌血清、 組織代謝組學(xué)研究中報道最多的受干擾通路之一[15]。 本實驗發(fā)現(xiàn), 給藥組大鼠體內(nèi)PE（40 ∶5）、 LysoPE （18 ∶0）、 LysoPE （22 ∶4）、LysoPE （24 ∶6） 含有量降低, PI （40 ∶6）、 PI（20 ∶4）、 PI （38 ∶3）、 PI （38 ∶4）、 LysoPC（18 ∶2）、 LysoPC （20 ∶4）、 LysoPE （20 ∶0）、LysoPE （18 ∶2） 含有量升高, 這也與前期報道相符合, 其中LysoPC 升高可能是PC 不足, 從而影響肝細(xì)胞中DNA 不能進(jìn)行甲基化和自我修復(fù), 導(dǎo)致肝細(xì)胞損害； PC 減少還會促進(jìn)過氧化脂質(zhì)合成,增強游離基對肝細(xì)胞的損害[16]。 研究表明,LysoPC 在藥物引起的肝毒性中有明顯變化[17]。 PE與細(xì)胞生長、 增殖和分化密切相關(guān), 是細(xì)胞凋亡的結(jié)果和誘因, 并可與PC 相互轉(zhuǎn)化, LysoPE （20 ∶0）、 LysoPE （18 ∶2） 上升可能是為了增補PC 不足[18], LysoPE （18 ∶ 0）、 LysoPE （22 ∶ 4）、LysoPE （24 ∶6） 下降的原因為LysoPE 是PE 在磷酯酶作用下產(chǎn)生的, 其含有量決定了LysoPE 水平[19]。 血清、 肝組織中差異代謝物的變化表明,給藥組大鼠發(fā)生了甘油磷脂代謝紊亂, 可能引起脂質(zhì)合成過程增多、 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)流動性和抗氧化能力下降, 使肝細(xì)胞受到損害, 從而引起肝臟毒性。

4.2 膽汁酸代謝 膽汁酸作為膽固醇代謝過程中的主要代謝產(chǎn)物, 具有調(diào)控膽固醇代謝、 促進(jìn)脂類消化吸收、 增加膽汁分泌等多種作用[20]。 血清膽汁酸水平能鑒別有毒物質(zhì)是否引起早期肝毒性, 不同種類肝毒性物質(zhì)均可致使功能性肝細(xì)胞數(shù)量減少, 導(dǎo)致膽汁酸合成能力下降, 同時盡管膽汁酸合成總量下降, 但血清其水平仍明顯升高, 與本實驗結(jié)果相符。 疏水性膽汁酸的積聚是膽汁淤積性肝損傷的主要原因[21], 它具有“去污性”, 可通過溶解細(xì)胞膜磷脂來引起肝細(xì)胞壞死[22]。 本實驗發(fā)現(xiàn),給藥組大鼠血清?；悄懰幔═CA）、 ?；蛆Z去氧膽酸（TCDCA）、 3-氧代-4-6-二氫膽酸（CA） 含有量升高, 劉凱莉等[23]報道, 游離膽汁酸CA 為疏水性, 并證實它與細(xì)胞毒性密切相關(guān)； Sagawa等[24]發(fā)現(xiàn), TCA、 TCDCA 均為疏水性, 而且CA、TCA、 TCDCA 含有量升高可引起肝內(nèi)膽汁淤積,導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁酸代謝紊亂, 進(jìn)而產(chǎn)生肝毒性。 肝組織中TCDCA 含有量降低, 可能是由于肝細(xì)胞受損, 肝細(xì)胞清除TCDCA 能力下降, 出于對肝細(xì)胞的保護(hù)機制, 減少鵝去氧膽酸（CDCA） 與牛磺酸的結(jié)合, 代償性地使肝內(nèi)TCDCA 含有量降低。

5 結(jié)論

本實驗在前期研究基礎(chǔ)上, 通過土三七水煎劑灌胃法建立大鼠肝毒性模型, 以血清、 肝組織為樣本, 利用代謝組學(xué)技術(shù), 從內(nèi)源性代謝物變化角度初步探討了該藥材致大鼠肝毒性的作用機制。 結(jié)果, 土三七致肝毒性機制可能與甘油磷脂、 膽汁酸代謝紊亂有關(guān), 這進(jìn)一步揭示了該藥材肝毒性機制, 為有毒中藥的毒性機制研究提供新的策略和方法。