劉培培， 施 慧， 王 靚， 高 歌， 沈安魯

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院， 安徽 合肥230012； 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院， 安徽 合肥230012；3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 安徽 合肥230012）

糖尿病是一種重要的非傳染性慢性疾病, 威脅著人類健康[1], 由其引起的心血管疾病發(fā)生率和死亡率也逐年上升[2], 其中糖尿病心肌病是由糖代謝異常引起心臟原發(fā)性的結(jié)構(gòu)和功能的損傷, 也是獨立于心臟瓣膜疾病、 高血壓等原因所致的特異性心肌疾病, 早期以心臟舒張功能障礙為主, 然后導(dǎo)致收縮功能損傷, 射血分?jǐn)?shù)下降, 從而引發(fā)心力衰竭, 最終致死[3-4]。

丹蛭降糖膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑, 臨床廣泛應(yīng)用于糖尿病心血管并發(fā)癥防治[5], 療效理想。 本實驗研究丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用及其機制, 為該制劑臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 120 只清潔級SD 雄性大鼠, 體質(zhì)量（200±20） g, 由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物許可證號SCXK （皖） 2011-002, 調(diào)節(jié)室溫20～25 ℃, 定時通風(fēng)換氣, 自由攝食飲水。

1.2 藥物 丹蛭降糖膠囊（皖藥制字Z20090006,專利號ZL200310112845.1） 由丹皮、 太子參、 澤瀉、 菟 絲 子、 水 蛭、 生 地 黃 等 組 成, 批 號20151106； 鹽酸二甲雙胍片由上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn), 批號1601055, 國藥準(zhǔn)字H20023370。

1.3 儀器 血糖儀[中國強生（上海） 醫(yī)療器材有限公司, 穩(wěn)豪倍優(yōu)型]； RM2016 型輪轉(zhuǎn)式切片機（中國徠卡儀器有限公司）； BX51 型正置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）； ABI2720 型普通PCR 儀（美國ABI 公司）； 熒光定量PCR 儀（美國Thermo 公司）； Amersham Imager 600 型成像儀（美國GE 公司）。

1.4 試劑 鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司, 批號20160107324）； Masson 染色試劑盒（索萊寶科技有限公司, 批號20151026）； 伊紅染色液（批號1410A23）、 蘇木素染色液（批號1526A15） （雷根生物技術(shù)有限公司）； 兔抗鼠TGF-β1、 Smad2、Smad3 抗 體 （英 國Abcam 公 司, 批 號92486、33875、 40854）； 山羊抗兔IgG （碧云天生物科技有限公司, 批號21020）； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit, 美國Thermo Fisher 公司）； ECL 超敏試劑盒（美國Thermo Scientific 公司, 批號RF232184A）。

2 方法

2.1 模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后, 隨機抽取15 只作為正常對照組, 普通鼠飼料喂養(yǎng)； 其余大鼠喂養(yǎng)高脂飼料（含碳水化合物51%、 蛋白質(zhì)14%、 脂肪35%）。 4 周后禁食不禁水12 h, 正常對照組大鼠腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.2）, 其余各組大鼠腹腔注射1%鏈脲佐菌素（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為溶劑, pH=4.2）,劑量35 mg/kg, 3 d 后尾尖部針刺取血, 檢測隨機血糖, ≥16.7 mmol/L 表明造模成功； 造模未成功的大鼠再次禁食12 h 后, 腹腔注射1%鏈脲佐菌素（30 mg/kg）, 3 d 后再次檢測隨機血糖, 若仍未達(dá)標(biāo)則予以剔除[6-7]。

2.2 分組及給藥 造模成功的大鼠隨機分成5 組,每組15 只, 分別為丹蛭降糖膠囊低、 中、 高劑量組（270、 540、 1 080 mg/kg, 分別相當(dāng)于臨床成人日用量的0.5、 1、 2 倍等效量）、 模型組（等容量蒸餾水）、 陽性藥組（150 mg/kg 二甲雙胍）, 并另設(shè)正常對照組（等容量蒸餾水）, 正常組、 模型組大鼠灌胃給予蒸餾水, 其余各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物, 劑量10 mL/kg, 連續(xù)8 周。 末次給藥后30 min, 各組大鼠腹腔注射3.5% 水合氯醛（10 mL/kg） 麻醉, 無菌條件下腹主動脈取血, 分離血清, -80 ℃冰箱中保存, 無菌剖取心臟。

2.3 組織染色 大鼠心肌組織用4%多聚甲醛固定, 石蠟包埋后切片, 分別采用HE、 Masson 染色觀察其病理變化。

2.3.1 HE 染色 切片經(jīng)二甲苯、 無水乙醇及95%、 85%、 75% 乙醇處理后, 蘇木精染色, 水洗, 1%鹽酸酒精鏡檢分化, 置于70 ℃水中返藍(lán),伊紅染色, 再次沖洗后梯度酒精脫水, 二甲苯、 中性樹膠封片, 顯微鏡下觀察。

2.3.2 Masson 染色 切片, 脫蠟, Weigert 鐵蘇木素染色液染色, 酸性乙醇分化, 水洗, 麗春紅品紅染色液染色, 磷鉑酸浸染, 苯胺藍(lán)染液染色, 乙醇脫水, 二甲苯透明, 中性樹膠封片, 顯微鏡下觀察。

2.4 心肌組織TGF-β/Smad 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

2.4.1 總蛋白提取 剪取大鼠心肌組織, 稱定質(zhì)量, 每30 mg 組織加入1.0 mL RIPA 細(xì)胞裂解液（含1 μmol/L PMSF）, 冰上勻漿至組織完全裂解,12 000×g 離心5 min, 收集上清液, 調(diào)整蛋白樣品濃度至約5 μg/μL, 按1 ∶4 比例加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液, 沸水浴加熱5 min 以充分變性蛋白, 置于-20 ℃冰箱中待用。

2.4.2 檢測方法 采用Western blot 法。 每孔加入蛋白總量為30 μg, 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（5%濃縮膠80 V, 10%分離膠120 V） 2 h, 凝膠在120 V 下轉(zhuǎn)膜2 h 后室溫封閉2 h, TBST 洗滌3 次, 放入一抗孵育盒中過夜, 第2 天從孵育盒中拿出, TBST洗滌3 次, 繼續(xù)封閉2 h, TBST 洗滌3 次, 按照ECL 發(fā)光試劑盒說明書操作步驟于凝膠成像儀上自動曝光。 所得蛋白條帶通過Image J 蛋白條帶分析軟件進(jìn)行分析。

2.5 心肌組織TGF-β/Smad 信號通路相關(guān)mRNA表達(dá)檢測 采用RT-qPCR 法。 取大鼠心肌組織總RNA, 核酸蛋白測定儀測定OD260nm/OD280nm比值（1.8～2.0）, 計算RNA 濃度和純度, PrimeScriptTMRTreagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 選擇SYBR Premix ExTaq Ⅱ進(jìn)行操作, 反應(yīng)條件為95 ℃5 min,95 ℃10 s, 60 ℃ 30 s, 40 個循環(huán), 獲得循環(huán)閾值（Ct）, 采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達(dá)量。 根據(jù)Gen-Bank 提供的基因序列設(shè)計特異性引物, βactin 為正向（3′-5′） CCCATCTATGAGGGTTACGC,反向（5′-3′） TTTAATGTCACGCACGATTTC； TGFβ1 為 正 向 （ 3′-5′） CTAATGGTGGAC CGCAACAAC, 反向（5′-3′） CACTGCTTCCCGAATGTCTGA； Smad2 為正向 （3′-5′） AGCAGGAATTGAGCCACAGAGT, 反 向 （ 5′-3′） GACAGGGGAGAGAGTGGTAGGAG； Smad3 為 正 向 （3′-5′）GGGAGACTGGACGAAAATAGCA, 反 向 （ 5′-3′）GGGAGACTGGACGAAAATAGCA。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理,結(jié)果以±s） 表示, 組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠心肌組織HE 染色 圖1 顯示, 正常組大鼠心肌組織染色均勻, 心肌細(xì)胞排列整齊、 結(jié)構(gòu)清晰； 模型組大鼠心肌斷裂、 排列紊亂、 松散并呈波浪狀, 細(xì)胞形態(tài)模糊, 心肌細(xì)胞肌質(zhì)溶解, 成纖維細(xì)胞增多并伴有炎性細(xì)胞浸潤； 與模型組比較,陽性藥組、 丹蛭降糖膠囊組大鼠心肌組織染色較均勻, 肌纖維排列較整齊, 方向趨于一致, 心肌纖維斷裂情況減輕, 細(xì)胞排列整齊, 成纖維細(xì)胞明顯減少, 有少量炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠心肌組織HE 染色（×200）Fig.1 HE staining of rat myocardial tissues in various groups （×200）

3.2 大鼠心肌組織Masson 染色 圖2 顯示, 與正常組比較, 模型組大鼠心肌組織可見大量膠原沉積, 并伴有顯著間質(zhì)纖維化； 與模型組比較, 陽性藥組、 丹蛭降糖膠囊組大鼠有少量膠原沉積, 心肌纖維化程度明顯改善, 均趨于正?；?/p>

3.3 丹蛭降糖膠囊對TGF-β/Smad 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 圖3 顯示, 與正常組比較, 模型組TGF-β1、 Smad2、 Smad3 蛋 白 表 達(dá) 顯 著 增 加（P＜0.01）； 與模型組比較, 丹蛭降糖膠囊組三者蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05, P＜0.01）。

圖2 各組大鼠心肌組織Masson 染色（×200）Fig.2 Masson staining of rat myocardial tissues in various groups （×200）

3.4 丹蛭降糖膠囊對TGF-β1 mRNA 表達(dá)的影響圖4 顯示, 與正常組比較, 模型組TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.01）； 與模型組比較, 丹蛭降糖膠囊組其mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

4 討論

糖尿病發(fā)病機制較復(fù)雜, 尚不明確, 普遍認(rèn)為與脂質(zhì)代謝紊亂、 線粒體功能障礙、 炎癥反應(yīng)、 心肌細(xì)胞代謝障礙、 心肌微血管病變等多種病理因素密切相關(guān)[7-8]。 糖尿病心肌病的病理表現(xiàn)主要為心臟質(zhì)量指數(shù)增加、 局灶性心肌壞死、 心肌肥大以及心肌纖維化等[9-11]。

由糖尿病引起的心血管病變病程較長, 中醫(yī)認(rèn)為, 這會導(dǎo)致機體日久陰傷氣耗, 氣陰兩傷, 經(jīng)脈失于濡養(yǎng), 陰陽氣血紊亂[12-14], 大量臨床研究表明[15], 糖尿病以氣陰兩虛為主, 血瘀阻絡(luò)是糖尿病的基本病理變化, 并貫穿于糖尿病及其心血管病變的全過程[14]。 心肌纖維化由心肌成纖維細(xì)胞所致, 心肌成纖維細(xì)胞分泌合成心肌間質(zhì), 其主要成分為膠原蛋白, 高糖能促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化, 從而合成更多的膠原蛋白, 使細(xì)胞外基質(zhì)沉積, 導(dǎo)致心肌纖維化。

圖3 各組TGF-β1、 Smad2、 Smad3 蛋白表達(dá)Fig.3 TGF-β1， Smad2 and Smad3 protein expressions in various groups

圖4 各組TGF-β1 mRNA 表達(dá)Fig.4 TGF-β1 mRNA expressions in various groups

TGF-β1 是一種促纖維化的細(xì)胞因子, 具有分化、 細(xì)胞增殖、 細(xì)胞凋亡、 粘附等生物調(diào)節(jié)效應(yīng),其過量表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積, 最終形成心肌纖維化； Smad2、 Smad3 參與TGF-β1 誘導(dǎo)的生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 是Smad 家族成員, 具有促進(jìn)纖維化的作用。 研究表明[16], TGF-β/Smad 信號通路的激活能誘導(dǎo)心肌纖維化, 被抑制后能減輕心肌纖維化,改善心衰大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常。

本實驗發(fā)現(xiàn), 丹蛭降糖膠囊可明顯改善大鼠心肌組織病理學(xué)變化, 同時對大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3、 Smad2 蛋白過度表達(dá), 以及TGF-β1 mRNA過度表達(dá)起到顯著的抑制作用, 表明該制劑可緩解糖尿病大鼠心肌組織損傷, 抑制心肌纖維化, 其作用機制可能與抑制TGF-β/Smad 信號通路過度激活有關(guān)。