左瑞庭， 王西彬

[河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院）， 河南 鄭州450002]

類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病, 目前已知滑膜細胞、 淋巴細胞、 軟骨細胞等多種細胞類型參與其發(fā)生發(fā)展, 其病理特點主要包括滑膜襯里細胞增生、 炎性細胞浸潤等等[1]。 風濕性關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細胞作為一種類 “腫瘤細胞”, 其惡性增生、 侵襲、 遷移在類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。 目前, 臨床上針對類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療目標主要是減少疼痛, 減緩進一步損害[3]。

梣酮是白鮮皮Dictamnus dasycarpus Turcz. 有效成分, 具有神經(jīng)保護、 抑制癌癥、 抗炎作用[4],可通過抑制NF-κB 信號通路、 NLRP3 炎癥小體來改善結(jié)腸炎小鼠的炎性浸潤[5], 近期有研究發(fā)現(xiàn)給予梣酮后小鼠有滑膜炎癥和破骨細胞生成[6],但其對滑膜細胞增生及遷移的作用尚未見報道。 因此, 本實驗觀察梣酮對LPS 介導滑膜細胞增殖和遷移的影響。

1 材料

類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞系MH7A （日本理化學研究所）； 胎牛血清（FBS）、 RPMI 1640 細胞培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司）； BrdU 試劑盒（瑞士Roche 公司）； LPS 和青霉素/鏈霉素 （美國Sigma 公司）； CCK-8 試劑盒、 乳酸脫氫酶（LDH）釋放試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；MMP1、 MMP9、 MMP13、 p-JNK、 t-JNK、 p-STAT3、 t-STAT3、 β-actin 抗 體 （英國Abcam 公司）； 辣根過氧化酶標記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。 梣酮（批號B20136, 含有量≥98%, 上海源葉生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組 MH7A 細胞接種于含10%FBS、 1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中,在5%CO2、 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 隨機分為對照組（細胞經(jīng)等體積PBS 處理24 h）、 LPS 組（細胞經(jīng)10 μg/mL LPS 處理24 h）、 梣酮低劑量組（細胞經(jīng)10 μmol/L 梣酮預處理30 min, 再經(jīng)LPS 處理）、梣酮中劑量組（細胞經(jīng)20 μmol/L 梣酮預處理30 min, 再經(jīng)LPS 處理）、 梣酮高劑量組（細胞經(jīng)50 μmol/L 梣酮預處理30 min, 再經(jīng)LPS 處理）。

2.2 細胞活性檢測 采用CCK-8 法。 按照5×103/孔的密度將細胞接種于96 孔板中, 培養(yǎng)24 h后按“2.1” 項下方法處理, 每組3 個復孔。 實驗結(jié)束后棄除培養(yǎng)基, PBS 緩沖液清洗3 次, 每孔加入無血清培養(yǎng)基100 μL、 CCK-8 溶液10 μL, 于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h, 酶標儀在450 nm波長處測定吸光度, 以630 nm 為參考波長。

2.3 LDH 釋放檢測 細胞接種于96 孔板中, 培養(yǎng)24 h 后10、 20、 50 μmol/L 梣酮處理24 h。 在預定檢測點前1 h, 在樣品最大酶活性對照孔中加入LDH 釋放試劑, 實驗結(jié)束后離心培養(yǎng)板, 各孔取120 μL 上清液于另一培養(yǎng)板中, 加入60 μL LDH 檢測工作液, 室溫下反應30 min, 酶標儀在490 nm 波長處測定各孔吸光度。

2.4 BrdU 摻入 按照5×103/孔的密度將細胞接種于96 孔板中, 培養(yǎng)24 h 后按“2.1” 項下方法處理。 收樣前8 h, 摻入終濃度10 mmol/L 的BrdU, 棄上清, 加入200 μL 固定變性液室溫下反應30 min, 棄上清, 加入100 μL anti-BrdU-POD 工作液, 室溫下反應90 min, 棄上清, 各孔加入100 μL底物反應15 min, 2 mol/L 終止反應。 然后,酶標儀在450 nm 波長處測定各孔吸光度, 以690 nm為參考波長。

2.5 Transwell 實驗 將細胞接種于6 孔板中, 待融合度達到60% ～70%時, 按“2.1” 項下方法分組（梣酮各劑量組用相應藥物預處理30 min）, 24孔板中放入8 μm 小室, 取100 μL 密度1.0×105/mL的細胞懸液接種于上室中, 下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基（含10 μg/mL LPS, 以及10、20、 50 μmol/L 梣酮）, 培養(yǎng)箱中遷移24 h。 取出上室, 清洗3 次后甲醇固定30 min, 0.1%結(jié)晶紫染色20 min, 于顯微鏡下隨機選取5 個視野計數(shù), 取平均值作為遷移細胞數(shù)。 細胞侵襲實驗與遷移實驗類似, 接種細胞前小室鋪上Matrigel 膠, 培養(yǎng)箱中放置48 h, 經(jīng)固定、 染色后計算遷移、 侵襲細胞數(shù)。

2.6 MMP1、 MMP9、 MMP13、 p-JNK、 p-STAT3蛋白表達檢測 采用Western blot 法。 培養(yǎng)MH7A細胞, 按“2.1” 項下方法處理, 實驗結(jié)束后棄培養(yǎng)基, PBS 清洗細胞3 次, 加入細胞裂解液, 4 ℃下 反 應 15 min。 刮 取 細 胞, 超 聲 裂 解,12 000 r/min離心15 min, 收集上清, BCA 試劑盒測定各組樣品蛋白濃度。 50 μg 蛋白在SDS-PAGE膠上分離并轉(zhuǎn)移至NC 膜上, 5%脫脂牛奶封閉1 h,加入MMP1、 MMP9、 MMP13、 p-JNK、 p-STAT3、t-JNK、 t-STAT3、 β-actin 的一抗, 4 ℃下過夜孵育, TBST 洗膜3 次, 加入辣根過氧化酶標記的二抗, 室溫下反應1 h, 加入顯色液反應1 ～2 min,顯影, 通過Image J 軟件統(tǒng)計各蛋白條帶的灰度值。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過GraphPrism 5.0 軟件進行處理, 數(shù)據(jù)以s） 表示, 組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示具有顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 梣酮對MH7A 細胞活性、 LDH 釋放的影響 圖1 顯示, 與對照組（0 μmol/L） 比較, 梣酮各劑量組細胞活性、 LDH 釋放無顯著差異（P ＞0.05）。

圖1 梣酮對MH7A 細胞活性（A）、 LDH 釋放（B） 的影響Fig.1 Effects of fraxinellone on MH7A cell viability （A） and LDH release （B）

圖2 梣酮對MH7A 細胞增殖的影響Fig.2 Effects of fraxinellone on MH7A cell proliferation

3.2 梣酮對MH7A 細胞增殖的影響 圖2A 顯示,與對照組比較, LPS 組細胞活性顯著升高 （P ＜0.05）； 與LPS 組比較, 梣酮組細胞活性顯著降低（P＜0.05）, 并呈現(xiàn)劑量依賴性。 圖2B 顯示, 與對照組比較, LPS 組BrdU 相對摻入量顯著升高（P＜0.05）； 與LPS 組比較, 梣酮組BrdU 相對摻入量顯著降低（P＜0.05）, 并呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.3 梣酮對細胞侵襲、 遷移的影響 圖3A 顯示,與對照組比較, LPS 組細胞侵襲數(shù)顯著增加（P＜0.05）； 與LPS 組比較, 梣酮組顯著抑制細胞侵襲（P＜0.05）, 并呈劑量依賴性。 圖3B 顯示, 與LPS組比較, 梣酮組細胞遷移數(shù)顯著降低（P＜0.05）。圖3C 顯 示, 與 對 照 組 比 較, LPS 組 MMP1、MMP9、 MMP13 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）； 與LPS 組比較, 梣酮組三者蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

3.4 梣酮對JNK、 STAT3 信號通路的影響 圖4顯示, 與對照組比較, LPS 組p-JNK、 p-STAT3 蛋白表達顯著上調(diào)（P ＜0.05）； 與LPS 組比較, 梣酮組兩者蛋白蛋白顯著下調(diào)（P＜0.05）, 并呈劑量依賴性。

4 討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎是最常見的自身免疫性疾病之一, 由全身性T 細胞、 B 細胞失調(diào)引起, 進而導致慢性炎癥、 滑膜惡性增生、 關(guān)節(jié)軟骨破壞[7]。 其中,成纖維滑膜細胞是增生性滑膜中主要細胞類型, 呈現(xiàn)類腫瘤樣增生, 侵入軟骨及股骨而導致炎癥加重、骨降解, 促進病情發(fā)展[8], 故如何阻止成纖維滑膜細胞惡性增生及遷移是目前的研究熱點之一。

本實驗發(fā)現(xiàn), 梣酮能有效抑制LPS 誘導MH7A細胞的增殖及遷移。 該成分存在于多種中草藥（如白鮮、 苦楝、 松果菊等）, 具有多種藥理活性,如抗血小板凝集、 舒張血管[9]、 抗菌[10]等作用；抑制LPS 誘導的炎癥反應[11], 在急性肝損傷中抗炎活性明顯[12]； 阻礙癌細胞增殖、 微管形成, 抑制侵襲、 遷移、 裸鼠移植瘤生長[4]； 也是抗癌藥增生平片的主要成分, 可抑制口腔鱗癌細胞增殖[13], 表明梣酮具有抗癌活性, 本實驗結(jié)果與上述研究一致。另外, MH7A 作為“類腫瘤細胞”, 其增殖、 侵襲、遷移能力在梣酮處理后被明顯抑制。

MMPs 在關(guān)節(jié)滑液中的堆積和激活與關(guān)節(jié)韌帶損傷后的自我修復能力密切相關(guān), 在關(guān)節(jié)炎滑膜細胞中其表達明顯上調(diào)[14-15], 研究表明它幾乎能降解軟骨基質(zhì)中所有成分, 故抑制其活性或表達可對軟 骨 起 到 一 定 的 保 護 作 用。 MMP1、 MMP9、MMP13 是MMPs 家族3 個重要成分, 本實驗發(fā)現(xiàn)梣酮可有效降低三者表達, 表明該成分不僅抑制了滑膜細胞增殖和遷移, 而且可通過負調(diào)控MMPs 在關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮保護作用。

圖3 梣酮對MH7A 細胞侵襲和遷移的影響Fig.3 Effects of fraxinellone on MH7A cell invasion and migration

圖4 梣酮對JNK （A）、 STAT3 （B） 信號通路的影響Fig.4 Effects of fraxinellone on JNK （A） and STAT3 （B） signaling pathways

多項研究發(fā)現(xiàn), 梣酮能調(diào)控多種信號通路, 如與細胞生長、 細胞周期、 癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的JNK、 STAT3、 NF-κB 信號通路。 其中, JNK在類風濕性關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細胞和滑膜組織中激活, 故抑制該信號通路可改善關(guān)節(jié)炎小鼠足腫脹[16], 而激活后能促進滑膜細胞中炎癥因子分泌和表達[17]； STAT3 對成纖維滑膜細胞生長及存活具有重要作用, 抑制后可誘導滑膜細胞凋亡[18]；阻斷兩者信號通路后, 可降低滑膜細胞的侵襲和遷移能力[19], 可能有效抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展。 有研究表明, 梣酮可下調(diào)JNK、 STAT3 表達[4,20], 與本實驗結(jié)果類似, 提示該成分可能通過負調(diào)控JNK、 STAT3 信號通路來抑制MH7A 細胞增殖及遷移。

綜上所述, 梣酮可負調(diào)控JNK、 STAT3 信號通路, 抑制MH7A 細胞增殖, 阻礙侵襲和遷移, 并下調(diào)MMP1、 MMP9、 MMP13 蛋白表達, 本實驗可為該成分防治類風濕性關(guān)節(jié)炎提供一定理論基礎(chǔ)。