楊曉榮，黃永春，劉仲齊，王常榮，張長波

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191）

鎘（Cd）是一種對人體毒性較高的有害重金屬元素[1]。由工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)導致的環(huán)境污染，已經(jīng)使我國有大約2.786×105hm2的農(nóng)用地受到Cd污染[2]，耕地Cd污染點位超標率高達7%[3]，農(nóng)田Cd污染已成為重要的農(nóng)業(yè)環(huán)境問題。水稻籽粒中的Cd主要來源于土壤[4]，土壤輕度Cd污染即可導致稻米Cd含量超過國家食品安全限量標準[5]，由食用稻米導致的Cd攝入量占我國人群Cd攝入量的56%[6]。由于土壤Cd污染的隱蔽性、累積性和長期性以及Cd在水稻中累積受其自身形態(tài)[7-9]、作物品種及生育期[10-11]等多種因素影響，我國大面積稻田Cd污染治理技術難度大，國內(nèi)外至今仍缺乏成熟且能被大面積推廣應用的修復技術[12-14]。因此，研發(fā)環(huán)境友好、農(nóng)戶可接受且易于大面積推廣的農(nóng)藝生產(chǎn)措施，對保障水稻安全生產(chǎn)具有重要意義。

Cd向水稻籽粒遷移轉(zhuǎn)運的機制十分復雜。水稻通過木質(zhì)部從根向莖轉(zhuǎn)運Cd的能力是決定水稻莖稈中Cd積累濃度的主要影響因素[15]。Cd進入水稻莖、葉等組織后則主要通過韌皮部向水稻籽粒中轉(zhuǎn)運，幾乎100%的籽粒Cd來源于韌皮部運輸[16-17]。在水稻開花期調(diào)控Cd經(jīng)韌皮部向籽粒中轉(zhuǎn)運是一種降低水稻籽粒Cd含量的重要途徑。近年來，大量研究表明在水稻開花期噴施 Si[18-19]、Se[20]、Zn[21]、Mn[22]等元素，可以顯著降低Cd在水稻籽粒中的累積量。此外，在水稻開花期噴施小分子酸類物質(zhì)也可以顯著降低水稻籽粒中的Cd含量[23]。當前，在水稻開花期噴施葉面調(diào)理劑已成為一種降低水稻籽粒Cd含量的重要農(nóng)藝措施，具有廣泛的應用前景。

重金屬螯合劑2，3-二巰基丁二酸（DMSA）分子中含有兩個巰基，可以與多種有毒重金屬如Cd2+、Pb2+、Hg2+等形成穩(wěn)定的螯合物[24]，在醫(yī)療上可以作為重金屬中毒的解毒劑。該化合物具有水溶性較好、毒性低的特點，在全球范圍內(nèi)得到廣泛應用[25]。本研究于水稻開花期葉面噴施一次DMSA以探索噴施DMSA調(diào)控水稻韌皮部Cd轉(zhuǎn)運降低水稻籽粒中Cd含量的可行性，并探討DMSA降低水稻籽粒中Cd含量的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地點

在湖南省湘陰縣鶴龍湖鎮(zhèn)黃花嶺村選擇土壤和稻米Cd含量均超標的水稻田進行試驗。試驗田土壤類型為水稻土，其基本理化性質(zhì)為：pH 6.21，有機質(zhì)40.83 g·kg-1，全氮0.173%，全磷0.019%，全鉀1.3%，速效鉀83.87 mg·kg-1，速效磷16.2 mg·kg-1，陽離子交換量18.92 cmol·kg-1，Cd 0.71 mg·kg-1，Mn 360.71 mg·kg-1，Zn 172.71 mg·kg-1。

以當?shù)刂髟云贩N黃花占為試驗材料，種子購于當?shù)胤N子公司。2，3-二巰基丁二酸（DMSA）購于國藥集團，分析純。

1.2 試驗方法

田間小區(qū)面積設定為10 m2（5 m×2 m）。試驗小區(qū)共分1個對照處理組和3個試驗處理組，每個處理組重復4次。將適量DMSA溶于1 mol·L-1的KOH溶液中，用田間灌溉水稀釋至2 L，用0.5 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH為8.0～8.5，分別配制成2、3、4、5 mmol·L-1的DMSA水溶液。于水稻開花期向葉面手動均勻噴施處理液1次。對照組噴施2 L pH為8.0～8.5的田間灌溉水。

水稻采用旱育秧方式，于2018年7月18日移栽。施肥方法依照水稻測土配方施肥技術，每公頃施用尿素398 kg、鉀肥210 kg，其中基肥占總施肥量的62%，分蘗肥占總量的29%，穗粒肥占總量的9%。整個生育期無顯著病蟲害發(fā)生。

1.3 樣品的采集與處理

于水稻成熟期，選取小區(qū)中心長3.0 m、寬1.5 m處噴施較為均勻部分，用鐵鍬每小區(qū)隨機連根挖取3株水稻植株，裝入網(wǎng)袋。常溫自然風干后手動將水稻植株分為籽粒、穗軸、穗頸、旗葉、頂端第一節(jié)、頂端第二節(jié)、頂端第二葉、頂端第二節(jié)間、基部莖葉、根，共計10個部分。用蒸餾水漂洗3次后于70℃烘干72 h，涼卻至室溫后將各部分磨粉，分別收集到自封袋中，以備消解。

1.4 Cd及6種水稻礦質(zhì)營養(yǎng)元素的測定方法

參照Liu等[10]的方法，分別稱取磨碎后的植株樣品約0.25 g于消解管中，加入7 mL濃硝酸，搖勻，室溫下靜置12 h。將消解管放入電熱消解儀上進行消解，110℃加熱2.5 h后冷卻至室溫，再向消解管中加入1 mL H2O2搖勻，110℃繼續(xù)加熱1.5 h。將消解管內(nèi)的液體于170℃下趕酸至0.5 mL以內(nèi)，再將消解液稀釋并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶內(nèi)定容，用ICP-MS測定樣品中Cd、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn含量。本方法對7種元素的回收率為95%～105%，檢出限為0.3～5.5g·kg-1。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用Microsoft Excel進行相關數(shù)據(jù)的計算、統(tǒng)計與處理。利用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，新復極差法（Ducan′s）進行多重比較、差異顯著性檢驗。利用Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 DMSA對水稻不同器官Cd含量的影響

由圖1A可見，籽粒中Cd含量隨著DMSA噴施濃度增加表現(xiàn)出顯著的降低趨勢，與對照相比籽粒中Cd含量降低幅度為15.84%～46.09%。但當DMSA使用濃度高于4 mol·L-1時，籽粒中Cd含量未表現(xiàn)出持續(xù)下降，表明繼續(xù)增加DMSA用量已不能起到持續(xù)降低籽粒Cd含量的效果。穗軸Cd含量也表現(xiàn)出顯著下降趨勢，不同處理Cd降低幅度為10.03%～41.41%，同樣當DMSA噴施濃度高于4 mol·L-1時穗軸中Cd含量也未出現(xiàn)持續(xù)降低現(xiàn)象。

由圖1B可見，噴施DMSA后不同處理間旗葉中Cd含量與對照相比未出現(xiàn)顯著差異，但是穗頸和頂端第一節(jié)中Cd含量出現(xiàn)顯著降低，兩種器官中Cd含量與對照相比的降低幅度為9.13%～28.46%和18.30～38.32%。

圖1 噴施DMSA對水稻各器官中Cd含量的影響Figure 1 Effects of foliar application of DMSA on Cd content in rice organs

由圖1C可見，噴施DMSA后不同處理間頂端第二葉和頂端第二節(jié)中Cd含量與對照相比未出現(xiàn)顯著差異，但是頂端第二節(jié)間Cd含量則呈現(xiàn)出隨DMSA噴施濃度增加而顯著降低的趨勢，降低幅度為11.00%～34.76%。

由圖1D可見，噴施DMSA后不同處理間基部莖葉和根中Cd含量無顯著差異。

2.2 噴施DMSA對水稻Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

Cd在水稻不同器官中的濃度分布反應了其在水稻器官間的遷移能力，一般用轉(zhuǎn)移系數(shù)來表示。轉(zhuǎn)移系數(shù)為相鄰器官間Cd含量的比值：

轉(zhuǎn)移系數(shù)（TFa/b）=a器官Cd含量/b器官Cd含量。

由圖2A可見，在水稻開花期葉面噴施一次DMSA后，Cd由穗頸向穗軸的轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF穗軸/穗頸）隨著DMSA噴施濃度的增加表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，但不同處理間轉(zhuǎn)移系數(shù)的差異尚未達到顯著水平。由圖2B可見，當噴施DMSA后，Cd由旗葉向頂端第一節(jié)的轉(zhuǎn)移系數(shù)發(fā)生了顯著變化，隨著DMSA噴施濃度的增加，Cd由旗葉向頂端第一節(jié)的轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF頂端第一節(jié)/旗葉）呈顯著降低趨勢，表明噴施DMSA減少了Cd由旗葉向頂端第一節(jié)的轉(zhuǎn)運。開花期噴施DMSA對Cd在其他器官間的轉(zhuǎn)移系數(shù)沒有顯著改變，表明噴施DMSA對Cd在其他器官間的遷移轉(zhuǎn)運沒有顯著影響。

2.3 噴施DMSA對籽粒和穗軸中6種礦質(zhì)元素含量的影響

水稻開花期葉面噴施一次DMSA對水稻籽粒和穗軸中的礦質(zhì)元素含量影響如圖3所示。由圖3A至圖3E可見，噴施DMSA對水稻籽粒和穗軸中的K、Mg、Ca、Fe、Zn含量的影響不大，4個處理中礦質(zhì)元素含量與對照相比未形成顯著差異。但是，噴施高濃度DMSA對籽粒和穗軸中的Mn含量造成顯著影響（圖3F），與對照組相比噴施DMSA導致籽粒和穗軸中Mn含量分別降低5.79%～17.87%和13.51%～24.21%，表明水稻開花期葉面噴施DMSA影響了Mn向水稻籽粒中的轉(zhuǎn)運。

3 討論

圖2 噴施DMSA對水稻各器官間轉(zhuǎn)移系數(shù)的影響Figure 2 Effects of foliar application of DMSA on the transfer factors between rice organs

圖3 噴施DMSA對水稻籽粒和穗軸礦質(zhì)元素含量的影響Figure 3 Effects of foliar application of DMSA on mineral elements concentration in grains and rachises

動物實驗表明，DMSA在體內(nèi)通過分子中含有的兩個巰基與Cd形成穩(wěn)定的螯合物，最終以螯合態(tài)排出體外從而達到降低Cd毒性的目的[24-25]。有研究表明，Cd在水稻韌皮部傷流液中大部分與蛋白類、植物螯合素等物質(zhì)以結合態(tài)存在，小部分以離子形式存在[26]。蛋白螯合態(tài)的Cd并非一種穩(wěn)定形態(tài)，當遇到蛋白激酶后又會重新釋放出Cd2+。當DMSA進入水稻體內(nèi)后可與Cd2+競爭性結合形成螯合物。植物自身也可合成多種含有巰基的解毒化合物如PCs[27]、谷胱甘肽等[28]，它們都可以與Cd2+形成穩(wěn)定的化合物并儲存在植物液泡等器官中[29]，不僅降低了Cd對植物的脅迫效應，而且在一定程度上也降低了Cd向地上部的轉(zhuǎn)運。據(jù)此推斷，在水稻開花期葉面噴施DMSA主要是通過與水稻葉片等組織中的Cd2+形成螯合物來降低Cd向籽粒中的轉(zhuǎn)運?？梢姡瑖娛〥MSA降低籽粒中Cd含量的機制與噴施Zn2+[21]、Mn2+[22]等通過離子拮抗降低Cd向水稻籽粒中轉(zhuǎn)運導致籽粒中Cd含量降低的機制有所不同，也與噴施Si[18]增加水稻莖和葉片細胞壁固持Cd能力從而降低Cd向籽粒轉(zhuǎn)運的機制不同。為降低水稻籽粒中Cd含量，育種學家引入了基因編輯技術。當敲除負責調(diào)控水稻轉(zhuǎn)運Cd和Mn的Nramp5基因[30]后，無論是粳稻還是秈稻籽粒中Cd和Mn的濃度都出現(xiàn)大幅度降低，其中Mn濃度可下降80%以上[31-32]。在本研究中，噴施DMSA對水稻籽粒和穗軸中必需營養(yǎng)元素K、Mg、Ca、Fe、Zn的含量沒有顯著影響，但是在降低籽粒中Cd含量的同時也顯著降低了籽粒中Mn的濃度。噴施DMSA是否影響了Nramp5等基因的表達仍有待進一步研究。

關于水稻籽粒中Cd的來源日本學者給出了相互矛盾的結論。Fujimaki等[33]利用107Cd同位素示蹤技術的研究結果表明，在灌漿期水稻從土壤中吸收的Cd被運送到籽粒；Kashiwagi等[34]的研究結果表明水稻籽粒中Cd主要來自于抽穗前累積在葉片和莖稈中的Cd，抽穗后從根運送到莖稈和穗部的Cd不影響糙米中Cd的累積。喻華等[11]進一步研究表明，在田間水稻齊穗后土壤中有效Cd含量較低時，籽粒中的Cd同時來自于土壤和水稻體內(nèi)在齊穗前累積的Cd。葉片是向籽粒凈轉(zhuǎn)移Cd的主要器官，葉片衰老期Cd通過韌皮部向籽粒轉(zhuǎn)移是Cd再分配的主要過程[35]。在本研究中，隨著DMSA噴施濃度增加水稻籽粒中Cd含量呈現(xiàn)出顯著降低趨勢，最高降幅達到46.09%（圖1A），而旗葉中Cd含量則未出現(xiàn)顯著降低（圖1B），表明噴施DMSA降低了旗葉中Cd經(jīng)頂端第一節(jié)向籽粒的轉(zhuǎn)運，對水稻籽粒Cd含量的降低具有較大貢獻。Feng等[36]的研究表明，水稻的根和節(jié)是Cd進入水稻地上部的主要障礙，這兩個部位的Cd含量最高，當外界有效Cd含量較低時，進入水稻體內(nèi)的大部分Cd被固定到這兩個部位，這時水稻器官中Cd的再轉(zhuǎn)運成為籽粒中Cd的主要來源。在本研究中開花期噴施DMSA顯著降低了頂端第一節(jié)中Cd的含量（圖1B），此現(xiàn)象與噴施納米硅[19]降低籽粒Cd含量的現(xiàn)象一致，表明頂端第一節(jié)中Cd含量的降低對籽粒Cd降低也具有較大貢獻。

當開花期葉面噴施DMSA后，顯著降低了Cd由旗葉向頂端第一節(jié)的轉(zhuǎn)移系數(shù)（圖2B）。同時Cd由穗頸向穗軸的轉(zhuǎn)移系數(shù)（圖2A）也出現(xiàn)降低趨勢但并未達到顯著程度，其他器官中Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)并未見發(fā)生顯著變化。此結果與噴施DMSA后水稻葉片中Cd含量未見顯著變化相互印證。說明噴施DMSA影響籽粒中Cd含量降低的主要因素是降低了葉片Cd向籽粒的輸送。

DMSA對人體的毒性較低，可以在醫(yī)療上作為人體Cd、As、Pb、Hg等[24-25]重金屬中毒后的解毒劑，因此其對人體的安全性很高。目前，利用DMSA阻控Cd向水稻籽粒中轉(zhuǎn)運的研究鮮有報道，同時也未見DMSA是否對植物生長有負面影響的報道。本研究中同時開展了噴施DMSA對水稻產(chǎn)量影響的研究，稻谷產(chǎn)量與對照相比未見顯著差異（本文未提供具體數(shù)據(jù)）。當DMSA的噴施濃度超過4 mmol·L-1時水稻籽粒和穗軸中Cd含量并未出現(xiàn)持續(xù)降低（圖1A），此結果為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中DMSA的實際用量提供了指導。

4 結論

（1）在水稻開花期葉面噴施DMSA可以顯著降低籽粒中Cd含量。田間試驗表明，噴施一次DMSA使籽粒中Cd最高降幅可達46.09%。

（2）旗葉Cd向頂端第一節(jié)中的遷移率降低對籽粒Cd含量降低有較大貢獻。噴施DMSA顯著降低了Cd由旗葉向頂端第一節(jié)中的遷移系數(shù)，表明與對照相比旗葉中Cd向籽粒中轉(zhuǎn)運量顯著減少。

（3）巰基化合物DMSA是一種潛在的降Cd葉面調(diào)理劑，具有較好的應用前景。