畢慧欣 楊 瓊 李清初 曾 凝

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院1 腎內(nèi)科，2 內(nèi)分泌科，廣西桂林市 541000，電子郵箱：doctorkeyan@163.com)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)患病率在全球范圍內(nèi)逐年升高，是導致終末期腎病的主要原因，尚無特效藥物可以逆轉(zhuǎn)其腎臟損傷。在DN進展中，腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell，GMC)在不同損傷因素作用下，可表現(xiàn)為增殖肥大、凋亡、裂解、遷移、分泌大量的炎癥因子，而這可加重腎臟損害及促進DN持續(xù)進展[1]。由于DN存在糖、脂肪代謝紊亂，導致線粒體功能紊亂和體內(nèi)氧化應激水平的升高[2]。研究表明，高糖誘導的線粒體呼吸鏈產(chǎn)生過量活性氧是DN并發(fā)癥的啟動因素，表現(xiàn)為活性氧、丙二醛增多和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降[3-4]，因此降低氧化應激水平可有效防治DN進展。重樓皂苷Ⅱ是中藥重樓提取物。現(xiàn)代藥理學表明，重樓皂苷Ⅱ具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、消炎等作用[5]。本研究觀察重樓皂苷Ⅱ?qū)Ω咛歉深A下GMC細胞增殖及氧化應激的影響，以探討重樓皂苷Ⅱ治療DN的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠GMC株由上海第二醫(yī)科大學惠贈，低糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)、胰蛋白酶購自美國HyClone公司(批號：SH30021.01B、T1426)，胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)公司(批號：10082-147)，SOD、丙二醛試劑盒購自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司(批號：SD103、MS1401)，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲亞砜購自美國Sigma公司(批號：M2129、D2650)，重樓皂苷Ⅱ購自維克奇有限公司(批號：B01172201)，二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)試劑盒購自碧云天有限責任公司(批號：S0033)。青霉素購自石藥集團中諾藥業(yè)(批號：0171810402)，鏈霉素購自哈藥集團制藥總廠(批號：23020912)。

1.2 細胞培養(yǎng) 大鼠GMC株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度5.6 mmol/L)，于37℃、5% CO2無菌培養(yǎng)箱中孵育。當細胞融合成80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化并用計數(shù)板計數(shù)。細胞以1×105個/mL的密度培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中。當80%的細胞貼壁時，按實驗分組對細胞進行處理。

1.3 細胞分組 細胞穩(wěn)定傳代至對數(shù)生長期時，棄上清，加入無血清低糖培養(yǎng)液同步24 h后，將GMC按隨機數(shù)字表法分為4組。(1)正常對照組：即低糖組，用含5.6 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；(2)甘露醇對照組：含5.6 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；(3)高糖組：用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；(4)重樓皂苷Ⅱ組：用含25 mmol/L葡萄糖+20 μg/mL重樓皂苷Ⅱ的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將上述細胞于37℃、5% CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)的實驗。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性 GMC以3×103個/孔密度接種于96孔板中，貼壁24 h。按分組更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄上清液，每孔加入含0.5% MTT的培養(yǎng)基200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲亞砜，置溫箱中低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖情況。

1.5 紫外分光光度法測定SOD、丙二醛活性的測定 收集處理24 h后上述各組細胞上清液，按照SOD試劑盒說明書使用黃嘌呤氧化酶法測定細胞上清液中SOD的活性，紫外分光光度計在550 nm處測定樣品的A值，根據(jù)酶的定義，1 mL液體中SOD的抑制率為50%時對應的 SOD活性為1個單位。按照丙二醛試劑盒說明書使用硫代巴比妥酸法檢測丙二醛含量，紫外分光光度計在532 nm處測定樣品的A值。相同標本設(shè)3個復孔，重復3次。

1.6 DCFH-DA熒光探針標記法檢測活性氧含量 按照1 ∶1 000的比例用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，按照原位裝載探針的方法，取出干預24 h的培養(yǎng)板，去除細胞培養(yǎng)液，加入10 μmol/L的DCFH-DA 300 μL，陽性對照孔加入Rosup作為陽性對照。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，30 s/次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，激光共聚焦顯微鏡(德國萊卡公司，型號：TCS SP8 DIVE)下觀察GMC熒光強度并用多功能酶標儀(德國LabSystems Multiskan MS公司，型號：352型)檢測熒光強度。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組GMC增殖活性比較 與正常對照組比較，高糖組、重樓皂苷Ⅱ組細胞的A值升高(P<0.05)，而甘露醇對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與高糖組比較，重樓皂苷Ⅱ組細胞的A值降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組細胞A值比較(x±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

2.2 4組GMC丙二醛含量及SOD活性比較 與正常對照組比較，高糖組、重樓皂苷Ⅱ組細胞的丙二醛含量升高，SOD活性降低(P<0.05)，但甘露醇對照組差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。與高糖組比較，重樓皂苷Ⅱ組細胞的丙二醛含量降低，而SOD活性升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組GMC丙二醛含量及SOD活性比較(x±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

2.3 4組GMC活性氧含量比較與正常對照組比較，高糖組、重樓皂苷Ⅱ組細胞的活性氧含量升高(P<0.05)，甘露醇對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與高糖組比較，重樓皂苷Ⅱ組細胞的活性氧含量降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組GMC活性氧含量比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

3 討 論

DN的發(fā)生涉及氧化應激、遺傳因素、代謝異常、血流動力學改變、細胞因子等因素。DN患者體內(nèi)活性氧的濃度較正常人明顯升高，提示在DN的發(fā)病過程中，氧化應激系統(tǒng)起著非常重要的作用[6]。

GMC在正常情況下基本不增殖，只有在高糖、氧化應激、炎癥等病理情況下可異常增殖。高糖環(huán)境下發(fā)生異常增殖的GMC，是最活躍的固有細胞成分，增殖的GMC除了突入腎小球毛細血管腔導致管腔狹窄或閉塞，還可以使細胞外基質(zhì)大量地產(chǎn)生并積聚，最終導致腎小球硬化。因此，抑制GMC激活、增殖以及促進GMC凋亡是防治糖尿病的有效途徑。既往研究表明重樓對多種腫瘤細胞均有抑制作用，可誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖等[7]。本課題組前期研究也顯示，脂多糖可誘導GMC增殖，重樓含藥血清可通過調(diào)節(jié)B細胞淋巴瘤-2基因表達誘導GMC凋亡，抑制GMC異常增殖，發(fā)揮其治療作用[8]。本研究利用25 mmol/L葡萄糖刺激GMC，建立細胞高糖損傷模型，觀察重樓皂苷Ⅱ?qū)MC的保護作用，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，高糖組細胞A值明顯升高(P<0.05)，說明高糖可明顯誘導GMC增殖，而重樓皂苷Ⅱ組細胞的A值低于高糖組(P<0.05)，說明重樓皂苷Ⅱ可抑制GMC的增殖，進而保護糖尿病腎臟固有細胞，這與既往相關(guān)研究結(jié)果相似[9-10]。

重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖，是中國傳統(tǒng)民間醫(yī)藥。目前已經(jīng)從重樓里分離出許多不同的活性物質(zhì)成分，具有顯著的抗腫瘤、抗感染、器官保護、免疫調(diào)節(jié)及止血鎮(zhèn)痛等功效，近年來其抗氧化應激作用備受關(guān)注[7]。氧化應激是細胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生與清除的失衡，導致活性氧在細胞內(nèi)蓄積而引起氧化損傷的過程。DN中活性氧的產(chǎn)生主要來源于糖基化終末產(chǎn)物途徑、多元醇代謝反應途徑、蛋白激酶C活化作用途徑和線粒體呼吸鏈功能不足等[9]。高血糖直接作用于血管內(nèi)皮細胞可產(chǎn)生活性氧，活性氧產(chǎn)生過多是糖尿病及其血管并發(fā)癥發(fā)生的主要因素，可直接氧化和破壞與之結(jié)合的DNA、蛋白、脂質(zhì)和碳水化合物，還可以作為第二信使參與細胞信號轉(zhuǎn)導，激活增殖、凋亡、損傷和炎癥等應激相關(guān)的信號通路，造成細胞損傷，同時參與介導促纖維化基因表達[11-13]。研究表明，重樓提取物能抑制丙二醛生成以及脂質(zhì)過氧化，能穩(wěn)定、有效地清除自由基，并可減輕DNA的氧化損傷，具有良好的清除自由基效果及抗氧化能力[14]。劉功成等[15]發(fā)現(xiàn)重樓葉多糖能增強小鼠脾臟免疫功能并提高抗氧化活性。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，高糖組細胞的活性氧含量升高(P<0.05)，說明高糖作用下GMC內(nèi)活性氧表達增高，表明高糖造成了一定程度的氧化應激損傷；而與高糖組比較，重樓皂苷Ⅱ組細胞的活性氧含量降低(P<0.05)，說明重樓皂苷Ⅱ有效抑制了高糖誘導的氧化應激反應。此外，與正常對照組比較，高糖組、重樓皂苷Ⅱ組細胞的丙二醛含量升高、SOD活性降低(P<0.05)，經(jīng)過重樓皂苷Ⅱ干預后，重樓皂苷Ⅱ組細胞的丙二醛含量降低而SOD活性升高(P<0.05)，提示重樓皂苷Ⅱ可能通過提高SOD活性，增強其對自由基的清除能力，降低丙二醛含量，從而減輕對GMC的氧化損傷作用。

綜上所述，重樓皂苷Ⅱ可以抑制高糖誘導的GMC增殖，并可減輕細胞氧化應激損傷，這可能其與減少細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和提高SOD活性有關(guān)。但本研究只局限于體外研究，下一步將建立動物模型證實相關(guān)結(jié)論及進一步探討具體機制。