唐志華，熊海濤，解萌

1(陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中，723001) 2(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中，723001)

恩諾沙星(Enrofloxacin)又稱乙基環(huán)丙沙基，是第三代喹諾酮類抗生素。作為一種廣譜類抗菌活性藥物，其對(duì)支原體、革蘭氏陽性或陰性菌等有很好的殺滅效果，被廣泛應(yīng)用于畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域[1]。但是長期且過度使用會(huì)使其殘留在牲畜及水產(chǎn)品中，進(jìn)而在食用的人體內(nèi)產(chǎn)生耐藥性或致癌風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，對(duì)牲畜及水產(chǎn)品中恩諾沙星含量的準(zhǔn)確檢測(cè)就顯得非常重要。目前，恩諾沙星的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[3-5]、毛細(xì)血管電泳法[6-7]、熒光光度法[8-9]、化學(xué)發(fā)光分析法/化學(xué)發(fā)光免疫法[10-13]、酶聯(lián)免疫(ELISA)法[14-15]及電化學(xué)分析法[16-18]等。這些分析方法存在很多問題，比如，高效液相色譜法與毛細(xì)血管電泳法具有較高的準(zhǔn)確度，但儀器昂貴，分析靈敏度低；熒光光度法與化學(xué)發(fā)光法雖然具有較高的靈敏度，但是其需要特殊試劑且方法的選擇性較差；而酶聯(lián)免疫法,制備的抗體與多種殘留藥物進(jìn)行反應(yīng)，不宜作為單一檢測(cè)方法,僅適用于對(duì)大量樣品的快速篩選與檢測(cè);電化學(xué)分析法通常需對(duì)電極界面進(jìn)行修飾，導(dǎo)致檢測(cè)過程費(fèi)時(shí)，且分析的重現(xiàn)性也較差。

探針分光光度法(又稱荷移光度法)主要是基于染料分子與一些特定有機(jī)小分子在某種反應(yīng)介質(zhì)中相互作用后形成新型離子締合物，致使原有染料分子溶液的紫外-可見吸收光譜及吸光度均發(fā)生顯著改變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)小分子進(jìn)行靈敏檢測(cè)。其中曙紅是近些年探針光度法中應(yīng)用較為廣泛的染料分子之一。如江虹等[19]利用甲砜霉素和曙紅在酸性條件下反應(yīng)生成的締合物會(huì)使體系的吸光度變大，從而建立了一種簡便且快速檢測(cè)甲砜霉素的分光光度法，檢出限低至0.095 mg/L。而曾崗等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在酸性介質(zhì)中曙紅與鹽酸普羅帕酮能形成1∶1型離子締合物，據(jù)此對(duì)鹽酸普羅帕酮進(jìn)行了靈敏檢測(cè)。另外，李俊波等[21]利用曙紅與長春瑞濱在強(qiáng)酸性介質(zhì)下形成1∶2型離子締合物而發(fā)生褪色反應(yīng)，據(jù)此建立了一種探針光度法測(cè)定長春瑞濱的新方法，線性范圍在0.25～15 μg/mL之間。但到目前為止，利用曙紅探針光度法靈敏測(cè)定恩諾沙星的文獻(xiàn)尚無報(bào)道。

本文依據(jù)在酸性介質(zhì)中曙紅與少量恩諾沙星相互作用后能形成一種新型離子締合物(使反應(yīng)體系的吸收光譜發(fā)生變化)，據(jù)此建立一種準(zhǔn)確且靈敏地檢測(cè)恩諾沙星的光度分析法。該方法能為肉類食品中恩諾沙星含量地測(cè)定提供一種參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子天平，上海奧斯儀器有限公司；恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司；800型離心機(jī)，上海手術(shù)機(jī)械廠；pHS-3C精密酸度計(jì)，上海大普儀器有限公司。

恩諾沙星純品(純度99.7%)，北京索萊寶科技有限公司；NaOH(0.1 mol/L)、曙紅(0.40 mmol/L)及BaCl2，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CaCl2、MgCl2及CuSO4，成都市科隆化工試劑廠公司；二氯甲烷、甲醇、葡萄糖、蔗糖及淀粉，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；蘇氨酸、甘氨酸及組氨酸，北京萊耀生物科技有限公司；0.1 mol/L鹽酸溶液；0.01 mol/L硫酸溶液；1.0 mol/L醋酸溶液。

恩諾沙星儲(chǔ)備液(1.0 mmol/L)的配制：準(zhǔn)確稱取0.359 4 g恩諾沙星純品，先使用3.0 mL NaOH(0.1 mol/L)進(jìn)行溶解，再用HCl調(diào)節(jié)至中性，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,并定容于100 mL，搖勻待用；使用時(shí)用高純水稀釋至所需濃度。

所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為高純水。

雞肉與雞蛋，漢中漢臺(tái)區(qū)水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。

1.2 樣品的處理

取洗凈且在研缽中研碎的雞肉5.0 g，加入5.0 g無水Na2SO4繼續(xù)研磨均勻。然后，放入10 mL離心管中，加入二氯甲烷4 mL，高速勻漿3 min，再離心6 min，移取上清液。把剩下的殘?jiān)僦匦绿崛?遍，將2次的上清液合并，再用HAc-NaAc(pH 5.0)緩沖液稀釋至10 mL。

將雞蛋攪勻，放在253 K冰箱中保存，取適量放在10 mL離心管中，加入6 mL二氯甲烷提取劑，高速勻漿3 min,離心6 min，操作同上。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在25 mL比色管中，依次加入適量曙紅及恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(或樣品溶液)，再用一定濃度的鹽酸稀釋至刻度線，搖勻，室溫下放置4 min，以緩沖溶液作為參比溶液，在波長為520 nm處測(cè)定體系的吸光度，以吸光度A對(duì)恩諾沙星濃度作圖，進(jìn)而檢測(cè)樣品中恩諾沙星含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體系吸收光譜的研究

按照實(shí)驗(yàn)方法配制不同體系的溶液，以0.01 mol/L HCl為參比溶液,在波長200～750 nm范圍進(jìn)行光譜掃描(見圖1)。恩諾沙星在271 nm處有一強(qiáng)吸收峰，而在可見光區(qū)幾乎沒有吸收；另外，曙紅溶液的最大吸收波長在514 nm處，而同濃度的曙紅溶液與一定濃度的恩諾沙星反應(yīng)后，體系的最大吸收波長紅移至520 nm處，且吸收強(qiáng)度明顯降低。這說明曙紅與恩諾沙星相混合后，會(huì)有新復(fù)合物生成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)(圖2)，隨著恩諾沙星濃度依次增大，二者混合體系在520 nm處的吸光值逐漸下降。因此，可以在520 nm波長處對(duì)恩諾沙星進(jìn)行定量分析。

a-1.0×10-5 mol/L曙紅; b-1.0×10-5 mol/L曙紅+5.0 μg/mL恩諾沙星;c-5.0 μg/mL恩諾沙星

圖1 不同體系的吸收光譜圖

Fig.1 Absorption spectra of the different systems

圖2 不同質(zhì)量濃度的恩諾沙星存在時(shí)反應(yīng)體系的的吸收光譜

Fig.2 Absorption spectra of the selecting system in the presence of different enrofloxacin concentrations

2.2 反應(yīng)機(jī)理探討

已有文獻(xiàn)報(bào)道[21-22]，在pH 2.5的酸性介質(zhì)中，曙紅主要以陰離子(帶2個(gè)負(fù)電荷)形式存在。而恩諾沙星分子中有3個(gè)叔胺(R3N)單元，會(huì)在強(qiáng)酸性介質(zhì)中發(fā)生質(zhì)子化以形成銨鹽(R3NH+)，結(jié)果使恩諾沙星分子具有正電荷特性。因此，當(dāng)一定濃度的曙紅與恩諾沙星溶液相混合后，通過二者之間的靜電與疏水作用生成一種離子締合物。為了進(jìn)一步探討該離子締合物的組成，本實(shí)驗(yàn)采用了摩爾比法。結(jié)果表明，隨著曙紅溶液濃度的增加，吸光值逐漸越大，當(dāng)二者摩爾比增大到1以后，吸光度不再增加，說明離子締合物已經(jīng)反應(yīng)完全，即，曙紅與恩諾沙星形成的締合物組成比為1∶1(圖3)。

圖3 曙紅與恩諾沙星溶液摩爾比對(duì)吸光度的影響

Fig.3 Effect of the molar ratio of eosin to enrofloacxin on the absorbance

2.3 實(shí)驗(yàn)條件選擇

2.3.1 反應(yīng)介質(zhì)pH值的選擇

固定曙紅與恩諾沙星溶液濃度不變，考察了不同pH反應(yīng)介質(zhì)中體系的吸光度。從圖4可以看出，隨著pH值的增大，吸光度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)介質(zhì)的pH值控制在2.7附近時(shí)，體系的吸光度最大。這可能是由于在強(qiáng)酸性介質(zhì)中曙紅與恩諾沙星均容易發(fā)生質(zhì)子化，而在較高的pH值反應(yīng)介質(zhì)中，恩諾沙星的質(zhì)子化程度變?nèi)?，即反?yīng)介質(zhì)的pH值過低或過高時(shí)均會(huì)使曙紅與恩諾沙星締合的趨勢(shì)變?nèi)?。因此，?shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)介質(zhì)的最佳pH值為2.7。

圖4 pH值對(duì)吸光度的影響

Fig.4 Effect of pH value on the absorbance

2.3.2 曙紅濃度的選擇

固定最適pH值不變，恩諾沙星質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了曙紅濃度在0.5×10-5～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)體系的吸光度(如圖5所示)。結(jié)果表明，隨著曙紅濃度的增大，體系吸光度逐漸增大，但當(dāng)曙紅濃度超過2.5×10-5mol/L后，體系吸光度則會(huì)逐漸下降。這可能是由于作為體系的探針——曙紅，其較低的濃度不利于體系完全反應(yīng)，而過高的濃度則會(huì)引起體系自吸收程度增強(qiáng)。所以，曙紅的最適濃度為2.5×10-5mol/L。

圖5 曙紅溶液濃度對(duì)吸光度的影響

Fig.5 Effect of eosin concentration on the absorbance

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

保持曙紅濃度、pH值及恩諾沙星濃度不變，對(duì)體系反應(yīng)時(shí)間分別在2、4、8、10及15 min時(shí)的吸光度進(jìn)行測(cè)定。從圖6可以看出，剛開始隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，體系吸光度逐漸增大，超過4 min后，體系吸光度無明顯變化。這說明在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，曙紅與恩諾沙星能在4 min內(nèi)反應(yīng)完全。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為4 min。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響

Fig.6 Effect of reaction time on the absorbance

2.3.4 反應(yīng)溫度的選擇

在其他條件不變的情況下，實(shí)驗(yàn)考察了不同反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)體系吸光度的影響。圖7顯示，在20～80 ℃范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，體系的吸光度逐漸下降。這可能是由于隨著反應(yīng)溫度的增大，曙紅與恩諾沙星相結(jié)合而生成離子締合物的穩(wěn)定性減弱所致。故實(shí)驗(yàn)選擇在近室溫(20 ℃)條件下進(jìn)行研究。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)吸光的影響

Fig.7 Effect of reaction temperature on the absorbance

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，恩諾沙星濃度分別在0.08～2.0 μg/mL與2.0～10.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為A=0.150 9C+1.245 8，A=0.008 9C+1.520 8；相關(guān)系數(shù)分別為0.996 2和0.996 9。按IUPAC建議，估算得方法檢出限為0.05 μg/mL。對(duì)濃度為1.0 μg/mL恩諾沙星進(jìn)行8次平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于5%。

2.5 共存物的影響結(jié)果

2.6 樣品分析

各取1.2樣品處理液1.0 mL，按照1.3實(shí)驗(yàn)方法對(duì)雞肉與雞蛋中恩諾沙星含量進(jìn)行測(cè)定，并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。從表1與表2可見,雞肉與雞蛋中恩諾沙星的含量分別為1.06 μg/mL和0.36 μg/mL，而平均回收率則分別為93.61%和92.17%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于5.1%。這說明建立的方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 雞肉中恩諾沙星含量分析及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表2 雞蛋中恩諾沙星含量分析及回收率實(shí)驗(yàn)(n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用酸性介質(zhì)中恩諾沙星與曙紅能形成一種離子締合物而使曙紅的吸收波長發(fā)生紅移，且隨著恩諾沙星濃度增大吸光度逐漸減小，由此建立了一種測(cè)定恩諾沙星含量的新方法。該方法具有操作簡便、快速、試劑廉價(jià)、準(zhǔn)確且靈敏度較高等特點(diǎn)，有望作為一種恩諾沙星殘留的快速檢測(cè)方法而應(yīng)用于食品安全監(jiān)管領(lǐng)域。