李豪，白光劍，吳靜，楊海泉，鄒偉*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

纖維素是目前世界上含量最豐富的天然可再生資源，纖維素資源的高效開發(fā)利用是當(dāng)前研究熱點(diǎn)[1-2]。微生物處理纖維素是1種高效、綠色環(huán)保的方法，主要利用微生物產(chǎn)生纖維素酶將纖維素降解為葡萄糖，然后再通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化為其他有價(jià)值的化合物，比如乙醇和單細(xì)胞蛋白等[3]。纖維素酶由多種復(fù)合酶系組成，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4葡萄糖苷酶，3種酶協(xié)同作用于纖維素物質(zhì)并將其降解[4-5]。它廣泛存在于微生物、原生動(dòng)物和植物中，目前發(fā)現(xiàn)具有纖維素降解功能的微生物菌屬很多，如木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等[6-7]。國內(nèi)外對(duì)降解纖維素菌株研究多集中在真菌，因?yàn)檎婢a(chǎn)纖維素酶系較全，分解纖維素能力較強(qiáng)[8]。纖維素酶在飼料、紡織、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有良好的市場(chǎng)前景[9]。

目前由于纖維素酶產(chǎn)量低、成本高等問題，導(dǎo)致纖維素酶的工業(yè)應(yīng)用受到限制。高酶活菌株的選育仍然是重要的研究方向，國內(nèi)外許多學(xué)者做了相關(guān)研究，如曾思泉等[10]從紅樹林根際土壤中獲得1株產(chǎn)纖維素酶的枝孢屬菌(Cladosporiumsp.)，SWAIN等[11]從牛糞中篩選得到5株具有較高纖維素酶活力的枯草芽孢桿菌等。但自然篩選獲得的菌株產(chǎn)酶能力有限，通過誘變提高產(chǎn)酶能力是常見的方法，比如常用的紫外誘變能使相鄰的嘧啶形成二聚體，導(dǎo)致菌株遺傳物質(zhì)發(fā)生改變從而提高酶活[12-13]。常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變技術(shù)是近年來發(fā)展的1種新型誘變技術(shù)，在高純度的氦氣作為出發(fā)氣體的條件下，大量非平衡性等離子體流作用于微生物的遺傳物質(zhì)，破壞單核苷酸的磷酸二酯鍵，誘發(fā)細(xì)胞SOS修復(fù)機(jī)制，從而導(dǎo)致遺傳物質(zhì)突變[14]。周羅娜等[15]利用ARTP誘變黑曲霉提高產(chǎn)單寧酶的能力，其酶活提高2倍。SANGWIJIT等[16]利用ARTP誘變解淀粉芽孢桿菌提高其產(chǎn)纖維素酶能力。ARTP誘變方法具有突變率高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，操作簡單、安全的優(yōu)點(diǎn)，因此受到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用[17]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的高產(chǎn)纖維酶枝孢菌B03作為出發(fā)菌株[2]，通過紫外誘變和ARTP誘變，用剛果紅染色進(jìn)行初篩，酶活作為復(fù)篩，獲得產(chǎn)酶能力提高、遺傳穩(wěn)定的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枝孢菌(Cladosporium)B03，本實(shí)驗(yàn)室選育保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10，蛋白胨3，KH2PO44，MgSO4·7H2O 0.3。

CMC培養(yǎng)基(g/L)：CMC-Na 10，(NH4)2SO44，蛋白胨1，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，瓊脂20。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：CMC-Na 10，蛋白胨3，酵母膏0.2，(NH4)2SO42，KH2PO44，MgSO4·7H2O 0.3。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)、0.9%生理鹽水、3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液、剛果紅溶液(1 mg/mL)、CMC-Na、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、(NH4)2SO4、甘油、脫脂棉等(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.4 儀器與設(shè)備

ARTP-Ⅱ型誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司；MJ-250恒溫培養(yǎng)箱、TG-16醫(yī)用離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；Phs-3C酸度計(jì)、YX280A型高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)、HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造；V-1000可見分光光度計(jì)，翱藝儀器有限公司；SKY-2102C恒溫振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及發(fā)酵培養(yǎng)

菌株活化：將-4 ℃斜面保存的菌株取出，在CMC培養(yǎng)基上連續(xù)3～4次劃線培養(yǎng)(28 ℃)，然后將菌株斜面培養(yǎng)，制備孢子懸浮液?；罨蟮木暌匝篮?點(diǎn)法點(diǎn)種在CMC培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d后用1 mg/mL的剛果紅溶液染色30 min，蒸餾水漂洗后用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min，測(cè)定菌落直徑與透明圈直徑，計(jì)算透明圈與菌落的直徑比[18]。

發(fā)酵液培養(yǎng)：將活化后的菌株接種于種子培養(yǎng)液中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h，然后按5%的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3 d，將發(fā)酵液過濾，濾液6 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。測(cè)定菌株羥甲基纖維素(CMC)酶活和濾紙(FPA)酶活。

CMC酶活測(cè)定：4根25 mL比色管，1根作空白對(duì)照，4根管中都加入1.5 mL濃度為1%的CMC溶液，3根實(shí)驗(yàn)管中加入0.5 mL粗酶液，空白管不加粗酶液，在50 ℃下反應(yīng)30 min，取出后都加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液后迅速與實(shí)驗(yàn)管一起放入沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容到25 mL，540 nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算酶活。

FPA酶活測(cè)定：4根25 mL比色管，1根作空白對(duì)照，4根管中都加入折成M形的質(zhì)量為50 mg的濾紙(長6 cm，寬1 cm)，然后加入1.5 mL pH 4.8的磷酸緩沖液，3根實(shí)驗(yàn)管中再加入0.5 mL粗酶液，空白管不加酶液，50 ℃下反應(yīng)60 min，取出后都加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液后與實(shí)驗(yàn)管迅速放入沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容到25 mL，540 nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算酶活。

酶活定義：在一定條件下，1 mL粗酶液1 min水解底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需酶量定義為1個(gè)酶活單位U。

1.2.2 菌株紫外誘變選育

孢子懸浮液：將斜面培養(yǎng)好的菌株用滅菌的生理鹽水沖洗孢子，在28 ℃、180 r/min條件下活化3 h后用滅菌的脫脂棉過濾孢子溶液，然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子濃度在106～108CFU/mL范圍內(nèi)。

將配制好的孢子懸浮液裝入滅菌的空平板內(nèi)，置于超凈工作臺(tái)上，黑暗條件下使用20 W紫外燈在30 cm處分別照射0、1、2、4、6、8、10和13 min，分別取不同照射時(shí)間的孢子液稀釋適合倍數(shù)，取200 μL涂布于CMC平板，在28 ℃下暗培養(yǎng)，計(jì)數(shù)并計(jì)算致死率。

紫外誘變及篩選：選擇致死率在90%左右的時(shí)間進(jìn)行誘變育種。將誘變處理后的孢子液涂布于CMC培養(yǎng)基中，28 ℃暗培養(yǎng)后把單菌落分別挑出編號(hào)進(jìn)行劃線培養(yǎng)，純培養(yǎng)后將菌株以3點(diǎn)法點(diǎn)種于CMC培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d后用1 mg/mL的剛果紅溶液染色30 min，蒸餾水漂洗后用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min，測(cè)定菌落直徑與透明圈直徑，篩選出直徑比大的菌株進(jìn)行CMC酶活和FPA酶活測(cè)定復(fù)篩。篩選出酶活能力提高的菌株進(jìn)行ARTP誘變選育。

1.2.3 ARTP誘變選育

孢子懸浮液：將經(jīng)過紫外處理酶活提高的菌株在28 ℃條件下進(jìn)行斜面培養(yǎng)，用滅菌的生理鹽水將孢子洗下，洗滌前可用接種環(huán)適當(dāng)刮下孢子，然后再28 ℃、180 r/min條件下活化3 h后用滅菌的脫脂棉過濾孢子溶液，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子濃度在106～108范圍內(nèi)。將調(diào)節(jié)好濃度的孢子液在8 000 r/min的條件下離心5 min，棄上清液，加入1 mL 2%甘油溶液并振蕩均勻作為孢子懸浮液。

在高純的氦氣作為ARTP的工作氣源，電源功率100 W，氣體流量10 SLM，照射距離2 mm的條件下，對(duì)8個(gè)載片上10 μL孢子液進(jìn)行誘變處理，處理時(shí)間依次為0、20、60、80、100、120、150、180和210 s[19]。處理后稀釋相應(yīng)倍數(shù)涂布于CMC平板上，28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，計(jì)數(shù)并計(jì)算致死率。選取致死率在90%左右時(shí)作為誘變處理時(shí)間。篩選方法同紫外誘變，得到酶活提高的菌株。

1.2.4 突變菌株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

將篩選得到的突變菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)，檢測(cè)1、2、3、4、5和6代菌株發(fā)酵液中CMC酶活、FPA酶活，以確定突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株B03的活化、透明圈及酶活測(cè)定

將菌種B03從斜面保存連續(xù)劃線純培養(yǎng)3～4代，測(cè)定菌株的透明圈與菌落直徑比為2.53?；罨蟮木杲臃N到種子培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h，5%的接種量接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)定菌株CMC酶活為(427.62±2.78)U/mL，F(xiàn)PA酶活為(46.83±1.85) U/mL。以該菌株作為誘變的出發(fā)菌株。

2.2 紫外誘變選育

由圖1可知，隨著照射時(shí)間的增長，菌株的致死率也增大，一般選擇致死率為90%左右作為誘變處理量。當(dāng)照射時(shí)間為8 min時(shí)，菌株致死率為91.67%，因此選擇8 min作為紫外誘變照射時(shí)間。

圖1 菌株B03紫外誘變致死曲線

Fig.1 Lethal rate curve of strain B03 by UV mutagenesis

以菌株B03作為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外處理8 min后涂布于CMC培養(yǎng)基上，黑暗條件下28 ℃培養(yǎng)3 d，將單菌落分別挑出編號(hào)，共計(jì)菌株63株，編號(hào)為UV-01～UV-63，對(duì)篩選出的63株菌株測(cè)定其透明圈與菌落比值，將比值較大菌株進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果如表1所示。(由于透明圈在測(cè)定時(shí)與菌株生長狀態(tài)有關(guān)，菌落較小可能比值較大，但菌落較小可能說明菌株生長緩慢，因此透明圈與菌落比值大小應(yīng)選擇相對(duì)較大值的菌株進(jìn)行酶活測(cè)定)。將菌株透明圈較大的10株菌測(cè)定其酶活，發(fā)現(xiàn)菌株UV-10、UV-42的FPA酶活有所提高，其中UV-42相對(duì)B03的FPA酶活提高17.85%，菌株UV-03、UV-29的CMC酶活有所提高，UV-03較原菌株CMC酶活提高18.79%(表2)。因?yàn)镕PA酶活測(cè)定底物為濾紙，濾紙較難分解，所以酶活較低，而出發(fā)菌株具有較高的CMC酶活，因此以CMC酶活作為主要篩選指標(biāo)，將菌株UV-03作為ARTP誘變的出發(fā)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)。

表1 紫外誘變后的初篩結(jié)果

表2 紫外誘變后酶活力 單位：U/mL

2.3 ARTP誘變選育

對(duì)菌株UV-03進(jìn)行ARTP誘變操作，測(cè)定ARTP致死曲線，結(jié)果顯示ARTP處理時(shí)間越長，致死率越大(圖2)。菌株在20 s時(shí)致死率將近60%，可能因?yàn)殚_始菌株對(duì)ARTP較為敏感所致。在處理120 s時(shí)，致死率為90.85%，超過120 s后致死率接近100%，因此選擇120 s作為ARTP誘變的處理時(shí)間。

圖2 菌株UV-03 ARTP致死曲線

Fig.2 Lethal rate curve of strain UV-03 by ARTP

將菌株UV-03在ARTP儀上誘變處理120 s，稀釋涂布于CMC平板上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d后將單菌落挑出繼續(xù)劃線純化培養(yǎng)，最終共培養(yǎng)誘變后菌株81株(圖3)。測(cè)定經(jīng)ARTP誘變處理后的81株菌株的透明圈與菌落直徑比，測(cè)定比值較大的部分菌株的酶活，結(jié)果如表3所示。菌株AY-42、AY-70的FPA酶活分別為(92.27±0.23)、(93.58±3.02) U/mL，較原B03的FPA酶活提高97%左右，并且AY-42的CMC酶活達(dá)(582.14±2.32) U/mL，較B03提高36.14%。

圖3 菌株AY-42剛果紅染色

Fig.3 Transparent hydrolysis circle by Congo red staining of strain AY-42

2.4 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

對(duì)突變菌株AY-42進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)過6代連續(xù)劃線培養(yǎng)并測(cè)定每1代的酶活力，突變菌株AY-42具有較好的穩(wěn)定性。能夠穩(wěn)定高效地產(chǎn)纖維素酶。

表3 菌株UV-03 ARTP誘變結(jié)果

圖4 突變菌株AY-42產(chǎn)纖維素酶的遺傳穩(wěn)定性

Fig.4 Cellulase production genetic stability of the strain AY-42

3 結(jié)論與討論

目前生物質(zhì)資源在向能源轉(zhuǎn)化的過程中仍存在不少技術(shù)難題和成本制約，纖維素酶價(jià)格過高是其中之一，篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株并提高其產(chǎn)酶能力具有重要研究意義[20]。前期此類研究主要通過自然篩選、誘變育種、基因工程等方法對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行改造，以達(dá)到提高菌株產(chǎn)酶能力的目的[21]。如IKE等[22]對(duì)里氏木霉進(jìn)行紫外誘變，篩選后獲得2株產(chǎn)纖維素酶能力分別提高1.1和1.2倍的突變菌株。郭建強(qiáng)等[23]使用紫外-亞硝基胍復(fù)合誘變芽孢桿菌使纖維素酶活力提高3.23倍。DINA等[24]使用紫外和化學(xué)試劑復(fù)合誘變使米曲霉濾紙酶活提高4倍多。誘變育種能使菌株產(chǎn)酶能力提高，目前使用ARTP技術(shù)提高真菌產(chǎn)纖維素酶能力報(bào)道較少。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的高產(chǎn)纖維素酶菌株枝孢菌(Cladosporium)B03為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外和ARTP復(fù)合誘變，采用透明圈法初篩、酶活復(fù)篩的方法篩選出產(chǎn)酶能力提高的菌株AY-42，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，該菌株具有高產(chǎn)纖維素酶的穩(wěn)定性。突變菌株AY-42最終CMC酶活為(582.14±2.32)U/mL，F(xiàn)PA酶活為(92.27±0.23) U/mL，與原始菌株B03相比CMC酶活提高36.14%，F(xiàn)PA酶活提高97.03%，其CMC酶活顯著高于陳麗燕等[25]報(bào)道的菌株。在菌株初篩時(shí)主要依據(jù)透明圈與菌落直徑比值大小，比值大小與菌株生長狀態(tài)有很大關(guān)聯(lián)，在點(diǎn)種后培養(yǎng)過程中菌株生長不規(guī)則會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)，總體上直徑比能夠在菌株數(shù)量較多時(shí)快速地篩選出產(chǎn)酶能力可能提高的菌株，減少了工作量，提高了篩選效率。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用的ARTP也表現(xiàn)出良好的誘變效果，等離子體能夠破壞核苷酸的磷酸二酯鍵，使細(xì)胞啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制[14]，對(duì)微生物的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的畸變作用，進(jìn)而誘發(fā)菌株產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的突變?？傊闍Y-42具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可用于后期生物質(zhì)資源開發(fā)。