黃超文 趙強(qiáng) 鐘蓮娣 先俊 鐘雪鶯 仝金齋 黃炎明

江門(mén)市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科一區(qū)（廣東江門(mén) 529000）

肺纖維化是間質(zhì)性肺病中最常見(jiàn)的一種類型，具有高病死率和日益增長(zhǎng)的發(fā)病率，但目前仍缺乏有效的治療手段。肺纖維化的病理特征為肺泡上皮損傷、異常的血管修復(fù)和重塑、炎癥浸潤(rùn)、肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖活化及肺間質(zhì)膠原沉積，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）目前被認(rèn)為是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)VEGF不僅參與全身的血管生成，還與多種肺部疾病相關(guān)，其與肺纖維化的聯(lián)系也日漸受到關(guān)注。研究顯示轉(zhuǎn)入抗VEGF的sflt-1基因可抑制博來(lái)霉素（Bleomycin，Blm）誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[1]，提示VEGF在纖維化進(jìn)程中具有重要作用。同時(shí)活性維生素D 1，25（OH）2D3（VD）在慢性氣道疾病中的作用亦被逐漸證實(shí)，VD具有可抑制VEGF對(duì)氣道屏障的破壞[2]、氣道平滑肌細(xì)胞增殖[3]、促腫瘤細(xì)胞遷移[4]和改善肺纖維化[5]等作用。由于目前多種VEGF的抑制劑已上市，而貝伐珠單抗（Bevacizumab，Bev）始終是現(xiàn)有的確切有效且安全的VEGF抑制性藥物[6-8]。結(jié)合本課題組已發(fā)現(xiàn)VD可減輕肺纖維化[5]，Bev可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥[9]，因此，本研究在前期肺纖維化研究基礎(chǔ)上，采用VD作為對(duì)照，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型中首次探討B(tài)ev對(duì)肺纖維化的影響，評(píng)價(jià)其是否可特異性抑制VEGF，為肺纖維化的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料SPF級(jí)C57B/L小鼠共40只（購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），6～8周齡，體重20～24 g，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。VEGF-A、TNF-α、IL-4 Elisa試劑盒購(gòu)自 eBioscience；HE染色試劑盒、羥脯氨酸含量測(cè)定試劑盒、DAB顯色試劑盒，α-SMA抗體（abcam）。

1.2 分組處理將小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（Con組）、博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化組（Blm組）、博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化后1，25（OH）2D3治療組（Blm+VD組）、博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化后貝伐珠單抗治療組（Blm+Bev組）。具體方法：腹腔注射1%戊巴比妥麻醉小鼠，Blm組氣管內(nèi)單次注射3U/Kg Blm以制備肺纖維化小鼠模型；Con組經(jīng)氣管內(nèi)單次注射等體積生理鹽水；Blm+VD及Blm+Bev組：造模過(guò)程同Blm組，造模成功后每日經(jīng)腹腔注射5 μg/kg VD或經(jīng)鼻滴入5 mg/kg貝伐珠單抗；VD或貝伐珠單抗治療第21天，摘取眼球放血處死小鼠并收集、保存肺組織及肺泡灌洗液。

1.3 肺纖維化程度評(píng)定肺組織H&E染色、肺纖維化評(píng)分（Ashcroft評(píng)分）、羥脯氨酸含量測(cè)定、α-SMA免疫組化。

1.4 細(xì)胞因子檢測(cè)收集肺支氣管肺泡灌洗液（BALF），經(jīng)離心后取上清，Elisa法檢測(cè)VEGF-A、IL-4、TNF-α。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊時(shí)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較應(yīng)用Bonferroni法；不滿足方差齊性時(shí)使用Welch法比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF中VEGF-A的表達(dá)Blm組小鼠的BALF中VEGF-A含量明顯升高，與Con組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Blm+VD組和Blm+Bev處理的纖維化小鼠的VEGF-A表達(dá)均有所減少，其中以Blm+Bev組下降更為明顯，與Blm組對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 各組小鼠肺組織病理結(jié)果如圖2-A所示，Con組小鼠的肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺組織未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或膠原纖維沉積。博來(lái)霉素可成功制備肺纖

圖1 各組小鼠BALF VEGF-A表達(dá)情況Fig.1 The expression of VEGF-A in BALF of mice

維化小鼠動(dòng)物模型，表現(xiàn)為Blm組小鼠肺組織難以看見(jiàn)正常肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間質(zhì)中膠原纖維大量沉積，成纖維細(xì)胞增生聚集、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞），Ashcroft纖維化評(píng)分平均約為5分（圖2-B）。Blm+Bev組和Blm+VD組仍可見(jiàn)部分正常排列而完整的肺泡，其肺間質(zhì)中炎癥細(xì)胞明顯減少，膠原纖維增生較輕，對(duì)比Blm組，兩組纖維化評(píng)分降低（P＜0.05）。與Con組相比，Blm組小鼠羥脯氨酸含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Blm+Bev組和Blm+VD組的羥脯氨酸含量均較Blm組有下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Blm+VD組與Blm+Bev組之間比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2-C）。Blm+Bev組及Blm+VD組肺組織中膠原增生較Blm組有減輕，這與HE染色、Ashcroft評(píng)分結(jié)果是一致的。

2.3 肺組織α-SMA表達(dá)免疫組化顯示Blm組小鼠肺組織α-SMA含量明顯增加，呈廣泛分布的棕黃色，Blm+VD組與Blm+Bev組小鼠的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少（圖3）。

2.4 BALF中炎癥因子表達(dá)Blm組小鼠可造成BALF中TNF-α、IL-4含量均顯著增高，對(duì)比Con組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Blm+Bev組及Blm+VD組的BALF中TNF-α、IL-4含量較Blm組明顯下降（均P＜0.05）；Blm+VD組與Blm+Bev組兩組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討論

肺纖維化目前治療手段仍十分有限，目前研究主要針對(duì)減輕炎癥反應(yīng)和抑制肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖活化及肺間質(zhì)膠原沉積，本研究首次證明抑制VEGF可減輕博來(lái)霉素所致的肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺成纖維細(xì)胞活化及膠原纖維的增生，從而抑制肺纖維化的形成和發(fā)展。

圖2 各組小鼠肺纖維化情況Fig.2 The effect of pulmonary fibrosis in mice

圖3 各組小鼠α-SMA免疫組化結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical staining of α-SMA in mice

氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素是肺纖維化小鼠模型的最經(jīng)典的造模方式[10]。本研究經(jīng)氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素的小鼠的肺組織可見(jiàn)正常肺結(jié)構(gòu)大面積被破壞、肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)嚴(yán)重炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞外基質(zhì)如膠原纖維的增生，這表明已成功構(gòu)建小鼠肺纖維化模型。本研究發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的BALF中VEGF-A含量升高，這與國(guó)外研究結(jié)果[7-8]是一致的。VEGF-A是VEGF家族中最受關(guān)注的一種亞型，VEGFR-2是其主要受體。Bev可通過(guò)與VEGFR-2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合VEGF-A，從而抑制VEGF-A的作用[9]。既往認(rèn)為，VEGF-A主要作用為促血管新生和調(diào)節(jié)血管通透性，然而近2年研究發(fā)現(xiàn)VEGF-A參與更多的肺部疾病中，如哮喘[2，9]、氣道重塑[3]、急性肺損傷[10]、肺癌[11]等，其在肺纖維化中的作用更是備受爭(zhēng)論的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)Bev可明顯減少小鼠BALF中VEGF-A的表達(dá)，其含量甚至低于正常小鼠，這提示其對(duì)VEGF的有效抑制作用。更重要的是，貝伐珠單抗處理后小鼠的肺組織肺泡紊亂破壞、膠原病理性沉積得到有效改善，免疫組化結(jié)果顯示肺部纖維化標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)明顯下降、成纖維細(xì)胞增殖活化也受到抑制。其作用效果與VD相近，證明貝伐珠單抗具備抗肺纖維化的潛能。值得注意的是，具有抗纖維化作用的VD處理后，小鼠BALF中的VEGF-A含量下調(diào)。VD可在多種細(xì)胞模型中調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，例如可抑制氣道平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞釋放VEGF，從而參與哮喘的發(fā)生。這進(jìn)一步提示VEGF-A參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，而VD可能部分通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF發(fā)揮對(duì)肺纖維化的保護(hù)性作用。

圖4 小鼠BALF TNF-α、IL-4表達(dá)情況Fig.4 The expression of TNF-α，IL-4 in BALF of mice

肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞過(guò)度活化、增殖、遷移一直是肺纖維化機(jī)制的研究重點(diǎn)。國(guó)外研究證明VEGF可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的功能：重組VEGF-A可直接刺激肺成纖維細(xì)胞分泌過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)[12]，VEGF的抑制劑可抑制人肺成纖維細(xì)胞遷移能力[3]。本研究在體內(nèi)水平發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素組小鼠纖維化的肺組織中表達(dá)α-SMA陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多、聚集成團(tuán)，其中以纖維細(xì)胞表達(dá)為主，且單個(gè)細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)量明顯升高，成纖維細(xì)胞過(guò)度活化。而使用貝伐珠單抗抑制VEGF后，小鼠肺間質(zhì)中成纖維細(xì)胞數(shù)目減少、α-SMA的表達(dá)也受到抑制，這些結(jié)果提示Bev對(duì)肺纖維化的具有確定的保護(hù)作用。學(xué)者發(fā)現(xiàn)VEGF也參與多種肺部炎癥相關(guān)性疾病如哮喘、ARDS等的發(fā)生。VEGF可促進(jìn)哮喘模型中Th2炎癥因子的釋放[13]，激活經(jīng)典炎癥信號(hào)通路-NF-κB信號(hào)通路，參與哮喘形成；Bev可抑制屋塵螨誘導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)。本研究中Bev干預(yù)后小鼠肺部炎癥浸潤(rùn)較造模組明顯減輕，而B(niǎo)ALF中炎癥因子IL-4、TNF-α的表達(dá)也相應(yīng)下降。這提示Bev可抑制肺部炎癥反應(yīng)從而改善肺纖維化。但必須指出的是，博來(lái)霉素肺纖維化模型早期以炎癥反應(yīng)占主導(dǎo)，后期以纖維化進(jìn)程為主。因此，若要深入研究VEGF與肺炎癥反應(yīng)在肺纖維化中的作用，須進(jìn)一步觀察造模后第7、14天的小鼠炎癥因子變化。此外，由于本研究中僅探討其在炎癥因子及纖維化的病理改變情況，研究不足之處在于尚未探討成纖維細(xì)胞增殖活化與抑制VEGF的關(guān)系，因成纖維細(xì)胞增殖活化仍是目前治療纖維化的主要手段之一[14]。下一步擬進(jìn)行成纖維細(xì)胞增殖活化與VEGF/VFGFR信號(hào)通路關(guān)系的研究。

綜上所述，本研究首次提出Bev可改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，其作用機(jī)理與抑制VEGF對(duì)肺部炎癥、肺成纖維細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)增生的作用相關(guān)。抑制VEGF可能成為治療肺纖維化的新思路。