柯少波 石薇 陳佳梅 邱虎 陳永順

武漢大學人民醫(yī)院腫瘤中心（武漢430060）

我國乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位，而且呈現(xiàn)為年輕化的趨勢，深入研究乳腺癌發(fā)病機制及治療手段具有重要科學價值和社會意義[1-2]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)[3]，下調人乳腺癌細胞（MCF-7）的高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）基因，能抑制MCF-7的增殖和侵襲轉移，然而，這一作用能被過表達的SMARCC1基因所逆轉，因此，HMGB1可能通過靶基因SMARCC1調控了乳腺癌細胞的生存和轉移。

MCF-7細胞是從女性乳腺癌患者胸腔積液中分離而建立的細胞系，保留了多個乳腺上皮特性，是很好的乳腺癌細胞模型。但是，SMARCC1對乳腺癌生物學功能的作用和機制仍不明確。SMARCC1（BFA155）蛋白是 SWI/SNF復合體的亞基，最早在酵母菌中被發(fā)現(xiàn)，可改變螺旋酶和ATP酶相關基因周圍的染色質結構，調控其轉錄。SMARCC1基因編碼的蛋白質是重要的ATP依賴性染色質重塑因子，富含調控轉錄因子的亮氨酸序列，通過調控染色質的結構調控基因表達[4]。SMARCC1在前列腺癌中高表達，與病理分級、腫瘤分級和復發(fā)時間呈正相關[5]。此外，有研究表明[6-7]，SMARCC1參與了端粒酶活性的調控，端粒酶是合成端粒（真核生物染色體的天然末端多重復區(qū)域）的逆轉錄酶。端粒酶的激活是惡性腫瘤細胞無限增殖及侵襲轉移的重要機制之一，端粒酶活性與乳腺癌病理類型、腫瘤分化程度、患者病程等存在相關性[8]。

本研究擬進一步探討SMARCC1基因對乳腺癌增殖和端粒酶活性的影響和可能的機制，揭示人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）參與SMARCC1調控端粒酶活性的的分子機制是本研究的創(chuàng)新點。本研究可能為研究乳腺癌發(fā)病機制及相關基因治療手段提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與細胞培養(yǎng)MCF-7細胞系購自武漢大學細胞典藏中心，DMEM培養(yǎng)基、雙抗和胰蛋白酶、胎牛血清等（武漢愛生源生物有限公司），Trizol試劑和Lipofectamine2000試劑（美國Invitrogen公司），SMARCC1-siRNA及其對照物（廣州銳博生物），25 cm2細胞培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板、96孔板、MTT試劑（武漢谷歌生物公司），凋亡試劑盒（碧云天公司）。

1.2 實驗分組與轉染MCF-7細胞采用DMEM培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）置于37℃5%CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究將細胞系分為兩組，SMARCC1下調組（轉染SMARCC1-siRNA）和對照組（轉染siRNA陰性對照物），將細胞置于6孔板中培養(yǎng)，當細胞融合達到70%左右時進行轉染，轉染操作按照Lipofectamine 2000說明書進行，轉染最終濃度為50 nmol/L，每孔液體體積為2 mL。

1.3 MTT檢測細胞增殖轉染24 h后，將細胞接種于96孔板中，每孔4 000個細胞且體積為設置100 μL，每組設置5個復孔，同時設置空白對照孔，培養(yǎng)24、48、72及96 h后采用MTT法檢測各組細胞增殖情況。MTT檢測步驟概括為：去除培養(yǎng)板中培養(yǎng)基后，在96孔板每孔中加入5 mg/L的MTT溶液，置于37℃下4 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO孵育10 min，振蕩器上微震蕩15 min，用空白對照孔進行調零操作，采用酶標儀檢測各組的吸光度值（OD值），繪制調零后各組吸光度值曲線。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡流式細胞儀檢測細胞凋亡：轉染48 h后，收集細胞約1×106個/mL，PBS洗滌1次、離心、棄上清，然后將細胞懸浮液重懸于1 mL孵育緩沖液中。取100 μL細胞（約1×105個）加5 μL的PI試劑和5 μL的AnnexinV-FITC試劑，置于室溫下避光孵育15 min。最后加400 μL的孵育緩沖液，一般在1 h內上流式細胞儀機檢測。FCM激發(fā)波長為488 nm，采用波長515 nm的通帶濾器檢測FITC的熒光，另一波長＞560 nm的濾器檢測PI。

1.5 ELISA法檢測端粒酶活性采用ELISA法檢測各組細胞端粒酶活性，分為實驗組和對照組。首先以標準品濃度（單位為TPG）為橫坐標，以450 nm處吸光值為縱坐標，繪制標準品端粒酶活性曲線，將標準品稀釋成5個濃度點，每個點設置10個復孔，每孔加入50 μL標準品，設置空白孔（加入50 μL蒸餾水，不加標準品及酶標試劑），設置待測細胞樣品孔，在酶標包被的板上的待測樣品孔中先加入樣品稀釋液40 μL，再加入10 μL的待測樣品。將試劑盒匯總的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后待用；用封板膜封板后置于37℃溫箱中孵育30 min，然后小心去掉封板膜，吸去液體每孔加滿洗滌液，用洗滌液洗滌5次，然后每孔中加入50 μL的酶標試劑，空白孔中不加酶標試劑，溫育30 min后，用洗滌液再次洗滌5次，加入顯色液體，先加入50 μL顯色液A，在加入50 μL顯色液B，震蕩混勻，37℃下避光孵育15 min，然后每孔中加入50 μL的終止液終止反應，15 min后上酶標儀及其測定，用空白孔調零，于450 nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。將樣品吸光度值帶入標準曲線方程，計算樣品端粒酶活性。

1.6 RT-PCR檢測mRNA表達Trizol法提取細胞的總RNA，檢測RNA濃度和純度是否達標，按照TagMan RNA逆轉錄試劑盒（美國ABI公司）說明書進行逆轉錄，獲得cDNA。采用SYBR Green PCR master mix試劑盒（日本TAKARA公司）進行qRT-PCR。采用2-△△Ct方法進行定量分析，以β-actin作為內參，計算Caspase-3、hTERT相對表達量。

1.7 WesternBlot檢測蛋白表達提取細胞總蛋白 配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，加樣，電泳，濃縮膠80 V電泳35 min，分離膠100 V電泳90 min，分離蛋白，注意marker蛋白設置。采用濕轉法進行轉膜，350 mA，轉膜120 min，將蛋白轉至PVDF膜上。然后進行免疫雜交操作。取出PVDF膜，用BSA封閉1 h，兔抗人一抗孵育過夜（4℃條件下）。Caspase-3抗體購自三鷹公司（19677-1-AP），稀釋比為1∶500，hTERT一抗購自Abcam公司（ab32020），抗體稀釋比為1∶1 000，actin一抗購自三鷹公司（23660-1-AP）抗體稀釋比為1∶3 000；TBST系膜3次，每次5 min，二抗（山羊抗兔）孵育1 h，二抗為HRP標記山羊抗兔IgG，購自三鷹公司（SA00001-15），抗體稀釋比為1∶5 000，TBST洗膜，每次5 min，化學發(fā)光法顯影，在暗室中進行曝光操作，掃描膠片上蛋白條帶并用軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用獨立t檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 下調SMARCC1對MCF-7細胞增殖及凋亡作用MTT實驗結果表明，轉染后24、48、72和96 h，SMARCC1下調組的MCF-7細胞增殖均低于對照組（P＜0.05），且隨著時間增加，SMARCC1下調組的MCF-7細胞增殖被抑制程度越大，具有時間依賴性，見圖1。Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡結果表明，SMARCC1下調組晚期凋亡率（6.8%±0.5%）高于對照組晚期凋亡率（0.9%±0.1%）（P＜0.01）。見圖2。

2.2 下調SMARCC1對MCF-7細胞端粒酶活性影響轉染24及48 h后檢測兩組細胞端粒酶活性，結果顯示，轉染24及48 h后SMARCC1下調組MCF-7細胞端粒酶活性均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

圖1 MTT實驗結果Fig.1 Detection of proliferation by MTT assay

圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡Fig.2 Detection of apoptosis by Annexin V-FITC/PI

表1 各組端粒酶活性（TPG）Tab.1 Telomerase activation in each group ±s

表1 各組端粒酶活性（TPG）Tab.1 Telomerase activation in each group ±s

組別SMARCC1下調組對照組t值P值24 h 103.1±4.2 145.0±4.5 6.71 0.003 48 h 72.70±2.4 104.8±3.2 8.04 0.001

2.3 下調SMARCC1對MCF-7細胞Caspase-3、hTERT的mRNA及蛋白的影響RT-PCR實驗結果表明，SMARCC1下調組（0.804±0.014）的MCF-7細胞Caspase-3 mRNA表達水平高于于對照組[（0.478 ± 0.005），t=5.781，P＜0.01]；SMARCC1下調組（0.395±0.010）的MCF-7細胞hTERT mRNA表達水平低于對照組[（0.739±0.008），t=6.203，P＜0.01]。Western Blot實驗結果表明，SMARCC1下調組的MCF-7細胞Caspase-3蛋白表達水平高于于對照組，P＜0.01；SMARCC1下調組MCF-7細胞的hTERT蛋白表達水平低于對照組，P＜0.01，見圖3。

3 討論

圖3 Western Blot實驗結果Fig.3 Protein results detected by Western Blot

核小體染色質重塑是表觀遺傳學的重要機制之一，主要通過改變染色質空間結構的疏松程度，影響基因的轉錄表達，從而調控細胞表型[9]。SWI/SNF復合體及其介導的核小體染色質重塑是腫瘤研究的焦點。卵巢癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、腎癌、髓母細胞瘤及乳腺癌等腫瘤中，SWI/SNF亞基基因高頻突變[10]。SWI/SNF在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用，而且可能是一種普遍機制。SWI/SNF復合體有多個核心亞基，研究表明[11-12]，核心亞基SNF5在人和小鼠中表現(xiàn)為一種抑癌基因，SNF5在肝癌組織中表達低于癌旁組織，其表達量與肝癌細胞分化程度有關，SNF5在肝細胞肝癌中呈現(xiàn)為低表達，并且其低表達與肝細胞肝癌的低分化程度顯著相關。SMARCC1（BFA155）蛋白同樣是SWI/SNF復合體的核心蛋白組成部分之一，本課題組的前期研究[3]表明，SMARCC1的過表達能阻斷下調HMGB1基因對乳腺癌細胞增殖的抑制作用，HEEBOLL等[13]研究表明 SMARCC1在前列腺癌中均呈現(xiàn)高表達，且細胞實驗表明內源性的高表達SMARCC1促進了腫瘤細胞的增殖和侵襲，因此，SMARCC1可能是一種癌基因，然而，SMARCC1對乳腺癌細胞的生物學作用需要深入探討。

本研究表明，沉默MCF-7細胞的SMARCC1基因，能抑制乳腺癌的增殖及促進其凋亡。這與最近有關SMARCC1在其他腫瘤中的作用相一致，KE等[14]發(fā)現(xiàn)過表達SMARCC1能促進結腸癌細胞的增殖，而miR-202-5p能通過靶向下調SMARCC1來抑制結腸癌細胞的增殖活性。同樣的，IWAGAMI等[15]研究表明，SMARCC1的高表達與胰腺癌的預后較差和復發(fā)密切相關，miR-320c/SMARCC1是胰腺癌發(fā)生發(fā)展及耐藥的關鍵信號通路。Caspase-3是一種蛋白酶，在惡性腫瘤細胞凋亡中起著不可替代的作用[16]。本研究顯示，沉默乳腺癌細胞的SMARCC1基因能促進其凋亡，并且凋亡相關基因Caspase-3的表達顯著上調。Caspase家族成員的失活是腫瘤發(fā)生的重要機制之一，而認為活化Caspase-3能促進腫瘤細胞凋亡，而它參與腫瘤細胞凋亡主要是通過誘導CTL細胞殺傷[17]。因此，SMARCC1作為重要的染色體重塑相關蛋白之一，在乳腺癌的生物學功能中發(fā)揮重要作用。

染色質重塑過程可能受到端粒酶調控，有研究發(fā)現(xiàn)[18]，在正常人的細胞中，端粒酶hTERT的過表達可通過影響DNA甲基轉移酶的活性，參與細胞表觀遺傳學修飾或染色質結構的調控過程，從而影響染色質重塑。本研究中，染色質重塑相關基因SMARCC1的下調能抑制細胞端粒酶活性，且端粒酶亞單位基因表達水平顯著被抑制。本研究有以下創(chuàng)新之處，一是豐富了對乳腺癌細胞中染色質重塑與端粒酶相互調控作用認識，二是從抑制端粒酶活性的角度解釋SMARCC1調控乳腺癌細胞增殖活性的現(xiàn)象。正常人體細胞的端粒酶活性受到嚴格的調控，hTERT處于被抑制狀態(tài)，然而，在絕大多數(shù)惡性腫瘤中，hTERT呈現(xiàn)高表達，通過其啟動子在轉錄水平激活端粒酶活性，細胞內遺傳物質無限制的復制，導致無限增殖的惡性腫瘤細胞的出現(xiàn)。研究表明，沉默hTERT基因能顯著抑制乳腺癌增殖和遷移，促進其凋亡發(fā)生[19]。IFN-α處理乳腺癌細胞后，能抑制hTERT啟動子的活性，通過負性調節(jié)元件區(qū)域結合NF-κB，NF-κB通過磷酸化激活核因子而抑制hTERT的活性，同時增強Fas系統(tǒng)介導的細胞凋亡。

總之，沉默SMARCC1基因能抑制乳腺癌腫瘤細胞的生物學活性，其機制可能與促進Caspase-3相關凋亡途徑及抑制端粒酶活性相關。然而，本研究尚無法證實SMARCC1是否直接作用于端粒酶亞單位hTERT，SMARCC1也可能間接調控了端粒酶活性，這需要更深入實驗來探討。此外，本研究尚缺乏乳腺癌模式動物的相關實驗研究。