黎丹東，張旭輝，郭廣惠，李琳琳，馬珍珍，王 浩

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）又稱為退行性膝關節(jié)炎或者變形性膝關節(jié)炎，是一種慢性退行性關節(jié)疾病，主要特征為膝關節(jié)軟骨退行性改變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生［1］，在骨科臨床中較為常見和多發(fā)。KOA以關節(jié)疼痛和關節(jié)功能障礙為突出臨床表現(xiàn)［2］，使患者生活質(zhì)量受到嚴重影響。據(jù)統(tǒng)計，我國約有1.2億人經(jīng)受骨關節(jié)炎的痛苦，有近1/3的老年人患有此病，且女性患病率高于男性［3］。KOA致病機制仍未完全明確，目前主要認為由機械性和生物性因素相互作用所致［4］，其中細胞因子在KOA的病程中發(fā)揮重要作用。該文研究髕骨內(nèi)推手法（patellar inward pushing method，PIPM） 對兔 KOA模型關節(jié)液中細胞因子的變化，來探討PIPM對KOA的作用機制，為臨床運用PIPM治療KOA提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料30只普通級健康新西蘭大白兔，6月齡，雌雄不限，體重3.0～3.5 kg，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，許可證號為：SCXK（滬）2013-0006。所有大白兔在實驗前進行適應性飼養(yǎng)1 W。

Thermo Multiskan MK3全自動酶標儀 （美國Thermo公司）；EG1150型石蠟包埋機及 Leica-RM2135切片機（德國徠卡公司）；OLYMPUS CH20光學顯微鏡（日本 OLYMPUS 公司）；HH·W21·600S電熱恒溫水箱（上海躍進醫(yī)療器械公司）；旋渦混合器：MAXIMIXplusTM（Thermolyne 公司）；TD5A-WS低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；721分光光度計 （山東高密彩虹分析儀器有限公司）；萬分之一電子分析天平（LZBRORL-160 DTP日本）；各種規(guī)格的微量移液器（Eppendorf公司）。

IL-1b Platinum Elisa kit測試盒（美國Thermo公司）；一氧化氮合酶（NOS）測試盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A014-1）；一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A012：硝酸還原酶法）；中性福爾馬林固定液、二甲苯、石蠟、中性樹膠、蘇木精染液、1%伊紅乙醇溶液、甘油蛋白黏片劑等［均由國藥集團（滬試）提供］；鹽酸氨基葡萄糖膠囊 （奧泰靈）（香港澳美制藥廠，規(guī)格0.75 g，20粒/盒，批準文號：HC20140007）。

1.2 方 法

1.2.1 動物分組 適應性飼養(yǎng)1 W后，將30只新西蘭大白兔運用隨機數(shù)字表法分成空白組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組（GH組）、髕骨內(nèi)推組（PIPM組）和髕骨內(nèi)推聯(lián)合鹽酸氨基葡萄糖組（PIPM+GH組），共5組，每組各為6只?？瞻捉M實驗兔不做任何處理；其余4組進行膝骨關節(jié)炎造模，造模1 W后分別進行實驗；模型組不做任何相關治療；GH組實驗兔采用鹽酸氨基葡萄糖膠囊灌胃治療，給藥劑量250 mg/kg，約為每日臨床最大用量（25 mg/kg）的10 倍［5］，給藥體積 5 ml/kg，1 次/d，連續(xù)喂藥 8 W；PIPM組實驗兔進行髕骨內(nèi)推手法治療，專人操作，連續(xù)手法治療8 W；PIPM+GH組實驗兔進行髕骨內(nèi)推手法和鹽酸氨基葡萄糖灌胃聯(lián)合治療8 W。

1.2.2 動物造模 依據(jù)改良Hulth法［6］造模，在無菌條件下用4%戊巴比妥鈉（0.8 ml/kg）進行麻醉。兔右膝部去毛備皮、常規(guī)消毒鋪巾，于膝關節(jié)內(nèi)側(cè)做一縱切口，長約2.5 cm，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，顯露關節(jié)腔，檢查無原發(fā)病變后，剪斷前交叉韌帶及切除內(nèi)側(cè)半月板，注意避免損傷關節(jié)軟骨，最后徹底止血并縫合切口。自手術當日起肌肉注射青霉素（5萬U/kg·d）和鏈霉素（10 萬 U/kg·d）預防感染，連用 3 d 后停藥，術后清潔換藥，觀察傷口愈合情況。

1.2.3 髕骨內(nèi)推手法 操作者使實驗兔側(cè)臥并固定，安撫其情緒穩(wěn)定后進行操作，伸直患膝關節(jié)，拇指與示指捫及髕骨，觸及其內(nèi)外側(cè)緣中間，均衡平穩(wěn)施力，平行向內(nèi)推動兔髕骨至極限位置，維持5 s繼而松開3 s，使髕骨自然回位，依此法循環(huán)操作10 min，1次/d，連續(xù)治療 8 W。

1.2.4 觀察指標 于造模后9 W末時，進行各項指標檢測與觀察。（1）關節(jié)活動度的計算。量角器測量實驗兔患、健側(cè)膝關節(jié)伸展及彎曲的角度，測量取值為整度數(shù)，計算患膝關節(jié)的活動度。（2）關節(jié)液中IL-1β、iNOS和NO含量檢測。采用空氣栓塞法處死實驗兔，用1 ml無菌蒸餾水沖洗關節(jié)腔，收集關節(jié)液標本0.5 ml。按照檢測操作說明書，采用ELISA方法檢測關節(jié)液中IL-1β含量，檢測關節(jié)液中誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）活力，采用硝酸還原酶法檢測關節(jié)液中NO含量。（3）關節(jié)軟骨病理觀察。實驗兔處死后，切開受試膝關節(jié)顯露關節(jié)腔，用3 mm直徑的圓骨鑿于兔股骨內(nèi)髁關節(jié)處定點取材，深度達軟骨下骨，用10%中性甲醛溶液進行固定，經(jīng)水洗、脫水、脫鈣和常規(guī)石蠟包埋等操作后，進行軟骨表面垂直切片，逐步完成石蠟切片制備及染色步驟，并對標本進行染色評分觀察。觀察軟骨表面組織結構、細胞數(shù)量、潮線完整性及基質(zhì)失染情況。參考 Mankin's評分標準進行評分［7］，評估關節(jié)軟骨退變程度。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件處理分析數(shù)據(jù)，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用析因設計方差分析，采用levene檢驗進行方差齊性檢驗，采用單因素方差分析的LSD及Dunnett分析法進行五組數(shù)據(jù)間兩兩比較。取P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膝關節(jié)活動度比較經(jīng)方差齊性檢驗，levene統(tǒng)計量為0.288，P=0.883＞0.05，故五組數(shù)據(jù)方差齊性。采用單因素方差分析LSD法進行五組數(shù)據(jù)的兩兩比較?？瞻捉M膝關節(jié)活動度為（146.00±7.64）°，模型組為（123.50±8.55）°，GH 組為（128.00±8.44）°，PIPM組為 （132.50±10.21）°，PIPM+GH 組為 （133.60±11.95）°。其中，模型組、GH 組、PIPM 組與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組與PIPM+GH組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

GH與PIPM聯(lián)合對膝關節(jié)活動度的影響詳見表 1。 其中總的校正模型 F=3.74，P=0.028＜0.05，有統(tǒng)計學意義。GH組與PIPM組沒有統(tǒng)計學意義，但GH組與PIPM組間的交互作用有統(tǒng)計學意義。

2.2 關節(jié)液中IL-1β、iNOS和NO的含量比較經(jīng)方差齊性檢驗，IL-1β含量levene統(tǒng)計量為1.302，P=0.296＞0.05，故五組數(shù)據(jù)方差齊性；關節(jié)液iNOS活力levene統(tǒng)計量為2.920，P=0.041＜0.05，方差不齊；關節(jié)液 NO含量 levene統(tǒng)計量為 5.694，P=0.002＜0.05，方差不齊。采用單因素方差分析Dunnett法進行五組數(shù)據(jù)的兩兩比較（表2、3）。（1）關節(jié)液中IL-1β 含量。 總的校正模型 F=3.377，P=0.039＜0.05，有統(tǒng)計學意義。GH組與PIPM組沒有統(tǒng)計學意義，但GH組與PIPM組間的交互作用有統(tǒng)計學意義。（2）關節(jié)液 iNOS活力?？偟男ＵＰ?F=55.41，P=0.000＜0.05，有統(tǒng)計學意義。PIPM組沒有統(tǒng)計學意義，但GH組與PIPM組間的交互作用有統(tǒng)計學意義。（3）關節(jié)液NO含量?？偟男ＵＰ虵=300.97，P=0.000＜0.05，有統(tǒng)計學意義。PIPM組沒有統(tǒng)計學意義，但GH組與PIPM組間的交互作用有統(tǒng)計學意義。

表1 GH與PIPM聯(lián)合對膝關節(jié)活動度的影響

表2 關節(jié)液中IL-1β、iNOS和NO的比較

表3 GH與PIPM聯(lián)合對關節(jié)液中IL-1β、iNOS和NO的影響

2.3 膝關節(jié)軟骨病理觀察空白組：軟骨表面整齊平滑，分層清楚，細胞排列規(guī)則，數(shù)量正常，潮線完整（圖1）；模型組：軟骨表面有缺損，有裂隙伸入其下，分層不清楚，細胞局灶或彌漫性增生，結構不規(guī)則，鈣化層明顯增厚，潮線模糊有血管穿過（圖2）；GH組：各層結構逐漸好于模型組，分層尚清楚，呈輕中度增生，潮線為多層次（圖3）；PIPM組：各層結構與GH組基本相同，情況略好（圖4）；PIPM+GH組：軟骨表面整齊平滑，分層清楚，排列整齊，細胞結構規(guī)則，潮線近乎完整（圖5）。

圖1～圖5見封三。

經(jīng)方差齊性檢驗，levene統(tǒng)計量為49.666，P=0.000＜0.05，故五組數(shù)據(jù)方差不齊。采用單因素方差分析Dunnett法進行五組數(shù)據(jù)的兩兩比較。

軟骨光鏡觀察評分：空白組為（0.33±0.52）分，模型組為（9.33±1.75）分，GH 組為（5.33±0.82）分，PIPM組為 （5.17±1.47） 分，PIPM+GH 組為 （2.83±0.75）分。模型組、GH 組、PIPM 組、PIPM+GH 組與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組、GH組、PIPM組、PIPM+GH組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？瞻捉M、模型組、PIPM+GH組與GH組比較，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）?？瞻捉M、模型組與PIPM組比較，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。空白組、模型組、GH組與PIPM+GH組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

GH與PIPM聯(lián)合對軟骨光鏡觀察評分的影響見表 4。 總的校正模型 F=3.735，P=0.028＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。GH組與PIPM組沒有統(tǒng)計學意義，但GH組與PIPM組間的交互作用有統(tǒng)計學意義。

表4 GH與PIPM聯(lián)合對軟骨光鏡觀察評分的影響

3 討論

KOA動物模型主要有自發(fā)型、誘導型、基因敲除型，改良Hulth法為通過手術方法建立誘導模型，是在傳統(tǒng)Hulth法的基礎上進行改良，可快速、穩(wěn)定造模，產(chǎn)生與人類膝關節(jié)退變相似的病理生理改變，具有創(chuàng)傷較小、穩(wěn)定及重復性好的特點［8］。

OA的病理過程中細胞因子和炎癥因子發(fā)揮著重要作用［9］，軟骨降解與細胞因子表達異常有關，其中 IL-1β 及 NO 作用尤為明顯［10，11］。 IL-1β 是被證實的首要相關致病細胞因子，可由軟骨細胞、破骨細胞等分泌，能使基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metallo proteinase-13，MMP-13）、3mRNA 基因在軟骨細胞中的表達增強，抑制Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達，促進Ⅱ型膠原和軟骨基質(zhì)的降解和關節(jié)軟骨的破壞［12］。IL-1β在KOA關節(jié)滑液中呈高水平表達，并與關節(jié)軟骨損傷呈正相關，其等因子的大量釋放是加重KOA病情的主要原因，能作為嚴重情況的預測指標，有重要的診斷和評價意義［13］，KOA活躍期時IL-1β呈高表達狀態(tài)，治愈后表達回落［14］。

iNOS與OA發(fā)生發(fā)展緊密相關，已被證實能促進KOA的臨床和病理進展，能催化L-精氨酸與氧氣（O2）產(chǎn)生NO。骨關節(jié)中NO主要由iNOS合成，其活力大小可通過測量NO合成量多少來確定。iNOS可被IL-1β等細胞因子激活，從而產(chǎn)生大量的 NO。 Kühn和 Lotz等［15］將 iNOS基因轉(zhuǎn)入軟骨細胞，使之產(chǎn)生大量的NO，從而抑制軟骨基質(zhì)蛋白多糖合成，加快蛋白聚糖及膠原蛋白的降解，導致骨關節(jié)炎的發(fā)生。

NO是一種新的免疫分子和炎癥介質(zhì)，主要有信使傳導和細胞毒性因子的功能。其細胞毒性因子功能對微生物細菌、真菌和腫瘤細胞具有殺傷作用，對正常組織也能產(chǎn)生損傷效果。KOA關節(jié)液中NO的產(chǎn)生主要來源于關節(jié)軟骨細胞和滑膜細胞，關節(jié)中增加的炎性因子刺激軟骨和滑膜細胞iNOS的表達，產(chǎn)生NO。NO能抑制蛋白多糖和膠原蛋白的合成，促進軟骨細胞凋亡，并刺激細胞金屬蛋白酶（MMP）的啟動和產(chǎn)生，介導IL-1β等細胞因子的病理作用，促進KOA軟骨細胞的凋亡，進而參與調(diào)節(jié)骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展［16］。大量研究表明，降低 NO的水平可抑制軟骨細胞的破壞，延遲骨關節(jié)炎的進展，促進破壞軟骨的修復［17］。

KOA 屬于中醫(yī)學的“痹證”“骨痹”“膝痹”范疇［18］。關節(jié)軟骨退變導致關節(jié)正常功能及再生修復過程受損［19］。手法治療KOA是中醫(yī)特色療法，大量實驗及臨床研究有力證實，手法緩解癥狀明顯，利于關節(jié)功能改善［20］，手法推拿能改善微循環(huán)和肌力、促進關節(jié)液和水腫吸收，改善代謝和關節(jié)功能［21］。戴七一等運用揉髕手法治療兔KOA模型，發(fā)現(xiàn)有松解髕周粘連、緩解肌肉緊張，改善膝周循環(huán)，降低關節(jié)內(nèi)壓及營養(yǎng)軟骨的作用［22］。而髕骨內(nèi)推作為有效的手法治療，安全無創(chuàng)，手法簡單，易于掌握［23］，能起到溫經(jīng)散寒活血、舒筋通絡鎮(zhèn)痛、滑利營養(yǎng)關節(jié)的功效［24］，其療效肯定，可作為 KOA的常規(guī)康復治療［25］。

該研究發(fā)現(xiàn)，兔KOA模型關節(jié)液中IL-1β、iNOS和NO的含量較正常兔增加，提示IL-1β、iNOS和NO為KOA的相關致病炎性因子，加劇關節(jié)軟骨損傷和退變；PIPM可以明顯降低關節(jié)液中IL-1β、iNOS和NO含量，減少細胞炎癥因子釋放，促進關節(jié)軟骨和滑膜損傷的修復，延緩關節(jié)軟骨的退變，這可能是PIPM治療KOA有效機制之一；PIPM與GH對KOA均具有良好的治療作用，且兩者治療效果沒有明顯差異（P＞0.05）；而PIPM與GH聯(lián)合治療較兩者單獨運用效果更好。這與李明哲研究結論相似，手法結合藥物治療能有效抗炎鎮(zhèn)痛、抑制軟骨破壞、平衡軟骨代謝，從而起到治療KOA的作用［26］。

KOA是由復雜病因作用的結果，動物實驗依然無法模擬疾病自然慢性退變的過程，故該研究也有一定的局限性。同時，觀測關節(jié)液中IL-1β、iNOS和NO含量，不能全面反映KOA發(fā)生和演變的過程，僅能從部分細胞因子的變化來探究PIPM治療KOA的作用機制；此外，要想系統(tǒng)全面研究KOA的病理生理變化以及PIPM的有效機制，需要結合生物學、生物力學、代謝和基因組學等方面進行大樣本多中心動物實驗及臨床研究，以取得進一步成果。