翟 鑫，馮柏娥，張雪靜，劉朝軍

凝固酶陰性葡萄球菌(coagulasenegativestaphylococcus，CNS)屬于革蘭陽性葡萄球菌，通常被認(rèn)為人體正常菌群，但隨著廣譜抗生素廣泛使用，各種插管和支架患者的增多,化療、放療、激素和免疫抑制劑的大量使用，以及惡性腫瘤治療等因素導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，臨床感染率逐漸增高，已經(jīng)成為臨床院內(nèi)感染最重要的潛在病原菌[1]。

目前對(duì)于CNS的鑒定，主要通過表型鑒定，通過分析病原菌的生化反應(yīng)特性區(qū)分，如VITEK2 GP和BD試劑盒，對(duì)于一些不典型菌株和少見菌株，該系統(tǒng)往往無法加以準(zhǔn)確區(qū)分[2]。而一些基于PCR擴(kuò)增的分子學(xué)方法已得到廣泛應(yīng)用，目前微生物分子鑒定主要通過16S rDNA基因方法，研究顯示這些基因方法要明顯優(yōu)于表型方法[3]，但在區(qū)分CNS具體種屬上，GenBank基因庫比對(duì)往往會(huì)出現(xiàn)基因相似率過高的情況。有研究表明gap基因能夠準(zhǔn)確的鑒定CNS,gap基因是一種編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄蛋白，存在于葡萄球菌細(xì)胞壁中，可以用于CNS的快速分子鑒定[4]。本研究收集臨床常見CNS，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定方法進(jìn)行鑒定，并與gap基因鑒定進(jìn)行比較，以便建立對(duì)CNS的快速分子鑒定，為臨床提供快速和準(zhǔn)確診斷。

1 材料與方法

1.1 菌種來源 收集中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心2016年1月—2017年12月臨床分離的CNS,分別為腐生葡萄球菌、路鄧葡萄球菌、人葡萄球菌、人葡萄球菌人亞種、產(chǎn)色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、雞葡萄球菌、溶血葡萄球菌、木糖葡萄球菌、科氏葡萄球菌解脲亞種、沃氏葡萄球菌、中間葡萄球菌、解糖葡萄球菌、緩慢葡萄球菌和松鼠葡萄球菌。標(biāo)準(zhǔn)菌株為表皮葡萄球菌ATCC12228，實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)過表型方法API20 Staph和VITEK2 GP確認(rèn)鑒定。

1.2 DNA提取 采用煮沸裂解法，提取目的DNA[4]。

1.3 PCR擴(kuò)增 Gap基因上游序列5′-ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA-3′，下游序列5′-GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG-3′，擴(kuò)增片段大小931 bp[5]。反應(yīng)體系50 μL：10×Buffer(包含MgCl2)5.0 μL,dNTPS(2.5 mol/L)4 μL，Primer(10 μmol/L混合)2 μL，Tag酶0.25 μL(日本TaKaRa公司)，雙蒸水30 μL，DNA模板8 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃加熱2 min后，40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳獲取目的條帶，留取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.4 生物信息分析 獲得的gap基因原始序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫上傳比對(duì)，分別進(jìn)行多序列比對(duì)分析和進(jìn)化樹同源分析，最終結(jié)果采用自舉檢驗(yàn)(Bootstraping)進(jìn)行可信度統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定采用VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)，嚴(yán)格按照操作手冊進(jìn)行操作獲取質(zhì)量圖譜，并通過VITEK MS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，從而獲得鑒定結(jié)果，定標(biāo)菌株為大腸埃希菌ATCC8739。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)，進(jìn)化樹分析采用MEGA4.O軟件，統(tǒng)計(jì)分析采用自舉檢驗(yàn)(Bootstraping)和UPGMA法。

2 結(jié) 果

2.1 gap基因序列分析 Gap基因擴(kuò)增獲得目的條帶，純化后進(jìn)行序列測定，獲得序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)。序列矩陣分析顯示各種細(xì)菌序列比對(duì)有較大差異(39%～98%)，未出現(xiàn)序列比對(duì)大于99%相似率，gap基因分析能完全區(qū)分CNS，表1。

表1 16種CNS gap基因矩陣比對(duì)分析

2.2 基因進(jìn)化樹同源分析 Gap基因矩陣分析顯示有足夠序列差異，同時(shí)采用UPGMA算法構(gòu)建CNS進(jìn)化樹，同源分析顯示除路鄧葡萄球菌和溶血葡萄球菌可信度較低外(77%)，其他菌種統(tǒng)計(jì)可信度分析都在90%以上，進(jìn)化樹統(tǒng)計(jì)算法都比較可信，相近菌種兩兩比較可信度分析甚至達(dá)到98%以上，圖1。

2.3 MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 16種CNS得出清晰的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖，如表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖(圖2)。與梅利埃已有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，每種細(xì)菌鑒定率都大于99%以上，與gap基因鑒定的細(xì)菌種類完全符合(符合率100%)。

圖1 gap基因UPGMA法系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

圖2 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖

3 討論

CNS致臨床感染病例日益增多，受到臨床重視，實(shí)驗(yàn)室對(duì)CNS的鑒定主要通過表型的方法，但有些臨床菌株不能被準(zhǔn)確鑒定到種，需要通過分子學(xué)的方法。目前細(xì)菌鑒定常采用16S rRNA基因方法[6-7]，但文獻(xiàn)研究顯示，由于葡萄球菌16S rRNA序列幾乎完全相同，不能用于葡萄球菌菌屬的分類鑒定[8]；而研究顯示gap基因能夠?qū)ζ咸亚蚓鷮龠M(jìn)行區(qū)分，特別是對(duì)相近的CNS進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[4，9]。本研究對(duì)gap基因序列分析顯示，16種CNS序列相似率為39%～98%，相似率最高人葡萄球菌和人葡萄球菌亞種(98%)，低于文獻(xiàn)常見報(bào)道的99%判斷標(biāo)準(zhǔn)[10-11],有足夠序列差異區(qū)分CNS；而gap基因序列同源分析顯示，16種CNS分析具有較高的可信度(大于77%)，因此通過gap基因序列分析，能夠?qū)NS種類進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

近年來，隨著科技的發(fā)展，越來越多的診斷技術(shù)應(yīng)用到細(xì)菌的鑒定，MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)就是其中之一。MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，與表型和分子鑒定相比，VITEK MS的MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)具有如下特點(diǎn)：①自動(dòng)化、快速和高通量，平均每分鐘完成1～2個(gè)菌株鑒定；②成本低廉，鑒定耗材成本低于傳統(tǒng)鑒定板條；③鑒定范圍涵蓋廣，可以對(duì)臨床常見病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。目前已有文獻(xiàn)對(duì)MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定中應(yīng)用進(jìn)行研究，該方法已經(jīng)逐步應(yīng)用于臨床，要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)表型鑒定，在CNS鑒定過程中，具有快速、準(zhǔn)確和價(jià)廉等特點(diǎn)[12-16]，我們在對(duì)16種CNS分子鑒定的基礎(chǔ)上，分別對(duì)CNS進(jìn)行MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)該方法與gap基因鑒定方法具有100%的符合率，說明MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)在CNS鑒定中，比傳統(tǒng)方法和分子方法具有優(yōu)勢，可以用于CNS的快速和準(zhǔn)確鑒定。