李禹兵，高凌，羅登，葉迎春，周芬

阿爾茨海默病(AD)，俗稱老年性癡呆或認(rèn)知功能障礙，是老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,占所有癡呆患者的60%～70%[1]。AD的主要病理特點(diǎn)是腦內(nèi)Tau蛋白過度磷酸化及淀粉樣β(Aβ)沉積[2]。近年來，腸道菌群—腸—腦軸的研究越來越多，證據(jù)顯示腸道菌群、腸道和腦這三者是相互影響的。腸—腦軸紊亂與AD、帕金森病(PD)、抑郁、焦慮、腸綜合征、炎性腸病及多發(fā)性疾病(MS)有關(guān)。Bravo等[3]發(fā)現(xiàn)，喂養(yǎng)益生菌的小鼠表現(xiàn)出更少的焦慮樣和抑郁行為；另有研究發(fā)現(xiàn)，與特異性無病原體(SPF)小鼠比較，無菌(GF)小鼠在空間記憶和工作記憶方面表現(xiàn)出缺陷[4]。因此，腸道微生物組分的調(diào)節(jié)可作為AD的潛在治療靶點(diǎn)。目前，改變腸道菌群的方式很多，包括抗生素的干預(yù)、益生菌和糞便移植等，但效果不一。胃旁路手術(shù)(Roux-en-Y gastric bypass surgery，RYGB)也是其中的方式之一，研究表明胃旁路手術(shù)可導(dǎo)致胃腸道系統(tǒng)中的主要解剖重排，手術(shù)后發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)極大改變，其中擬桿菌的比例增加，變形菌和厚壁菌的比例下降[5]。故推測胃旁路手術(shù)可通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，經(jīng)腸道菌群—腸—腦軸途徑，進(jìn)而改善大腦的認(rèn)知功能，但目前尚缺乏依據(jù)。因此，現(xiàn)以APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠為AD模型，予以胃旁路手術(shù)干預(yù)，通過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)和Western-blot方法檢測海馬組織P-Tau(Ser396)和P-Tau(Thr231)蛋白的表達(dá)來研究胃旁路手術(shù)對(duì)APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠認(rèn)知功能的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí) APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠4只，購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室(The Jackson Laboratory)，在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)環(huán)境喂養(yǎng)繁殖。繁殖40只后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為AD模型組和AD胃旁路手術(shù)組；C57BL/6N正常小鼠(北京維通利華公司) 20只，亦分為WT正常對(duì)照組(normal)和WT正常胃旁路手術(shù) (RYGB) 組，總計(jì)4組，每組納入6只小鼠，小鼠均為雄性，6月齡。

1.1.2 試劑：腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑(雅培公司)，異氟烷(魯南貝特制藥有限公司)，DNA提取試劑盒[(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)公司]，APP引物(賽維爾生物公司)，Tau 引物(賽維爾生物公司)，PS1引物(武漢金開瑞生物工程公司)， GoldView Ⅰ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)，P-Tau (Ser396) 一抗、P-Tau(Thr231)一抗及內(nèi)參GAPDH一抗(碧云天生物技術(shù)有限公司)，RIPA總蛋白裂解液(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(AS1059，武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器設(shè)備：手術(shù)顯微鏡(PICO，卡爾蔡司管理有限公司),動(dòng)物麻醉呼吸機(jī)(ABL-2，上海玉研科學(xué)儀器公司)，顯微外科手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械廠)， Morris 水迷宮系統(tǒng)(smart3.0,深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(基因擴(kuò)增儀TC-XP,杭州博日科技公司)， 4 ℃ 高速離心機(jī) (TGL-16c,上海安亭科學(xué)儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)(734BR0262,美國伯樂公司)，掃描儀(LiDE110，佳能公司)，酶標(biāo)儀(DR-200Bs，濟(jì)南星暉生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2018年2月—2019年3月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因模型小鼠(AD模型小鼠)的基因鑒定：確認(rèn)購買的APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖的子代小鼠是否穩(wěn)定遺傳即造模是否成功，提高數(shù)據(jù)的可靠性?？紤]到手術(shù)的存活率，所以手術(shù)后再鑒定小鼠的基因型。取三轉(zhuǎn)基因小鼠尾巴0.4 cm，用DNA 提取試劑盒提取DNA，用PCR 擴(kuò)增儀同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為 377 bp的 APP 基因、227 bp 的PS1基因和254 bp的Tau基因。APP 基因的引物序列:上游 5'- AGGACTGACCACTCGACCAG -3'，下 游 5'- CGGGGGTCTAGTTCTGCAT -3'。PS1基因的引物序列：上游5'- TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3' ，下 游 5'- AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT -3'。Tau基因的引物序列：上游5'- TGAACCAGGATGGCTGAG -3' ，下 游 5'- TTGTCATCGCTTCCAGTCC -3'。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃(變性94 ℃ 30 s ，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán))2 min，終止延伸72℃ 2 min，4 ℃ 保存。PCR完成后予以 1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時(shí)間 45 min。經(jīng) PCR 擴(kuò)增，鑒定出 12只 APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠(AD模型組和AD胃旁路手術(shù)組，各6只)。

1.2.2 胃旁路手術(shù)(RYGB)方法：小鼠術(shù)前流質(zhì)飲食(腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑和水混合物)3 d。手術(shù)開始時(shí)，經(jīng)2%異氟烷+2%氧氣持續(xù)麻醉，固定，腹壁經(jīng)剃毛后，用75%酒精消毒皮膚，做腹部正中約4 cm的縱向切口，打開腹腔，暴露空腸和胃，將距離十二指腸懸韌帶2 cm處的空腸切斷，然后在距離空腸造口位置遠(yuǎn)端6 cm處的空腸側(cè)做縱向切口，用10-0縫合線以連續(xù)縫合法將近端空腸與已做縱向切口行端—側(cè)吻合術(shù)，然后再用10-0縫合線以連續(xù)縫合法將遠(yuǎn)端空腸與胃袋進(jìn)行端—端吻合術(shù)。在胃與空腸的吻合口旁，用醫(yī)用鈦夾夾緊胃體，阻斷胃內(nèi)容物的通過，相當(dāng)于胃大部分切除。最后關(guān)閉腹壁時(shí)，肌肉層和皮膚均用5-0縫合線以連續(xù)縫合法縫合封閉腹腔。手術(shù)過程中暴露胃和腸道使用無菌濕潤紗布進(jìn)行保護(hù)，同時(shí)在無菌和恒溫條件下進(jìn)行手術(shù)(見圖1)。術(shù)后繼續(xù)流質(zhì)飲食7 d后改為正常飲食，此手術(shù)方法小鼠的存活率可達(dá)90%以上。

圖1 胃旁路手術(shù)方式

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 小鼠的認(rèn)知功能測定：Morris 水迷宮檢測各組小鼠的認(rèn)知功能。胃旁路手術(shù)2個(gè)月后，各組小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris 水迷宮有4個(gè)象限，是半徑為60 cm的水池，平臺(tái)的半徑為4.5 cm，把平臺(tái)放在第2象限，用奶粉把水池內(nèi)的水溶解為白色，不透明，水平面超過平臺(tái)約 1.5 cm，池中水溫保持 20～ 23 ℃。開始實(shí)驗(yàn)前，把各組小鼠預(yù)先放在水迷宮實(shí)驗(yàn)室內(nèi)1 d，讓其熟悉和適應(yīng)環(huán)境。然后開始正式為期6 d的實(shí)驗(yàn)，前5 d行定位航行實(shí)驗(yàn)，第6天行空間探索實(shí)驗(yàn)，即第 1 ～ 5 天各組小鼠行定位航行實(shí)驗(yàn)(逃避潛伏期試驗(yàn))，每天每只小鼠分別從 4 個(gè)象限依次放入，即共訓(xùn)練4次，每次間隔時(shí)間為20 min，每次訓(xùn)練時(shí)間1 min，Smart軟件自動(dòng)計(jì)算小鼠 60 s內(nèi)到達(dá)平臺(tái)所需要的時(shí)間，即逃避潛伏期，假如 60 s 時(shí)未到達(dá)平臺(tái)，則逃避潛伏期按60 s計(jì)算，然后把它放到平臺(tái)上，強(qiáng)行停留 10 s，讓其記憶水迷宮的空間位置，擦干后放回籠。假如60 s內(nèi)到達(dá)平臺(tái)，且在平臺(tái)停留>10 s，則按到達(dá)的時(shí)間計(jì)算，否則按60 s計(jì)算。每只小鼠每天的逃避潛伏期為每天4次訓(xùn)練的平均時(shí)間。第6天各組小鼠均進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)(穿越平臺(tái)次數(shù)試驗(yàn)):取出平臺(tái)，將小鼠從遠(yuǎn)離平臺(tái)的一個(gè)象限放入水中，Smart軟件自動(dòng)計(jì)算在 1 min 內(nèi)每只小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)。其軟件還記錄了每只小鼠在定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)軌跡圖。采用GraphPad Prism 6.07繪圖軟件作圖。

1.3.2 小鼠海馬區(qū)P-Tau(Ser396)和P-Tau(Thr231)蛋白表達(dá)檢測：采用Western-blot法檢測各組小鼠左側(cè)海馬區(qū)P-Tau(Ser396)和P-Tau(Thr231)蛋白的表達(dá)。取每組6只小鼠左側(cè)的海馬組織90 mg加入RIPA裂解液1 ml，研磨后靜置30 min，4℃、1 200 r/min離心16 min，取上清液；按1∶4的比例加5xSDS-PAGE 的蛋白上樣緩沖液，95～100 ℃水浴9 min，徹底使蛋白變性。SDS-PAGE電泳1.5～2.0 h，轉(zhuǎn)膜1.5 h，洗3次膜，每次約10 min，用5%脫脂奶粉封閉1 h。然后分別加入對(duì)應(yīng)的一抗搖動(dòng)于4℃冰箱過夜。次日于室溫加入二抗孵育1 h,洗4次膜，每次10 min,滴加ECL混合溶液于膜蛋白正面，于暗室里曝光、顯影和定影；最后掃描膠片，AlphaEase FC軟件分析目的蛋白的灰度值。以各目的蛋白與GAPDH蛋白的比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠的基因鑒定 AD模型組和AD胃旁路手術(shù)組的小鼠均攜帶APP、PS1及Tau 3種基因，即為APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠，造模成功。見圖2～4。

注：A.AD模型組；B.AD胃旁路手術(shù)組

注：A.AD模型組；B.AD胃旁路手術(shù)組

注：A.AD模型組；B.AD胃旁路手術(shù)組

2.2 各組小鼠逃避潛伏期比較 與WT正常對(duì)照組比較，AD模型組逃避潛伏期延長(P<0.01),說明AD模型成功;與 AD模型組比較，AD胃旁路手術(shù)組逃避潛伏期縮短(P<0.01)，而與WT正常對(duì)照組比較，AD胃旁路手術(shù)組逃避潛伏期延長(P<0.05)，說明AD胃旁路手術(shù)組認(rèn)知功能有明顯改善，但弱于WT正常對(duì)照組；與WT胃旁路手術(shù)組比較，AD胃旁路手術(shù)組逃避潛伏期變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與WT正常對(duì)照組比較，WT胃旁路手術(shù)組逃避潛伏期延長(P<0.05)，而與AD模型組比較，WT胃旁路手術(shù)組逃避潛伏期縮短(P<0.01)，說明胃旁路手術(shù)對(duì)正常小鼠的認(rèn)知功能有損害作用，但嚴(yán)重程度弱于AD模型組，見表1。相對(duì)于其余3組，AD模型組小鼠趨向于沿著墻壁游走，遠(yuǎn)離平臺(tái)，說明逃避危險(xiǎn)的能力或探索能力較差，見圖5。

2.3 各組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較 與AD模型組(1.17±1.33)次/min比較，AD胃旁路手術(shù)組穿越平臺(tái)(3.50±1.05)次/min 增加(t=3.376，P=0.007)；與AD胃旁路手術(shù)組比較， WT正常對(duì)照組(5.67±1.03)次/min增加(t=3.606,P=0.005)，WT胃旁路手術(shù)組(3.22±2.05)次/min變化不大(t=0.304,P=0.766)；與WT正常對(duì)照組比較，WT胃旁路手術(shù)組穿越平臺(tái)次數(shù)減少(t=2.682P=0.019)，見圖6、7。

注：與AD模型組比較，aP<0.05；與WT胃旁路手術(shù)組比較，bP<0.05

表1 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的比較

注：與WT正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與AD模型組比較，bP均<0.01

圖5 各組小鼠的定位航行實(shí)驗(yàn)活動(dòng)軌跡圖

圖7 各組小鼠的空間探索實(shí)驗(yàn)活動(dòng)軌跡圖

2.4 各組小鼠Tau蛋白磷酸化水平的比較 與WT正常對(duì)照組比較，AD模型組、AD胃旁路手術(shù)組和WT胃旁路手術(shù)組 Tau蛋白磷酸化水平均升高；與 AD模型組比較，AD胃旁路手術(shù)組和WT胃旁路手術(shù)組Tau蛋白磷酸化水平均明顯降低(F=5.748，P=0.000 )。 與AD胃旁路手術(shù)組比較，WT胃旁路手術(shù)組Tau蛋白磷酸化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.051,P=0.964)，見圖8、9。

圖8 Western-blot 檢測各組P-Tau(Ser396)和P-Tau(Thr231)蛋白表達(dá)量

3 討 論

阿爾茨海默病(AD)是世界上引起老年性癡呆的主要原因，是一種慢性、易發(fā)性疾病，以認(rèn)知功能缺陷和進(jìn)行性記憶喪失為特征的慢性神經(jīng)退行性疾病。老年人(>65歲)AD患病率10%～30%，發(fā)病率1%～3%[1]。近年來，由于社會(huì)生活條件的不斷提高，肥胖和糖尿病的發(fā)病率也逐漸升高，研究發(fā)現(xiàn) T2DM患癡呆癥的風(fēng)險(xiǎn)增加1.5～2.5倍[6-7]，阿爾茨海默病不僅極大影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)帶來極大社會(huì)和家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前批準(zhǔn)用于AD的藥物只是改善患者的癥狀，而不改變疾病的進(jìn)展，阻滯這種疾病發(fā)展的臨床試驗(yàn)幾乎都以失敗告終。因此，需要重新思考對(duì)AD的治療策略，而胃旁路手術(shù)或許可以作為治療AD的新方法。其主要作用機(jī)制：胃旁路手術(shù)通過調(diào)節(jié)腸道菌群，釋放多種腦腸肽，通過血腦屏障，對(duì)大腦認(rèn)知功能產(chǎn)生影響，即腸道菌群—腸—腦軸理論，而腦腸肽在其中起著中介作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)與胃腸道密切相關(guān)，腸腦之間的通信是雙向的，大腦和腸道可以通過多種途徑連接起來，包括腸道菌群的代謝產(chǎn)物、免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)通路等[8]。最近的研究表明，腸道菌群的紊亂可以影響正常的大腦功能，導(dǎo)致焦慮、抑郁和認(rèn)知功能障礙[9]。當(dāng)特定無病原體(SPF)Swiss小鼠的微生物被轉(zhuǎn)移到無菌BALB/c小鼠的身體時(shí)，無菌BALB/c小鼠的探索行為增加；然而，當(dāng)特定無病原體(SPF) BALB/c小鼠的微生物轉(zhuǎn)移到無菌Swiss小鼠體內(nèi)時(shí)，無菌Swiss小鼠的探索行為明顯低于正常Swiss小鼠[10]。另外，研究表明糞便移植(FMT)不僅可以改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能，還可以延緩衰老和降低腦組織 Aβ 沉積，這與改善腸道菌群紊亂有關(guān)[11]。

研究表明胃旁路手術(shù)后腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生極大改變，而腸道菌群的改變可影響各種腦腸肽的分泌，如GLP-1。另外，胃旁路手術(shù)后，餐后胃排空增加，營養(yǎng)物質(zhì)更快地輸送到遠(yuǎn)端腸道，刺激腸道內(nèi)分泌細(xì)胞釋放膽囊收縮素(CCK)，胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、生長激素釋放肽(ghrelin)和胃腸激素肽(PYY)等腦腸肽[12-13]。大量的研究表明學(xué)習(xí)和記憶功能與腦腸肽關(guān)系密切，如膽囊收縮素對(duì)認(rèn)知功能具有改善效果，并且其激動(dòng)劑可改善大鼠的認(rèn)知功能，其拮抗劑則效果相反[14]。GLP-1受體(GLP-1R)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1R 基因敲除小鼠表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)和記憶受損[15]。臨床前試驗(yàn)已證明GLP-1具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，包括抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元增殖和分化，能改善學(xué)習(xí)和記憶功能。另外，研究還發(fā)現(xiàn)ghrelin抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)情緒具有調(diào)節(jié)作用、并能改善抑郁動(dòng)物的行為和阿爾茨海默病動(dòng)物模型的認(rèn)知功能[16-17]。因此，胃旁路手術(shù)可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群—腸—腦軸功能改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能。相對(duì)于單一的腦腸肽改善認(rèn)知功能的效果，如GLP-1激動(dòng)劑，胃旁路手術(shù)產(chǎn)生的多種腦腸肽的協(xié)同作用，對(duì)認(rèn)知功能障礙的治療效果可能要更為顯著。

注：與WT正常對(duì)照組比較，aP<0.05，與AD胃旁路手術(shù)組比較，bP<0.05

根據(jù)上述理論依據(jù)，本研究對(duì)APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠(AD模型小鼠)進(jìn)行胃旁路手術(shù)，希望可以通過這種方式改善AD模型小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，分泌多種腦腸肽，進(jìn)而通過腦—腸軸影響AD模型小鼠的認(rèn)知功能。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠逃避潛伏期明顯延長且穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，相對(duì)于AD模型組，AD胃旁路手術(shù)組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，表明其認(rèn)知功能極大提高。研究已表明認(rèn)知功能的改善與Tau蛋白磷酸化水平降低密切相關(guān)，上述Western-blot 檢測結(jié)果顯示，AD模型胃旁路手術(shù)組小鼠Tau蛋白磷酸化水平較AD模型組明顯降低，表明胃旁路手術(shù)能改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能。通過上述腸道菌群—腸—腦軸理論分析，推測腦腸肽可能通過相關(guān)受體通路降低海馬Tau蛋白磷酸化水平，而胃旁路手術(shù)可引起多種腦腸肽的分泌，從而間接降低海馬Tau蛋白磷酸化水平，改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能。但與WT正常對(duì)照組比較，WT胃旁路手術(shù)組的認(rèn)知功能卻下降，這可能與胃旁路手術(shù)破壞正常的腸道菌群結(jié)構(gòu)引起腦腸肽分泌減少有關(guān)，說明胃旁路手術(shù)對(duì)胃腸道可能存在雙重作用，具體機(jī)制暫不清楚，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，對(duì)APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠(AD模型小鼠)進(jìn)行胃旁路手術(shù)能改善其認(rèn)知功能，其作用機(jī)制可能是胃旁路手術(shù)通過改善腸道菌群紊亂，進(jìn)而釋放多種腦腸肽，通過腦—腸軸調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化水平以改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

李禹兵：課題設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文撰寫，論文修改；高凌：提出研究思路，論文審核；羅登：論文修改；葉迎春：分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)；周芬：資料搜集整理