李敏，郭毅飛，龔麗，李雪鋒

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以多臟器功能損害為主要臨床特征的全身性、慢性、炎性結締組織疾病，常伴有皮膚、腎臟、血液系統(tǒng)、肺和心臟等受累，約70% SLE患者合并狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)，引起較高病死率。臨床中若能早期診斷及治療LN，可能對增加病情緩解幾率和改善遠期預后有幫助[1]。低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是一種異二聚體轉錄因子，廣泛存在于哺乳動物和人體細胞中，可在T細胞中表達，低氧或炎性因子刺激均可促進其表達增加，它本身也可激活免疫細胞，驅動炎性反應，參與自身免疫性疾病、感染以及腫瘤等疾病的發(fā)生[2]。生長轉化因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是多功能肽家族的一員，是一種與腎纖維化相關的因子，較多研究證實TGF-β1高表達常參與LN患者腎間質系膜和基質增生，導致病情活動[3]。國內外關于HIF-1α在LN患者中表達情況的研究鮮有報道，現比較LN患者及健康對照人群尿液HIF-1α和TGF-β1水平的差異，分析HIF-1α、TGF-β1與LN疾病活動的關系及其可能的病理生理學機制，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2014年6月—2016年10月在十堰市太和醫(yī)院內分泌風濕病科收治的LN患者52例和健康體檢者40例作為研究對象，LN患者均經腎組織活檢確診。納入標準：LN患者均符合美國風濕病學會(ACR)制定的LN分類標準[4]。排除標準：慢性腎臟病(CKD)4期以上及需要透析的LN患者；合并其他原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病者；嚴重心、肝、腦及其他嚴重遺傳疾病者；合并嚴重感染患者；妊娠及哺乳期患者和合并精神疾病患者。根據文獻報道，以狼瘡疾病活動指數(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[4]對患者活動度進行評分作為狼瘡活動分組依據：SLEDAI≥8分者33例作為活動期組，SLEDAI<8分者19例作為非活動期組?；顒悠诮M男5例，女28例，年齡22～48(33.1±13.7)歲；病理診斷：Ⅲ型10例(30.3%)，Ⅳ型12例(36.3%)，Ⅲ+Ⅴ型5例(15.2%)，Ⅳ+Ⅴ型3例(9.1%)，Ⅴ型3例(9.1%)。非活動期組男3例，女16例，年齡20～47(30.2±14.5)歲；病理診斷：Ⅱ型16例(84.2%)，Ⅰ型3例(15.8%)。2組臨床資料見表1。健康對照組均為同期于醫(yī)院健康體檢中心經篩查的健康體檢者40例，男7例，女33例，年齡21～47(31.8±15.2)歲；血常規(guī)、肝腎功能、hs-CRP、ESR均正常，心電圖、心臟彩色超聲均正常；并排除結締組織疾病、高血壓、冠心病、肺部疾病、糖尿病、慢性腎炎、合并腫瘤和精神疾病患者。

1.2 腎臟病理學資料 按2003年國際腎臟病學會(ISN)和腎臟病理學會(RPS)制定的LN病理組織學分類標準[5]分為Ⅰ～Ⅵ型：Ⅰ型為正常或微小病變型腎小球腎炎，Ⅱ型為系膜增殖型腎小球腎炎，Ⅲ型為局灶節(jié)段增殖型腎小球腎炎，Ⅳ型為彌漫增殖型腎小球腎炎，Ⅴ型為膜性腎病型，Ⅵ型為腎小球硬化型腎小球腎炎。此分類標準，主要用于判斷LN總體預后，不能完全反映早期腎臟病理損害的炎性反應程度。在此病理學分類基礎上，參照Imran等[6]評分方法，進行狼瘡腎組織活動指數評分(AI評分)，主要參考6項指標：腎小球白細胞浸潤計數、毛細血管增生、腎間質炎性反應程度、細胞性新月體數、核碎裂纖維素沉積、微血栓形成或白金耳現象和腎小管壞死，各項0～3分，其中新月體數等部分項目0～6分，共計積分0～24分。狼瘡性腎炎AI評分是判斷其預后的金標準，AI>10分，提示病情重及預后不良，AI與臨床表現及嚴重程度關系密切，AI高者，腎功能受損的可能性較大。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 HIF-1α和TGF-β1檢測： 收集研究對象清晨中段尿(女性避開月經期)5 ml，離心提取上清液，采用ELISA雙抗夾心法測定HIF-1α和TGF-β1濃度，酶標儀由Benchmark公司生產，試劑盒均由北京普生瑞達生物技術有限公司提供，根據試劑盒說明書進行檢測操作。

1.3.2 相關實驗室指標檢測： LN患者入院次日、健康對照組體檢當日晨采集肘靜脈血5 ml，離心收取上層血清待測，利用免疫熒光法檢測抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)，免疫比濁法測定超敏C反應蛋白(hs-CRP)、24 h 尿蛋白定量、血清補體C3、C4濃度，魏氏法測定紅細胞沉降率(ESR)。

1.3.3 肺動脈壓檢測： 利用無創(chuàng)性心臟彩色多普勒檢查測定平均肺動脈壓力(mPAP)，由不知情且有豐富經驗的1名超聲科醫(yī)師檢測。

2 結 果

2.1 LN患者臨床資料比較 活動期組患者AI評分、SLEDAI評分、mPAH、ds-DNA、補體C3、hs-CRP和24 h尿蛋白定量水平均較非活動組明顯增高(P<0.05)，2組患者年齡、補體C4水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 尿液HIF-1α和TGF-β1水平比較 尿液HIF-1α、TGF-β1水平活動期組患者>非活動期組>健康對照組(P<0.05)， 見表2。

表2 3組尿液HIF-1α和TGF-β1水平比較

2.3 相關性分析

2.3.1 尿液HIF-1α及TGF-β1與臨床指標的單因素相關性分析： LN患者尿液HIF-1α與TGF-β1水平呈正相關性(r=0.534，P=0.021)。 HIF-1α與SLEDAI評分、mPAH、24 h尿蛋白量、ESR、hs-CRP、AI評分呈正相關(P均<0.05)；TGF-β1與SLEDAI評分、24 h尿蛋白定量及ds-DNA呈正相關性(P均<0.05)，與補體C3水平呈負相關性(P<0.05)，見表3。

表3 LN患者尿液HIF-1α、TGF-β1水平與一般臨床指標的相關性

2.3.2 LN患者尿液HIF-1α及TGF-β1水平與腎臟病理學的關系: LN患者尿液HIF-1α水平與腎臟病理AI評分呈正相關性(r=0.356，P=0.012)，TGF-β1與腎臟病理AI評分無相關性(r=0.042，P=0.213)。Kruskal-Wallis分析表明，尿液HIF-1α和TGF-β1水平在不同LN腎臟病理分型患者中差異無統(tǒng)計學意義。

2.3.3 多元逐步回歸分析: 以LN活動期患者AI評分作為模型因變量，以活動組與非活動組存在差異的指標HIF-1α、TGF-β1、AI評分、mPAH、ds-DNA、ESR、補體C3、hs-CRP和24 h尿蛋白定量為自變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果表明，尿液HIF-1α濃度、ds-DNA濃度和24 h尿蛋白定量是影響LN患者預后的獨立危險因素，見表4。

3 討 論

LN是SLE最嚴重的并發(fā)癥之一，回顧性臨床研究提示根據腎臟病理學檢查，幾乎所有的SLE患者在病程的不同階段均表現出不同程度的腎臟損害[7]。傳統(tǒng)觀點認為機體自身反應性淋巴細胞的激活和非自身抗原間平衡關系被打破，體液免疫亢進是導致LN發(fā)生的主要原因，但近年研究發(fā)現SLE的嚴重程度和病變范圍與致炎和抗炎細胞因子之間的平衡關系也較為密切[8]。24 h尿蛋白定量和尿殘渣分析常被作為評價LN腎損害程度粗略的標志物，但該指標缺乏特異性，容易受到發(fā)熱、尿路感染等其他SLE并發(fā)因素的影響，臨床中尚缺乏能準確反映不同病理類型LN損害程度、監(jiān)測病情活動和判斷預后的檢測指標。

表1 LN活動期組與非活動期組臨床資料比較

表4 影響LN患者預后的多因素Logistic回歸分析

HIF-1α是機體在低氧、炎性反應等特殊環(huán)境下產生的一種關于適應性細胞氧自穩(wěn)態(tài)調控因子，基礎研究表明HIF-1α在許多腎臟疾病中具有“雙刃劍”作用，一方面可加快細胞代謝，改善血流動力學，增強腎臟對缺氧的適應性，而起到保護腎臟的作用[9]。另一方面，HIF-1α及其相關性低氧狀態(tài)會誘發(fā)調節(jié)血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、結締組織生長因子(cTGF)和轉化生長因子(TGF)等的合成及分泌，導致腎小管上皮細胞的吸收和排泌障礙，誘導腎小球內皮細胞凋亡，促進腎間質纖維化[10]。Feng等[11]研究表明，HIF-1α的基因功能對 SLE 患者體內輔助性T細胞17/調節(jié)性T細胞(Th17/Treg)免疫平衡產生影響，血清HIF-1α水平的增高可能導致免疫耐受破壞，并對體內炎性細胞因子白介素-17(IL-17)的表達量產生影響，與SLE疾病活動密切關聯。目前國內尚無關于HIF-1α在LN患者中作用及作用機制的相關報道，本研究表明，LN患者尿液HIF-1α水平較正常人明顯增高，且LN活動期組患者尿液HIF-1α水平高于非活動期組，LN患者HIF-1α水平與mPAH、SLEDAI評分等多項疾病活動標志物呈正相關性，提示HIF-1α在反映SLE整體病情活躍中的預測作用。Logistic回歸分析結果則進一步確認了尿液HIF-1α濃度是影響LN患者疾病活動的獨立危險因素。

Ogura等[12]進行的動物研究表明HIF-1α對缺血導致腎損害鼠模型病理影響以腎間質損害為主，表現為腎小管擴張、間質水腫，炎性細胞浸潤及出現纖維化。其他研究發(fā)現，LN患者和MRL/lpr狼瘡腎炎模型小鼠腎小球和腎間質均有HIF-1α表達量的增加，并且病理檢查可見大量間充質細胞(MCs)浸潤，而經治療或HIF-1α阻斷劑(dimethyloxaloylglycine，DMOG)處理后，腎臟炎性反應活動可明顯減輕[13]。本研究表明LN患者HIF-1α水平與腎臟病理AI評分呈正相關性，且在以腎小球細胞增殖性改變和纖維素樣壞死為主要表現的Ⅲ型、Ⅵ型LN患者中有增高趨勢，與動物實驗的病理表現存在一定差異性。推測產生差異的原因可能為HIF-1α在不同哺乳動物腎臟的表達存在差異，對免疫功能的影響作用也不盡相同。此外，本研究LN患者腎功能異常者較少，腎臟損害程度并不十分嚴重，此種情況下腎小球濾出的HIF-1α可在近端腎小管部分被重吸收，不能完全反映出不同病理類型中其表達量的差異性。肺動脈高壓是反映SLE活動性及判斷預后的重要依據，肺動脈高壓與LN的發(fā)生有密切聯系[7]。本結果表明LN患者HIF-1α與mPAH呈正相關性。動物研究表明HIF-1α可通過上調VEGF和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，促進肺動脈內膜血管內皮細胞增殖，進而促進血管生成，加速缺氧性肺動脈高壓[14]。故而推測SLE患者體內HIF-1α的變化可能促進了SLE肺動脈高壓的形成，尚需更多的基礎與臨床研究證實。

TGF-β1為廣泛存在于人類和其他哺乳動物多功能肽超家族中的一員，人體內主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的表達，它們具有相似的生物學特性。TGF-β1是一種與纖維化關系密切的細胞因子，通常由巨噬細胞、成纖維細胞、間質細胞等多種細胞分泌，在組織纖維化中具有重要作用[15]。基礎研究表明腎小管液中高濃度TGF-β1能誘導單核細胞趨化因子(MCP-1)的表達，增加單核—巨噬細胞在腎組織中浸潤，并可通過促進細胞外膠原沉積，增加腎小管上皮細胞增殖與分化等多種生物學效應，導致腎小球炎性反應和腎臟間質纖維化[16]。石鑫岳等[17]通過對不同病理類型的LN患者尿液標志物進行檢測，結果發(fā)現在以系膜和基質增生為主要病理特點的系膜增生腎小球腎炎、膜性腎小球腎炎和新月體性腎小球腎炎的患者中尿液TGF-β1水平增加較為明顯。本項研究中，LN活動期患者尿液TGF-β1表達量明顯增加，與Susianti等[18]報道基本一致。LN患者尿液TGF-β1水平與AI評分、SLEDAI評分、24 h尿蛋白定量及ds-DNA等常見的SLE疾病活動度的臨床指標呈正相關性，而與補體C3水平呈負相關性，推測TGF-β1可能通過某些生物學作用，導致補體系統(tǒng)功能亢進，消耗大量補體C3，造成低補體血癥，誘發(fā)SLE疾病活動。此外，本研究發(fā)現LN患者尿液HIF-1α與TGF-β1濃度呈正相關性，并且HIF-1α與患者疾病活動呈顯著相關性，提示HIF-1α可能作為TGF-β1的一種調控因子，通過激活某些潛在信號通路介導TGF-β1的過度表達，加重SLE腎損害。但是，本研究LN患者HIF-1α與TGF-β1濃度并未在不同LN腎臟病理學AI評分及腎臟病理類型患者中表現出完全一致性變化，提示二者在LN中的作用非常復雜，而患者腎臟病理AI評分同樣也會受到SLE 長期病程中多種混雜因素的影響，該研究并不一定能夠完全反映LN部分患者潛在的疾病活動狀態(tài)。

總之，LN的發(fā)生是一個原因復雜、多因素共同參與的結果，本研究提示HIF-1α和TGF-β1水平的增加可能參與LN的發(fā)病，并且與疾病活動度關系密切，后續(xù)需通過前瞻性、更大樣本量的臨床研究提供更具說服力的判斷，通過深入了解二者在LN中的作用機制，尿液HIF-1α和TGF-β1的測定有可能成為LN病情檢測的重要指標，對LN的早期治療及尋找潛在的治療靶點具有重要意義。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

李敏：設計研究方案、實施研究過程及論文撰寫；郭毅飛、龔麗：資料收集；李雪鋒：論文審核